COME RICONOSCERE UNA SEQUENZA REGOLATORIA

Presentazione sul tema: "COME RICONOSCERE UNA SEQUENZA REGOLATORIA"— Transcript della presentazione:

1 COME RICONOSCERE UNA SEQUENZA REGOLATORIA
DI CIRCA 10 NUCLEOTIDI FRA I CHE COMPONGONO IL GENOMA UMANO?

2 RICONOSCONO I PROMOTORI?
LE RNA POLIMERASI COME RICONOSCONO I PROMOTORI? Transcribed region Promotore -contiene sequenze Specifiche per il legame della polimerasi

3 DEL PROMOTORE PROSSIMALE
FATTORI DI TRASCRIZIONE • FATTORI DI TRASCRIZIONE GENERALI (BASALI) - RICONOSCONO ELEMENTI “core promoter” • REGOLATORI SPECIFICI - ATTIVATORI - REPRESSORI Basal factor binding sites Transcribed region ELEMENTO ENHANCER ELEMENTO DEL PROMOTORE PROSSIMALE

4 Il legame promotore RNA polimerasi
richiede i fattori di trascrizione generali

5 Promotori ~200 bp gene

6 ATTIVITA’ 100% 100% 20% 1% 0% COME IDENTIFICARE ELEMENTI NEL PROMOTORE
Reporter gene eg CAT, luciferase 100% Reporter gene 20% Reporter gene 1% Reporter gene 0% Reporter gene

7 COME IDENTIFICARE ELEMENTI NEL PROMOTORE
ATTIVITA’ 100% Reporter gene eg CAT, luciferase 100% Reporter gene 400% Reporter gene 1% Reporter gene 0% Reporter gene

8 attivato basale Livello di trascrizione represso

9 Elementi del Core promoter
• siti di legame per I fattori di trascrizione generali Che supportano un livello di trascrizione basale La regolazione della trascrizione e’ ottenuta dalla Azione di fattori di trascrizione gene-specifici Transcribed region

10 6 bp elemento ricco in purine
RNAP II Inr DPE BRE TATA ~24bp TATA-box 8 bp elemento ricco in AT Bound by TFIID BRE 6 bp elemento ricco in purine Bound by TFIIB Inr DPE Bound by TFIID

11 TFIIF 2 subunits 2 subunits RNAP II TFIIA 2-3 subunits 12 subunits
TFIIE TFIIF 2 subunits 2 subunits RNAP II TFIIA TFIID 2-3 subunits 12 subunits 10 subunits TFIIB TFIIH 1 subunit ~40 polipeptidi 9 subunits

12 RNAP II Inr DPE TATA-box 8 bp AT lega TFIID BRE 6 bp lega TFIIB Inr

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16 TFIID TFIIF RNAP II ~24bp TATA BRE Inr DPE TFIIA TFIIB TFIIE TFIIH

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18 TFIID contiene la TATA-Box Binding Protein TBP TFIID

19 TFIID e’ composta da vari TBP Associated Factors
—TAFs -aiutano il posizionamento di TFIID riconoscendo L’elemento Inr -legano i fattori di trascrizione gene specifici -aiutano a decompattare la cromatina

20 TFIID ~24bp TATA BRE Inr DPE

21 TFIIA TFIID TFIIA -aumenta e stabilizza il legame di TBP al DNA
TATA BRE Inr DPE TFIIA -aumenta e stabilizza il legame di TBP al DNA -interagisce con vari attivatori gene specifici Aiutandoli a legarsi ai vari TAF

22 TFIIB TFIID TFIIA TFIIB -si lega a TBP e richiama la polimerasi
TATA BRE Inr DPE TFIIA TFIIB -si lega a TBP e richiama la polimerasi -Partecipa alla selezione del sito d’inizio e Stabilisce la direzione

23 TFIIF TFIIF TFIID TFIIA TFIIB RNAP II
~24bp TATA BRE Inr DPE TFIIA TFIIB Stabilizza il complesso di preinizio e induce Una torsione nel DNA

24 TFIIE TFIIF TFIID TFIIA TFIIB RNAP II
~24bp TATA BRE Inr DPE TFIIA TFIIB TFIIE Attira una elicasi ed insieme srotolano il Promotore. Stimola l’attivita’ chinasica di TFIIH

25 TFIIH TFIIF TFIID TFIIA TFIIB RNAP II TFIIH
~24bp TATA BRE Inr DPE TFIIA TFIIB TFIIE TFIIH Fosforila una delle subunita’ della polimerasi dando l’avvio alla trascrizione

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27 — REGOLATORI GENE SPECIFICI
Transcribed region SI LEGANO A SEQUENZE REGOLATORIE

28 Regolatori gene specifici
• hanno una struttura modulare • contengono un dominio che lega il DNA • contengono uno o piu’ domini di attivazione trascrizionale • qualche volta contengono uno o piu’ domini di repressione • qualche volta contengono un dominio di dimerizzazione

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33 (MADS box)

34 H O C N H Donatore Accettore

35 A D A M A A D M A D A D A A A A A D A A A A D A

36 Regolatori gene specifici
Contengono un dominio che lega il DNA E un dominio di attivazione trascrizionale Transcribed region

37 Gli Attivatori come influenzano la trascrizione di un gene distante molte migliaia di nucleotidi?
DNA loop

38 Enhancers- stimolano la trascrizione
Attivatori si legano ad un sito specifico Il DNA si ripiega

39 Enhancers- stimolano la trascrizione
Attivatori si legano ad un sito specifico Il DNA si ripiega Si forma il complesso nel promotore

40 Enhancers- stimolano la trascrizione
Attivatori si legano ad un sito specifico Il DNA si ripiega Si forma il complesso nel promotore Si lega la RNA polimerasi Inizio della trascrizione

41 Controllo combinatoriale dell’espressione genica

42 Con poche proteine regolatorie si possono controllare un elevato numero di geni
Diverse combinazioni producono fenotipi differenti

43 Heterodimerization of DNA binding proteins can alter
their sequence specificity

44 Enhancer e Repressori RNAP promotore enhancer gene 10-50,000 bp
repressore enhancer interagiscono con RNAP trascrizione repressore previene il legame dell’enhancer

45 Con poche proteine regolatorie si possono controllare un elevato numero di geni
Diverse combinazioni producono fenotipi differenti

46 Recettori nucleari Fattori di trascrizione regolati da molecole idrofobiche Cambio dell’attivita’ Cambio della localizzazione cellulare

47 Recettori nucleari Il legame del ligando causa cambiamenti conformazionali TBP TAF RNA pol II RGRACANNNTGTYCY

48 Nuclear Receptors Legame dell’ormone Dissociazione da hsp90 GR GR GR
TATA GR hsp90 GR GR Dissociazione da hsp90 GR hsp90 dimerizzazione Migrazione nel nucleo Legame al DNA

49 Regolazione mediante fosforilazione
Ormoni attivano una chinasi La chinasi fosforila un fattore di trascrizione Il fattore e’ attivato

50 Cascata delle chinasi GF si lega al recettore - protein tyrosine kinase Il recettore dimerizza Il complesso fosforila MEKK – (MAP kinase kinase kinase) MEKK P MEKK SEK SEK P MEKK fosforila SEK – una MAP kinase kinase JNK P JNK P SEK fosforila JNK – una MAP kinase

51 Cascata delle chinasi nucleo TRE
JNK attivata migra nel nucleo e fosforila il fattore di trascrizione C-JUN C-JUN dimerizza with C-FOS per formare AP-1 AP-1 attiva la trascrizione legandosi a –TGA(C/G)TCA- e interagendo con I fattori di trascrizione generali nucleo RNA pol II JNK P C-JUN P C-FOS P C-JUN TRE

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53 Metilazione del DNA La citosina puo’ essere metilata:
Risulta in una maggiore condensazione della cromatina La metilazione del DNA e’ coinvolta nell’inattivazione del cromosoma X

54 Trascrizione e struttura della cromatina
Il DNA nella cromatina condensata non e’ accessibile La cromatina condensata (eterocromatina) e’ trascrizionalmente silente La condensazione della cromatina dipende ANCHE dalla acetilazione degli istoni

55 Acetilazione degli Istoni
E’ una modificazione post-traduzionale Gruppi acetilici (CH3COO–) legati covalentemente a aminoacidi basici Neutralizzano le cariche positive Eliminano le interazioni ioniche con il DNA Diminuiscono la condensazione Associati con una attiva trascrizione

56 Acetilazione/Deacetilazione

57 Attivatori: acetilazione degli Istoni
Alcuni attivatori attirano delle acetilasi Il macchinario di trascrizione puo’ accedere al DNA meno condensato

58 Alcune Istone Acetilasi (HAT)
p300/CBP TAF II 250 Ambedue sono dei co-attivatori SAGA e’ a ponte tra un Fattore di Trascrizione e la TBP

59 Repressori: deacetilazione degli Istoni
Alcuni repressori attirano delle deacetilasi Prevengono l’accesso del macchinario di trascrizione al DNA

60 Acetilazione/Deacetilazione

61 SWI/SNF in Lievito SWI/SNF sono regolatori positivi del gene HO (accoppiamento) e del gene SUC2 (utilizzo del saccarosio). Queste proteine catalizzano il rimodellamento ATP-dipendente del DNA

62 Macchinari di Rimodellamento
Tutti contengono subunita’ simili a swi-2/snf NTP-binding proteins

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65 http://www.uniroma2.it/didattica/biochimica/deposito/ Lez8-10.ppt
Lez29-10.ppt (ancora da aggiungere)

66 Regolazione dell’Espressione Genica
Puo’ essere regolata in una delle seguenti sei fasi: NUCLEUS CYTOSOL inactive mRNA degradazione DNA RNA transcript mRNA mRNA trascrizione Maturazione trasporto traduzione protein controllo dell’attivita’ inactive protein

67 Controllo della Traduzione
1. Repressione - es. Iron Response Element della ferritina 2. Stabilizzazione- es. IRE del recettore della transferrina Ferritina - Lega il Ferro e lo conserva Recettore della Transferrina (TFR)- trasporta il ferro nella cellula Se il Ferro e’ nella cellula - Si Ferritina, No TFR Se non c’e’ Ferro - Si TFR, No Ferritina Come viene regolato tutto questo?

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69 1. Repressione :-Ferro, ferritina NO
IRE-BP (cytosolic aconitase) Ferritin mRNA M M AUG m7G Coding region Iron Response Element 2. Attivazione:+ Ferro, ferritina SI Fe Fe Fe M Coding region AUG

70 1. Stabilizzazione:- Ferro, TFR SI
IRE-BP (cytosolic aconitase) M TFR mRNA AUG m7G Coding region Iron Response Element 2. Degradazione:+ Ferro, TFR NO Fe Fe Coding region AUG

71 1. Stabilizzazione:- Ferro, TFR SI
IRE-BP (cytosolic aconitase) TFR mRNA AUG m7G Coding region Iron Response Element 2. Degradazione:+ Ferro, TFR NO Fe Coding region AUG RNAse

72 Controllo dello Splicing: espressione di Fibronectine tessuto-specifiche
Figure 11-24

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74 Lo Splicing puo’ produrre anticorpi solubili o legati alla membrana dallo stesso gene
Lo splicing alternativo puo’ produrre due tipi di anticorpo diversi con la stessa specificita’ Quando attivati dall’antigene i linfociti B cominciano a produrre anticorpi solubili Le forme secrete mancano degli esoni 7 e 8 che codificano per domini idrofobici Scan Hartwell Fig 8.18

75 Trasporto segnale-mediato attraverso il poro nucleare (NPC)
The nuclear pore complex Figure 11-28

76 La proteina HIV Rev regola il trasporto dell’RNA virale non ancora maturo
Figure 11-38

77 L’RNA Editing altera le sequenze dei pre-mRNA
Figure 11-39

78 La deaminasi e’ presente
mRNA editing Nel fegato Deamination of a C to a U creates a stop codon resulting in a truncated form of Apo B in the small intestine rather than the long form found in liver La deaminasi e’ presente solo nell’intestino Nell’intestino

79 No tRNA amino-acetilati
Controllo della Traduzione da parte degli aminoacidi in lievito No Aminoacidi No tRNA amino-acetilati Gcn2p kinase GDP GDP P S51 a eIF2 eIF2 eIF2B GTP Translation competent eIF2