UN TESORO NASCOSTO NEL NOSTRO OLIO DI OLIVA: IL POTERE ANTIOSSIDANTE Il valore aggiunto che sappiamo offrire per mezzo di un'analisi innovativa 12 Novembre.

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1 UN TESORO NASCOSTO NEL NOSTRO OLIO DI OLIVA: IL POTERE ANTIOSSIDANTE Il valore aggiunto che sappiamo offrire per mezzo di un'analisi innovativa 12 Novembre 2011 Aula Magna I.T.T. G. e M. Montani Fermo Teresa Cecchi, PhD

2 Il valore aggiunto che sappiamo offrire per mezzo di un’analisi innovativa
Radicali liberi Potere antiossidante dell'olio d'oliva Metodi attualmente disponibili per la sua stima Punti di forza del nuovo metodo Suggerimenti per lo sviluppo di nuove nicchie di mercato: sapere per crescere

3 Cosa sono i Radicali Liberi ?
I radicali liberi sono specie chimiche molto reattive a causa di un elettrone spaiato nell'orbitale più esterno: la reattività di un radicale dipende dalla sua struttura. I radicali liberi che un organismo deve affrontare posso essere di origine esterna (luce solare, fiìumo inquinanti, dieta non bilanciata, radiazioni ionizzanti) interna: le ROS sono sintetizzate come risposta immunitaria da enzimi dedicati nei fagociti per proteggere il sistema biologico da batteri, materiale estraneo e tessuti danneggiati. nel metabolismo stesso: l'ossigeno, indispensabile per la vita produce come sottoprodotto non evitabile le ROS poiché degli elettrono bypassano la loro catena di trasporto e riducono direttamente l'ossigeno in 4 step monoelettronici O2 + 1e- → O2-∙ anione superossido radicale e radicale peridrossilico sua base con. O2-∙ + 2H+ + 1e- → H2O2 perossido d'idrogeno H2O2 + 1e- → OH- + OH∙ radicale idrossilico, estremamente reattivo OH∙ + 1e- + H+ → H2O

4 Malattie e danni causati all’organismo
Invecchiamento stesso, secondo la “Free Radical Theory”: le ROS danno un danno ossidativo attaccando il DNA, le proteine e i lipidi (Arking, 2006, The biology of aging: observations and Principles, 3rd Ed. Oxford, UK, Oxford University Press. ISBN: ) Arteriosclerosi dovuta al danno ossidativo dei lipidi (da parte del radicale peridrossilico HOO∙) nella parete dei vasi sanguigni, patologie del sistema cardiocircolatorio (ipertensione, aterosclerosi, ictus, infarto) Sviluppo di tumori dovuto al danno provocato dall’ossidazione del DNA Danno tessutale nell'artrite reumatoide e nelle patologie infiammatorie dell'intestino, quali il morbo di Crohn e la colite ulcerativa. Malattie neurodegenerative, quali il morbo di Parkinson, la Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA) e l’Alzheimer. Invecchiamento e fotoinvecchiamento della pelle: rilascio di proteasi che agiscono sul collagene e sull'elastina, discromie, diminuzione del tono e dell’elasticità, assottigliamento, secchezza, rughe. Cataratta

5 Gli antiossidanti endogeni ed esogeni limitano i danni dei ROS
Le cellule possono tollerare uno stress ossidativo blando, che spesso è superato grazie all’esistenza di efficienti sistemi di difesa antiossidante. Gli antiossidanti prevengono l'azione distruttrice del radicale libero reagendo con esso e formando nuovi radicali scarsamente reattivi secondo la reazione seguente: Ar-OH + R• → Ar-O• + RH Antiossidanti enzimatici, endogeni superossido dismutasi: 2O2-• + 2H+ → H2O2 + O2 catalasi: 2H2O2 → 2H2O + O2 glutathione peroxidase: 2GSH + H2O2 → GSSG + H2O Antiossidanti non-enzimatici, anche esogeni: Vitamina C, vitamina E, vitamina A, co-enzyme Q10, glutathione, acido alpha lipoico, polifenoli, l’acido urico, la bilirubina, e la melatonina.

6 I polifenoli: 8000 strutture che prevengono l'ossidazione!
Non Flavonoidi Acidi Idrossibenzoici: Acido Gallico, Acido p-Idrossibenzoico Acidi Idrossicinammici: Acido caffeico, ferulico Idrossi-isocromani Idrossistilbeni: Resveratrolo Alcoli fenolici (3,4-dihydroxy-phenyl)ethanol (3,4-DHPEA o hydroxytyrosol) (p-hydroxyphenyl)ethanol ( p-HPEA o tyrosol) Flavonoidi Flavonoli: Quercetina, Miricetina, Rutina, Canferolo Antocianine (e proantocianidine): Delfinidina, Cianidina, Malvidina, Peonidina Flavan-3-oli Monomeri: Catechina, Epicatechina, Proantocianidine Tannini condensati Flavanoni: Hesperitn Flavoni: Apigenina, Luteolina Isoflavoni Calconi Lignani, derivati dalla fenilalanina, fitoestrogeni: (+)-1-Acetoxypinoresinol, (+)-1-Pinoresinol Secoiridoidi: presenza dell'acido elenolico o dei suoi derivati. UNICAMENTE NELL'OLIO DI OLIVA!!!!!!

7 Il tesoro nascosto nell'olio d'oliva
Da ricercare nella frazione insaponificabile (circa 2% del peso dell’olio di oliva) Più di 230 sostanze chimiche appartenenti a diverse classi alcoli alifatici e triterpenici, steroli, idrocarburi (squalene) e composti volatili, responsabili dell'aroma Antiossidanti la cui composizione non può essere ritrovata in alcun altro olio Caroteni Tocoferoli (α-, β-, γ-, δ-tocoferolo ) sostanze fenoliche idrofile formate durante il processo di estrazione meccanica dell’olio dai composti fenolici presenti nell’oliva, in particolare, in ordine di quantità presenti Secoiridoidi: oleuropeina, demetiloleuropeina, ligstroside, forma dialdeidica dell’acido elenoico legata al 3,4-DHPEA, o p-HPEA (3,4- DHPEA-EDA o p-HPEA-EDA) e oleuropeina aglicone (3,4-DHPEA-EA). Tipici delle Olearaceae che include la Olea europaea Lignani: (+)-1-acetossipinoresinolo and (+)-1-pinoresinolo e (+)-1- idrossipinoresinolo Acidi fenolici vari derivanti dall'acido benzoico o cinammico Alcoli fenolici: (3,4-dihydroxy-phenyl)ethanol (3,4-DHPEA o hydroxytyrosol) e (p-hydroxyphenyl)ethanol (p-HPEA o tyrosol) i flavonoidi: apigenina e luteolina

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9 L'olio d'oliva è un “nutraceutical”
Da Hippocrate ( BC) a Leonardo da Vinci ( ) si è sempre ritenuto che "la vita di un uomo dipende da ciò che mangia". Inibizione dell'aggregazione piastrinica da parte del 3,4-DHPEA (Petroni, et al. Thromb. Res. 78, 1995, ) Effetto inibitorio dei fenoli idrofilici dell'olio d'oliva sulla ossidazione delle LDL (Visioli,et al. Atherosclerosis 117, 1995, 25-3) Attività protettiva del 3,4-DHPEA sul danno ossidativo degli eritrociti e diminuzione del rischio di trombosi e ritardo del danno aterosclerotico (C. Manna, al. J. Nutr. Biochem. 10, 1999, ). Capacità del 3,4-DHPEAdi inibire la proliferazione ed indurre apoptosi nelle cellule tumorali conferente all'olio d'oliva una proprieta anticancro (R. Fabiani, et al: European Journal of Cancer Prevention (2001) Effetto antiplroliferativo dell' oleuropeina e hydroxytyrosol sulle cellule MCF-7 del cancro del seno (Han et al. Cytotechnology, 59, 2009, 45-53) In generale, negli ultimi anni studi pubblicati su giornali scientifici ad alto impact factor confermano che circa un terzo dei casi di cancro sono collegati all'alimentazione e la dieta mediterranea, basata sul consumo di olio d'oliva, conferisce protezione rispetto lo sviluppo del tumore e rispetto alle malattie cardiovascolari e diabete; inoltre si è dimostrato che l'olio d'oliva modula la funzione immunitaria e ha una chiara azione antinfiammatoria. I polifenoli idrolfilici tipici dell'olio d'oliva si sono dimostrati più attivi di molecole generalmente considerate antiossidanti quali la Vitamina E (Carrasco et al. J.Sep.Sci. 28, 2005, 837) Servili et al. Phenolic compounds in olive oil: antioxidant, health and organoleptic activities according to their chemical structure, Inflammopharmacology, 17, 2009, 76

10 Necessità della stima del potere antiossidante: quantizziamo questo valore aggiunto!
Poiché il tesoro nascosto nell'olio d'oliva è il suo potere antiossidante, dovuto in particolar modo alla frazione fenolica, il settore olivicolo potrà crescere sfruttando tale segreto della salubrità della dieta mediterranea. Serve un metodo che lo stimi in modo quantitativo, veloce, preciso ed accurato e che permetta la classificazione merceologica degli oli secondo questo parametro Serve uno stimolo all'introduzione di tale metodo nei regolamenti ufficiali eutropei (EEC 2568/91 e successive modifiche) per l'analisi degli oli per innovare radicalmente questa possibilità analitica

11 Aprroccio analitico separativo COI/T.20/Doc No 29/2009
Estrazione con MeOH: H2O 80/20, bagno ad ultrasuoni, centrifuga Separazione analitica da 82 minuti in duplicato, bianco, standard esterno Quantificazione, difficile per i diversi fattori di risposta al detector Mancanza di standard commerciali per ogni singolo composto naturale, necessità di conferme con tecniche strumentali molto costose (Wellwood and Cole 2004). The concentration of phenolic com-pounds, evaluated colorimetrically, was highly correlate Procedura lunga e laboriosa (circa 6 ore per campione), risultati controversi Baldioli et al. 1996; Owen et al. 2000; Montedoro et al. 1992; Bendini et al Mancanza di informazione sull'attività specifica di ogni molecola

12 Risultato della separazione

13 so chi sono ma non so che fanno!!!
I biofenoli so chi sono ma non so che fanno!!!

14 Approccio analitico olistico
Determinazione della capacità antiossidante globale del campione in esame Correlazione di tale capacità antiossidante globale con la composizione della miscela di antiossidanti determinati con l'approccio separativo Individuazione delle molecole responsabili maggiormente del potere antiossidante e delle eventuali sinergie

15 Disponibilità di metodi per la stima del potere antiossidante: metodi HAT vs ET

16 Metodi HAT L'antiossidante compete con la sonda ossidabile fluorescente per radicale perossidico ROO·generato termicamente da un azo radical iniziatore idrosolubile, normalmente AAPH (2,​2'-​azobis-​2-​methyl- ​propanimidamide, dihydrochloride) ROO• + Sonda (fluorescente) → ROOH + Sonda ossidata (perdita di fluorescenza) L'analisi quantitativa si fa per paragone della cinetica di ossidazione (area sotto la curva di decadimento) della sonda fluorescente in presenza o assenza dell'antiossidante poichè esso ritarda l'ossidazione, usando come standard antiossidante il Trolox (derivato della vitamina E solubile). Crocin bleaching assay, si misura la capacità dell'antiossidante di proteggere lo sbiancamento della crocin da parte del AAPH, difficili applicazioni quantitative: la velocità di reazione di sbiancamento inibito dall'antiossidante purtroppo non è sensibile alla variazione della concentrazione dell'antiossidante stesso Interferenze e variabilità da lotto a lotto della crocina . TRAP (total radical trapping antioxidant parameter assay): R-phycoerythrin (proteina) come sonda, difficili applicazioni quantitative: variabilità da lotto a lotto Interazioni aspecifiche con I polifenoli fanno diminuire la fluorescenza anche senza aggiunta di generatori di radicali ORAC (oxygen radical absorbance capacity assay): fluoresceine come sonda Fintanto che gli antiossidanti presenti sono in grado di catturare i radicali, essi proteggono la fluoresceina dal decadimento poi essa perde parte della sua fluorescenza. Il tempo di decadimento della sonda fluorescente risulta proporzionale alla quantità ed attività degli antiossidanti presenti nel campione in analisi Automatizzabile (Cao G., Verdon C.P., Wu A.H.B., Wang H., Prior R.L., 1995, Clin. Chem. 41: ) Poichè tali metodi mancano della propagazione a catena sono poco rilevanti per dosare la capacità antiossidante di rompere una catena radicalica Il radicale non è simile a uno di quelli prodotti nello stress ossidativo nei sistemi biologici La sonda non è simile ai substrati che in-vivo vengono attaccati dai radicali liberi Nel test ORAC la concentrazione del substrato è minore di quella dell'antiossidante il che è in contrasto con le situazioni reali, rendendo poco interessanti le informazioni fornite (Huang et al ).

17 Metodi ET Si basano sulla capacità di un antiossidante di ridurre un ossidante che, cambiando colore in tale processo, permette di dosare l'antiossidante dalla curva ABS vs C. TEAC (Trolox equivalence antioxidant capacity assay) l'ossidante è ABTS·-(2,2'-azino-bis(3- ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid)). La concentrazione di antiossidante che dà una percentuale di cambio dell'assorbanza del ABTS·- pari a quella di 1 mM Trolox è la TEAC. Sfortunatamente manca la correlazione fra i valori TEAC e il numero di elettroni dati La diversa velocità di reazione dei vari antiossidanti non si riflette nei valori TEAC perché esso è un saggio di end-point e ciò ne abbassa l'affidabilità. FRAP (ferric ion reducing antioxidant power assay): la unità FRAP come la quantità di antiossidante capace di ridurre 1 mol di Fe(III) a Fe(II) I valori FRAP sono stati spesso in contrasto con le proprietà riducenti delle molecole stesse, e il tempo del test (4 min) si è dimostrato assolutamente insufficiente per i polifenoli DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl radical) usa come ossidante un radicale stabile e commercialmente disponibile, la cui riduzione viene misurata a 515 nm finchè il decadimento è finito. La concentrazione di antiossidante che dà una diminuzione della concentrazione iniziale di DPPH del 50% è definita come EC50 La stabilità del DPPH lo differenzia dai radicali dello stress ossidativo e della perossidazione lipidica ROS radical. Alcuni antiossidanti importanti dal punto di vista biologico potrebbero addirittura non reagire con esso La cinetica di reazione non è lineare con la concentrazione di DPPH Si sono osservate reazioni reversibili FCR: Metodo Folin-Ciocalteu; il reagente non è specifico per I polifenoli poichè può essere ridotto da una grande quantità di sostanze come la vitamina C, il Cu (I) etc....

18 Debolezza dei metodi attualmente usati per la stima del potere antiossidante (Huang et al. 2005).
Gli antiossidanti testati non affrontano mai quei ROS che nell'organismo umano causano il danno ossidativo Il radicale usato non è simile a uno di quelli prodotti nello stress ossidativo nei sistemi biologici La sonda non è simile ai substrati che in-vivo vengono attaccati dai radicali liberi Nel test ORAC la concentrazione del substrato è minore di quella dell'antiossidante il che è in contrasto con le situazioni reali, rendendo poco interessanti le informazioni fornite Mentre l'anione radicale superossido e H2O2 sono degradati in vivo dalla SOD e catalasi, non si conoscono protezioni enzimatiche nei confronti di HOO· e HO·, quindi su di essi dovrebbe concentrarsi un metodo affidabile della stima del potere antiossidante

19 Punti di forza del nuovo metodo
E' l'unico test in-vitro che simula condizioni in-vivo perché gli antiossidanti debbono affrontare chimicamente nella miscela di reazione gli stessi radicali liberi e i loro precursori responsabili di invecchiamento e malattie e cioè HOO· and H2O2. Inoltre il test misura l'attività di quelle molecole capaci di prevenire la formazione del devastante radicale HO· attraverso la reazione di Fenton, poiché catturano quei metalli che la catalizzano. Lavora a pH≤2, tipico dei fluidi gastrici nei quali la perossidazione lipidica è amplificata (Kanner and Lapidot 2001). E' semplice, non costoso, rapido Si è modificata la reazione di BR per tener conto della non solubilità dei campioni in acqua Non si misura il potere antiossidante di un estratto dell'olio perchè ciò non potrebbe rendere conto di sinergie antiossidant (Papadopoulos and Boskou 1991) ma si è analizzato direttamente l'olio. Il metodo è basato sulla risposta cinetica ottenuta da una reazione oscillante che genera radicali liberi simulanti lo stress ossidativo in-vivo. Quando scavengers di radicali attivi- come i polifenoli- sono aggiunti alla miscela oscillante le oscillazioni si inibiscono per un tempo che è proporzionale alla quantità ma anche alla attività della molecola antiossidante aggiunta.

20 Il servizio Bisogni dei consumatori che si intende soddisfare.
Dato che l’olio di oliva gioca un ruolo cruciale nel prevenire lo stress ossidativo causa di invecchiamento e numerose patologie un bisogno fondamentale dei consumatori è poter ottenere una misura quantitativa della capacità dell’olio extravergine di oliva di fornire composti antiossidanti che sono capaci di spazzare via i radicali liberi. Bisogni dei produttori che si intende soddisfare. La soddisfazione del bisogno dei consumatori di cuisopra diventa fonte di business per i produttori che spesso sono piccole aziende locali ma con forte potenzialità di espansione nel mercato globale se solo potessero certificare la qualità dei loro prodotti.

21 Finalità e risultati attesi
Introduzione di questo nuovo metodo di analisi potrebbe generare lavoro indotto nei laboratori di analisi degli alimenti attualmente presenti nel territorio italiano impulso alla commercializzazione dei materiali e strumenti necessari per realizzarlo. Il servizio innovativo potrebbe incrementare il business dell’olio di oliva che rappresenta un settore importantissimo nell’economia italiana. poiché il metodo riesce a lavorare sulla matrice alimentare direttamente e senza pretrattamente potrebbe essere esteso ad altri cibi fonti naturali di antiossidanti (vino, thè, frutta e verdura etc…) con coinvolgimento di ampi settori dell’industria alimentare Finalità non meno importante è quella di riscattare la reputazione della scienza chimica purtroppo spesso a torto vista come causa dei mali dell’ambiente. Il Chimico assume un ruolo affine a quello del medico o del farmacista poiché certifica il valore intrinseco di un prodotto naturale.

22 Realizzazione Svolgere l’analisi descritta non impiega più di una ora per una persona (perito chimico) ben addestrata I reattivi necessari allo svolgimento della stessa analisi sono: acqua ossigenata, acido malonico, Iodato di sodio, Solfato di manganese, acido gallico, acetone. Considerate le quantità utilizzate in una singlo analisi ed il prezzo dei reattivi si può certamente dire che la spesa dei consumabili per una singola analisi è inferiore ai 10 Euro. Vanno considerati poi i costi per il personale (1 analisi per ogni ora lavorativa che supponiamo costi 25 Euro lordi) e i costi in conto capitale per gli strumenti utilizzati (potenziometro, PC, elettrodo) che possono ammontare a circa 3000 Euro. Gli operatori da contattare in qualità di fornitori di tale servizio sono oleifici produttori di olio di oliva laboratori di analisi degli alimenti altri comparti dell’industria alimentare interessata a fare business delle caratteristiche nutritive antiossidanti di un dato alimento agenti pubblicitari e dell’informazione di Massa

23 Abbiamo utilizzato e caratterizzato campioni di oli extravergini d'oliva monocultivar italiani (2007, Marche) ottenuti in bottiglie di vetro verde scuro dall’ ASSAM (Ancona) nel novembre 2007, conservati in al buio, alla temperatura di 19°-21°C. Risultati preliminari illustrati di seguito mostrano la fattibilità della realizzazione del servizio progettato e proposto Oscillogramma della reazione oscillante in oscillogramma della reazione oscillante con assenza di sostanze antiossidanti l’aggiunta di un estratto fenolico(polifenoli)

24 La linearità fra tempo di inibizione e quantità (microlitri) di antiossidante contenuto nell’olio extravergine di oliva aggiunto è perfettamente dimostrata nel grafico seguente dove è stata anche inserita l’equazione matematica della retta di regressione; il coefficiente di determinazione mostra l’ottima correlazione raggiunta.

25 Suggerimenti per una linea di ricerca che non si spezzi e faccia crescere il nostro territorio....
Il potere antiossidante e il profilo fenolico dell'olio come parametri di tipicità attraverso l'ANOVA Oli d'oliva arricchiti nella frazione polifenolica come functional food Studio degli effetti sulla frazione fenolica e sul potere antiossidante delle condizioni estrattive per ottimizzare la produzione di oli ad alto potere antiossidante attraverso la modulazione dell'attività della ossidasi polifenolica e perossidasi Estrazione dei polifenoli dalle acque di vegetazione attraverso l'uso di funghi/pelli di babana/enzimi Uso della frazione fenolica come antiossidante dei cibi concorrente di quelli attualmente in uso

26 Suggerimenti per una linea di ricerca che non si spezzi e faccia crescere il nostro territorio....
Suaarez et al. Development of a Phenol- Enriched Olive Oil with Phenolic Compounds from Olive Journal of Agricultural and Food Chemistry, 58, 2010, 10396 Inarejos et al., Effect of crushing on olive paste and virgin olive oil minor components, European Food Research and Technology, 232, 2011, 441. Lee Ok-Hwan et al. Assessment of phenolics-enriched extract and fractions of olive leaves and their antioxidant activities, Bioresource Technology, 100, 2009, 6107. Garcaa et al. Role of polyphenol oxidase and peroxidase in shaping the phenolic profile of virgin olive oil, Food Research International, 44, 2011, 629. Servili et al. Improvement of bioactive phenol content in virgin olive oil with an olive-vegetation water concentrate produced by membrane treatment, Food Chemistry, 124, 2011, 1308. Lafka et al. Phenolic and antioxidant potential of olive oil mill wastes, Food Chemistry, 125, 2011, 92. Goamez et al. Effect of Malaxation Conditions on Phenol and Volatile Profiles in Olive Paste and the Corresponding Virgin Olive Oils. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 57, 2009, 3587 Ergül et al. Dephenolisation of olive mill wastewater using adapted Trametes versicolor, International Biodeterioration & Biodegradation, 63, 2009, 1. Rodríguez et al. Isolation of a powerful antioxidant from Olea europaea fruit-mill waste: 3,4-Dihydroxyphenylglycol, Food Science and Technology, 42, 2009, 483. Suarrez et al. Methods for Preparing Phenolic Extracts from Olive Cake for Potential Application as Food Antioxidants, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 57, 2009, 1463 Han Junkyu,  Talorete Terence P. N.,  Yamada Parida,  Isoda Hiroko,  Anti- proliferative and apoptotic effects of oleuropein and hydroxytyrosol on human breast cancer MCF-7 cells, Cytotechnology, 59, 2009, Achak et al. Low cost biosorbent “banana peel” for the removal of phenolic compounds from olive mill wastewater: Kinetic and equilibrium studies, Journal of Hazardous Materials, 166, 2009, 117. Najafian L.,  Ghodsvali A.,  Haddad Khodaparast M.H.,  Diosady L.L., Aqueous extraction of virgin olive oil using industrial enzymes, Food Research International, 42, 2009, pp