Il conteggio e la identificazione delle cellule ematiche

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1 Il conteggio e la identificazione delle cellule ematiche

2 Malattie ematologiche attese nel Salernitano
N.casi/anno L.A. Mieloide L.A. Linfoide Altre M.di Hodgkin Linfomi non-H Mieloma Multiplo L.Linfatica Cronica L.Mieloide Cronica Totale emocromi /anno?

3 PROBABILITA’ DI CURA IN ONCO-EMATOLOGIA
LEUCEMIE ACUTE ANZIANI % ADULTI % GIOVANI % LINFOMI NH % L. DI HODGKIN % MIELOMA MULTIPLO BMT % CT anni ABMT x 2 o più

4 Speranza di guarigione
%Remissione % Guarigione L.A. Mieloide L.A. Linfoide : bambini adulti M.di Hodgkin Linfomi non-H Mieloma Multiplo L.Linfatica Cronica L.Mieloide Cronica TMO 60 IFN 15 Inibitori tirosinkinasi ?

5 L’obiettivo della terapia è sempre la guarigione ?
Scelta del trattamento più adeguato vuol dire fare un bilancio fra rischi e benefici attesi. I trattamenti intensivi aumentano le possibilità di guarigione, ma: espongono a maggiori rischi peggiorano la qualità di vita

6 Quanto costa curarsi ? Leucemia - chlorambucil Euro 72
6 mesi di terapia Leucemia - chlorambucil Euro Linfatica - fludarabina Cronica: - fluda+rituximab - trapianto autologo 3 anni di terapia Leucemia - idrossiurea Euro Mieloide - interferone alfa Cronica: - trapianto allogenico - Glivec

7 DIAGNOSTICA DELLE PATOLOGIE ONCOEMATOLOGICHE
MORFOLOGIA CITOFLUORIMETRIA CITOGENETICA BIOLOGIA MOLECOLARE BIOPSIA OSTEOMIDOLLARE VALUTAZIONE MASSE (ecografia, tac….)

8 Antonj van Leeuwenhoek nel 1674 trasmise in una
lettera alla Royal Society di Londra la prima descrizione dei globuli rossi Ma molto probabilmente Marcello Malpighi, di Bologna, fu il primo ad osservare i Globuli Rossi nel 1661 nel lume dei capillari di uomo e animale. Egli li descrisse come “globuli rubescenti” e li localizzò nelle arterie e nelle vene che aveva appena scoperto. La nascita e lo sviluppo della diagnostica ematologica sono stati scanditi da una serie di scoperte a partire dalla seconda metà del XVII secolo, quando …… che aveva potuto osservare nel suo stesso sangue con l’ausilio di un rudimentale microcopio.

9 Nel 1877, con la scoperta della colorazione triacida comincia l’era della MORFOLOGIA EMATOLOGICA
Nel 1877, Paul Erlich realizzò una colorazione triacida che permetteva di riconoscere il nucleo ed il citoplasma dei leucociti negli strisci di sangue. Da allora, cominciò l’era della morfologia ematologica ed il microscopio servì non solo per contare le cellule, ma anche per riconoscere e classificare le cellule normali e patologiche del sangue periferico.

10 Giulio Bizzozero Nel Dicembre 1881 comunicò all'Accademia di Medicina la sua grande scoperta: le piastrine come terzo componente morfologico del sangue e la loro importanza nel processo della trombosi.

11 Strumenti diagnostici del laboratorio di ematologia agli inizi del secolo scorso
Quindi ai primi decenni del nostro secolo la batteria diagnostica del laboratorio di ematologia aveva già pronti accanto al microscopio, i suoi strumenti di misura (pipette graduate, diluenti e lisanti, camere con reticolo per la conta ed emoglobinometri), e strumenti di valutazione qualitativa (vetrini e coloranti), ma soprattutto cultura, esperienza ed intuito)

12 Per ematocrito si intende il volume compresso (PCV:packed cell volume) occupato dai globuli rossi rispetto al volume totale di sangue Si esprime in percentuale (Ht %). È evidente che il valore dell’Ematocrito è funzione del numero e del volume dei Globuli Rossi Hct = MCV x n. GBR Nel 1930, Maxwell Wintrobe standardizza la procedura per l’esecuzione dell’EMATOCRITO L’ultimo periodo di questa fase pretecnologica non fu legata ad un progresso tecnico, ma la “genio” di Maxxwell Wintrobe che standardizzò la procedura a quei tempi più affidabile, quella della misura dell’ematocrito con cui si intende… Avendo la possibili di conoscere il valore dell’Hb, il numero dei GBR e l’ematocrito, Wintrobe propose gli Indici che da lui prendono il nome e che da allora vengono ancora usati nella diagnostica delle anemie.

13 Indici di Wintrobe MCV Hct / n. GBR MCHC Hb / Hct (GBR x MCV) MCH
Normocitica MCHC 34 g/L normocromica MCH pg MCV Hct / n. GBR Macrocitica MCHC 30 g/L Ipocromica MCH pg MCHC Hb / Hct (GBR x MCV) L’MCV è il volume medio della popolazione dei GBR e da solo ci fa capire se questa è normale, macrocitica o microcitica; così l’MCHC che ci informa se la popolazione è normocromica, ipocromica o ipercromica. L’MCH (che è una misura in peso) da solo ci dà scarse informazione perché, come si osserva dalla diapositiva, per un valore uguale di MCH le cellule possono essere diverse l’una dall’altra. Microcitica MCHC 38 g/L Ipercromica MCH pg MCH Hb / n. dei GBR in milioni

14 La variazione d’Impedenza Principio di Coulter (1956)
Elettrodo interno Elettrodo esterno Flusso del diluente Vuoto regolato Temps U Conta del numero di particelle nell’unità di tempo La transizione della emocitometria dai metodi manuali alle procedure automatiche comincia nel 1934 con il Metodo capillare di Moldavan. Il maggior sviluppo che ha rivoluzionato l’emocitometria e la funzionalità dei laboratori di routine è cominciata nel 1956 quando Wallace Coulter presentò il suo metodo dell’impedenza. Il principio dell’impedenza si basa sul fatto che il sangue è un cattivo conduttore di elettricità, mentre certi diluenti sono buoni conduttori. Quindi, il sangue passando attraverso un orificio capillare tra 2 elettrodi sposta (displaces) una proporzionale quantità di fluido conducente, aumentando la resistenza elettrica e causando una corrispondente variazione di potenziale fra gli elettrodi con la produzione di impulsi, l’amplificazione dei quali è proporzionale alla grandezza delle cellule Volume delle particelle Calcolo automatico del Hct e degli Indici di Wintrobe

15 Metodo Ottico Il secondo principio fisico che ha trovato applicazione nel conteggio cellulare è quello ottico, basato sulla rilevazione dei cambiamenti e la deviazione che un fascio di luce incidente subisce quando colpisce le cellule che scorrono in fila indiana. Il fascio di luce originato dall’impatto con le cellule colpisce fotodiodi e fotomoltiplicatori che emettono, in conseguenza dell’irraggiamento, impulsi elettrici che vengono analizzati elettronicamente. Il metodo ottico può essere basato sull’impiego di una luce bianca emessa da lampade a tungsteno o di luce monocromatica laser. La misura ottica associa la citometria a flusso e la diffrazione luminosa. Si basa sulla rilevazione dei cambiamenti e sulla deviazione che un fascio di luce subisce quando colpisce una particella

16 Metodo ottico : due parametri di riconoscimento per il globulo rosso :
Raccolta del segnale a definiti intervalli angolari Low angle scatter 2o - 3o (Volume) High angle scatter 5o - 15o (HGB concentration)

17 Tutto ciò rappresentò la prima rivoluzione della ematologia di laboratorio.
Quindi, negli anni ’60 si cominciarono a costruire strumenti che fornivano in tempi brevi misurazioni precise, riproducibili ed accurate. Da test al giorno a centinaia di test al giorno

18 Correzione della coincidenza
Occasionalmente 2 o 3 cellule possono passare attraverso l’orificio di conta nello stesso tempo Viene quindi generato un impulso di grande ampiezza La frequenza di questo passaggio in coincidenza è statisticamente prevedibile ed è funzione del numero delle cellule. La correzione viene quindi realizzata automaticamente per gli analizzatori che usano questa tecnologia. Temps U Il principo dell’Impedenza di Coulter è stato poi combinato con principi complementari che hanno consentito una maggiore accuratezza dei risultati: la correzione della coincidenza, implementata automaticamente su alcuni strumenti Chez Coulter est combiné avec plusieurs concepts complémentaires pour une plus grande exactitude des résultats Peut être utilisé avec l'hydrofocalisation

19 Focalizzazione Idrodinamica
Flusso di guaina Flusso del campione Flusso del campione Flusso di guaina e la focalizzazione idrodinamica in cui un flusso di guaina consente di mettere in fila le cellule evitando quindi coincidenze ed otturazione dei canali (varrichina). Per ottenere degli impulsi coerenti, viene utilizzato un principio complementare: la focalizzazione idrodinamica. Le cellule sono messe in fila le une dietro le altre e spinte verso la zona di conta.

20 CURVA DI DISTRIBUZIONE DEL VOLUME ERITROCITARIO

21 La formula leucocitaria

22 Problemi organizzativi Utilità diagnostica dubbia Scarsa precisione
I motivi che hanno portato al tentativo di automatizzare la formula leucocitaria sono: Alto costo Problemi organizzativi Utilità diagnostica dubbia Scarsa precisione Per quanto riguarda la formula leucocitaria sembrava che il dominio dell’uomo e del microscopio fossero ben più difficili da scalfire. I motivi che hanno portato, soprattutto ricercatori dell’industria, al tentativo di automatizzare la formula leucocitaria sono i seguenti: Alto costo soprattutto in termini di lavoro umano problemi organizzativi perché questo esame costitutiva un vero e proprio “collo di bottiglia” nel flusso dei dati in un laboratorio automatizzato e computerizzato Utilità diagnostica dubbia nel riconoscimento di “processi morbosi minimi” su pazienti non selezionati Scarsa precisione a causa della soggettività del giudizio dell’osservatore specie per quelle aree in cui le definizioni morfologiche sono meno soddisfacenti, come la distinzione fra monociti, grandi linfociti e forme band.

23 errori statistici TIPO CELLULARE 100c 500c 1.000c 10.000c
BASOFILI * * * * EOSINOFILI * * * MONOCITI * * LINFOCITI * NEUTROFILI * Errori statistici, legati alla formula leucocitaria effettuata su 100 globuli bianchi, che inficiano soprattutto le conte delle classi leucocitarie meno rappresentate Tutte queste critiche al metodo tradizionale, più volte riprese ed enfatizzate dalla letteratura scientifica internazionale nei primi anni ’80, miravano a costruire uno sfondo scientifico accettabile per l’introduzione sul mercato di un metodo relativamente grossolano e poco costoso per conoscere la composizione delle principali popolazioni leucocitarie del sangue periferico : l’analisi volumetrica dei leucociti con metodo impedenziometrico o ottico, o formula leucocitaria a 3 popolazioni. HOUWEN B. Laboratory Hematology 7:89-100

24 Formula leucocitaria basata sul volume cellulare (3 popolazioni)
fL L’applicazione del metodo impedenziometrico a sospensioni di leucociti intatti permette di separare 2 popolazioni di cellule: La prima che ha un picco intorno a 250 fL e corrisponde a piccoli linfociti l’altra con picco intorno a fL che corrisponde a monociti e granulociti. La discriminazione volumetrica fu migliorata con l’aggiunta di reagenti capaci di lisare parzialmente i leucociti così da svuotare il citoplasma del suo contenuto liquido. In tal modo la misurazione impedenziometrica del volume viene a riguardare fondamentalmente il nucleo con le eventuali granulazioni. Questo fu il primo metodo di differenziazione delle popolazioni leucocitarie impementato sugli strumento negli anni ’70. Le popolazioni identificate con questo sistema erano: I piccoli linfociti i granulociti una terza popolazione (cosiddetta di cellule medie) di volume intermedio costituita da monociti, basofili, parte degli eosinofili ma anche cellule atipiche come i grandi linfociti, i blasti, i granulociti immaturi.

25 Volume / Citochimica (perossidasi) / Citolisi (SIEMENS)
Densità Nucleare Attività perossidasica V O L U M E Una evoluzione di questo sistema sugli strumenti della serie H e ADVIA ha aggiunto. oltre alla introduzione di soglie mobili sul canale della perossidasi, un nuovo canale di lettura (dei basofili o della densità nucleare) che mediante rilevazione dello scatter della luce laser (a 2 diversi angoli: piccolo angolo tra 0° e 5° per la rilevazione volumetrica e un angolo maggiore tra 5° e 15° per la rilevazione della densità nucleare) consente sia la conta dei basofili resistenti alla lisi che la differenziazione dei Mononucleati dai Polimorfomucleati in rapporto alla densità e complessità dei nuclei. Mn Pmn

26 Volume / Conduttività / Scatter (Coulter)
Diffrazione : Superficie; granulazioni V o l u m e conduttività Tecnologia VCS che è un acronimo di Volume, Conduttività, Scatter. L’ applicazione in un unico canale dei 3 seguenti sistemi di misura: Impedenziometria a bassa frequenza (DC) Conduttività in radiofrequenza (RF) Scatter della luce laser Porta alla formazione di citogrammi tridimensionali. Impedenza Conduttività Scatter

27 Volume / Citochimica / Citolisi (ABX Pentra)
Z I Sistemi argos e Vega utilizzano 1) Misura del volume mediante impedenza elettrica 2) misura della luce assorbita da ciascuna cellula in rapporto alla struttura interna 3) separazione degli eosinofili dai neutrofili mediante colorazione citochimica specifica (Sudan nero B modificato). Basofili: lisi chimica selettiva e definizione mediante impedenziometria. VOLUME VOLUME

28 Diffrazione luminosa a 3 diversi angoli (Abbott-Cell-Dyn)
90°Pol/ 90°dep Granulazioni 10° Struttura Fascio laser 1°/3° (0°) dimensione Po l ar i zzaz i one Questi sistemi contano le cellule con il metodo impedenziometrico e le classificano grazie alla misura della diffusione a 3 diversi angoli: 0° proporzionale alla grandezza 10° proporzionale alla struttura 90° proporzionale alla granulosità. Gli eosinofili sono classificati separatamente grazie alle proprietà delle loro granulazioni di depolarizzare la luce polarizzata. 1°/3° (0°) dimensione 10° Struttura

29 Scatter / Fluorescenza / Citolisi / Dimensioni (Dasit-Sysmex)
I leucociti sono colorati con un colorante fluorescente polimetinico ed analizzati tramite un raggio laser che rileva contemporaneamente l’intensità della fluorescenza e le caratteristiche strutturali interne di ogni cellula grazie allo scatter della luce laser a 90°

30 1) Conta e classificazione dei leucociti normali
Precisione: si esprime come Coefficiente di Variazione È la capacità di un metodo di ripetere un valore costante CV per il metodo manuale: Neutrofili e Linfociti tra 5 e 10% Monociti 25% Eosinofili 40% Basofili 95% Tutti i sistemi che abbiamo analizzato riescono a contare e classificare, con notevole miglioramento dei CV rispetto al metodo manuale, i linfociti (piccoli e privi di granuli), i neutrofili (di grandi dimensioni, con una struttura interna complessa per la presenza di granuli e per la segmentazione nucleare) e gli eosinofili (con caratteristiche proprietà che si prestano alle misurazioni con metodologie molto diverse). Anche i monociti vengono differenziati, con diverso approccio per le diverse tecnologie, con notevole miglioramento rispetto ai metodi manuali. Per i basofili ogni sistema operativo applica un particolare approccio analitico, dispendioso quanto, spesso, poco preciso e accurato. CV per i metodi automatici: Neutrofili e Linfociti < 4% Monociti < 10% Eosinofili < 10% Basofili < 50%

31 1) Conta e classificazione dei leucociti normali
Accuratezza: è la corrispondenza al vero di una misurazione Il vero in ematologia è rappresentato dal metodo di riferimento che per la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella conta microscopica effettuata: in condizioni standardizzate da operatori qualificati su un numero sufficiente di leucociti (400). L’accuratezza degli strumenti analitici più evoluti è molto elevata per Neutrofili, Linfociti ed Eosinofili meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica) poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa frequenza di questa classe di leucociti).

32 Specificità: capacità di non segnalare i campioni normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature Sensibilità: capacità di riconoscere i campioni contenenti cellule anomale Specificità: capacità di non segnalare i campioni normali Questa capacità si esprime mediante : La sensibilità che è la capacità di riconoscere i campioni contenenti cellule anomale ed è uguale al rapporto fra i campioni segnalati come positivi e il totale dei campioni con anomalie (ed è quindi dipendente dalla frequenza dei falsi negativi). La specificità è la capacità di non segnalare i campioni normali ed è uguale al rapporto fra veri negativi ed il titale dei campioni senza anomalie (veri negativi + falsi positivi) e dipende quindi dalla frequenza dei falsi positivi) Valore predittivo positivo Valore predittivo negativo Valore predittivo positivo: indica la probabilità che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale; Valore predittivo negativo: indica la probabilità che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie.

33 WBC Campione emolizzato
Così l’osservazione consente di rilevare alterazioni preanalitiche come un campione emolizzato con la classica falce che compare praticamente su tutti i sistemi e che, in rapporto alla sua collocazione, può far sovrastimare numero dei WBC e differenti popolazioni dei WBC. Campione emolizzato

34 Aggregati piastrinici
WBC PLT O la presenza di agglutinati piastrinici da imputare a prelievo difficoltoso o alla agglutinazione da EDTA e/o da altri anticoagulanti. Aggregati piastrinici

35 PLT Presenza di crioglobuline T° < 37°C a 37°C
Inoltre, artefatti analitici possono far evidenziare anomalie clinicamente insospettate che determinano interferenze sugli apparati di misura. È questo il caso delle crioglobuline, Ig che precipitano a temperatura ambiente, che determinano una sovrastima delle piastrine, alterazioni degli indici piastrinici e caratteristiche alterazioni di istogrammi di volume e citogrammi piastrinici. PLT T° < 37°C a 37°C Presenza di crioglobuline

36 Presenza di crioagglutinine
GBR HCT Hb MCV MCH MCHC CHCM normale Così come la presenza di crioagglutinine che può provocare l’agglutinazione a T° inferiori a 37°C l’agglutinazione dei GBR con loro conseguente sottostima e discrepanza rispetto all’Emoglobina e MCH ed MCHC a volte “assurdi”. Presenza di crioagglutinine

37 Pseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossi
Neonati Iperazotemia Iperbilirubinemia Hb patologiche O la presenza di pseudoleucocitosi (spesso pseudolinfocitosi) che se può essere un fastidioso artefatto analitico nei neonati, nei pazienti con uremia o iperbilirubinema, ma può diventare un segnale per presenza di rare emoglobinopatie allo stato eterozigote. Ad esempio, le emoglobine C,D, E ed S per fenomeni di gelificazione ed interazione con la membrana eritrocitaria delle molecole globiniche, possono determinare una resistenza alla lisi dei GBR provocata dei reagenti. Pseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossi

38 Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi e
non sono in grado di contare e classificare in modo accurato le cellule patologiche. Essi devono: Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature

39 Lo striscio di sangue periferico

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42 Lo striscio di sangue periferico

43 che ci vuole? niente!....

44 La quantità di sangue da strisciare è, entro certi limiti, variabile in funzione delle caratteristiche del campione e di quello che si vuole cercare

45 Dopo aver appoggiato il vetrino il sangue si estende lungo (quasi) tutta la superficie di contatto

46 Difficile fare di peggio…
Troppe curve Troppo lungo

47 Troppo corto e sottile Troppo corto e spesso Troppo corto

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49 COLORAZIONE I segreti: Asciugare bene Coprire bene Sciacquare bene
I preparati per la colorazione variano spesso da lotto a lotto insieme a qualità dell’acqua, temperatura ed umidità dell’aria I segreti: Asciugare bene Coprire bene Sciacquare bene

50 errori metodologici LINFOCITI ++ GRANULOCITI ++ MONOCITI ++ Area densa
CORPO I D L LINFOCITI ++ GRANULOCITI ++ MONOCITI ++ Errori metodologici legati alla ineguale distribuzione delle diverse classi di leucociti sullo striscio a causa delle variabili dimensioni e proprietà adesive, al cattivo uso del microscopio, alla modalità di esecuzione dello striscio alla mancata standardizzazione delle procedure di colorazione, ad errori legati a fattori soggettivi  Area densa Zona marginale Area sottile

51 B. Bain NEJM 2005

52 Nuovi parametri ematologici

53 Migliorare la capacità del laboratorio nel fornire dati accurati
FUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETRO Migliorare la capacità del laboratorio nel fornire dati accurati Indirizzare il laboratorista o il clinico verso un sospetto di patologia Fornire uno strumento di monitoraggio di un percorso clinico-terapeutico Aprire nuove frontiere diagnostiche

54 Raramente un nuovo parametro nasce da una richiesta clinica
Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale La ricerca industriale ha una indiscutibile (ed accettabile) motivazione economica Raramente un nuovo parametro nasce da una richiesta clinica Il primo target della ricerca industriale è il laboratorista Il passaggio al campo clinico non ha alcun percorso strutturato e consolidato

55 Analizzatore dipendenza Scarso impatto della cultura di laboratorio
OSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETRO Analizzatore dipendenza Scarso impatto della cultura di laboratorio Difficoltà del laboratorista a comprendere il reale potenziale clinico Scarsa pubblicizzazione in campo clinico

56 Sviluppo della ricerca
industria laboratorio clinica nuovi parametri nuovi farmaci “clinici” - laboratoristici sperimentazione preclinica e clinica sperimentazione esportazione Paziente

57 Parametri emocitometrici “tradizionali”
Operatore Analizzatore “Nuovi” parametri ematologici Operatore Analizzatore

58 L’allarme strumentale non è un parametro
comunicare un allarme strumentale vuol dire comunicare incapacita’ a definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo strumento

59 CITOGRAMMA ERITROCITARIO DI VOLUME E CONCENTRAZIONE DI EMOGLOBINA
macrocitosi ipocromia ipercromia microcitosi DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO 1

60 Densità (concentrazione Hb)
V O L U M E Quanto detto sui processi di produzione, maturazione ed invecchiamento dei reticolociti e dei GBR è facilmente applicabile al cluster cellulare normale, ottenuto con la tecnologia dello scatter della luce laser, che può essere suddiviso in cellule con volume più elevato e a concentrazione emoglobinica più bassa (Reticolociti e neociti) cellule normocromiche-normocitiche (normociti) cellule di volume ridotto e a più elevata concentrazione emoglobinica (gerociti e sferociti) che presentano diverse caratteristiche volumetriche, di densità (o di concentrazione emoglobinica) ed anche biochimiche. Densità (concentrazione Hb)

61 Caratteristiche degli eritrociti fra microscopia e automazione
MICROSCOPIA AUTOMAZIONE Anisocitosi Alterazioni morfologiche Microcitosi – Macrocitosi Ipocromia – Ipercromia Poichilocitosi Inclusi eritrocitari DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO 1

62 DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO 1
Acantocito = aculeo Codocito = campana cellula a bersaglio Dacriocito = lacrima Drepanocito = falce Ellissocito = ovale Cheratocito = corno Cnizocito = fossetta Megalocito = gigante Schizocito = taglio Stomatocito = bocca Sferocito = sfera emazie a fungo DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO 1

63 RDW Parametro sintetico (o riduttivo?): è una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica Manca di standardizzazione metodologica, pur avendo una univocità terminologica rara nei nuovi parametri strumentali Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche, con scarso approfondimento fisiopatologico normale elevato

64 Am J Clin Pathol. 1983 Sep;80(3):322-6.
Improved classification of anemias by MCV and RDW. Bessman JD, Gilmer PR Jr, Gardner FH Arch Intern Med Apr;148(4):822-4. Erythrocyte anisocytosis. Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution width. Simel DL, DeLong ER, Feussner JR, Weinberg JB, Crawford J. Health Services Research Field Program, Durham Veterans Administration Medical Center, NC 27705

65 RDW E CELIACHIA

66 RDW: new screening test for coeliac disease?
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac disease Brusco G. et al Dig. Liver Dis. 2000 RDW: new screening test for coeliac disease? Guglielmi V. et al Minerva Med 2002 L’incremento di RDW risulta la più frequente anormalità ematologica ( %) in adulti CD L’incremento di RDW può essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specifici L’RDW elevato è più frequente dell’anemia sideropenica nei pazienti CD L’RDW diviene normale dopo dieta priva di glutine

67 RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE

68 Am J Cardiol. 2010 Oct 1;106(7):988-93. Epub 2010 Aug 11.
Exp Clin Cardiol Fall;15(3):37-40. High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension. Wen Y. Am J Cardiol Oct 1;106(7): Epub 2010 Aug 11. Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events. Zalawadiya SK, Veeranna V, Niraj A, Pradhan J, Afonso L. Department of Internal Medicine, Wayne State University Detroit Medical Center, Detroit, Michigan, USA. In conclusion, a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk.

69 Arch Intern Med. 2009 Mar 9;169(5):515-23.
Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults. Patel KV, Ferrucci L, Ershler WB, Longo DL, Guralnik JM. Laboratory of Epidemiology, Demography, and Biometry, National Institute on Aging, 7201 Wisconsin Ave, Ste 3C309, Bethesda, MD 20814, USA CONCLUSION: Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older

70 RDW

71 Reticolociti È una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale). Questi precipitano, per effetto dei coloranti sopravitali, formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che è alla base della loro denominazione.

72 Definizione morfologica Reticolociti e Corpi di Heinz
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o più particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale. I granuli devono essere visibili senza richiedere un fine aggiustamento del fuoco sulle singole cellule e dovrebbero inoltre essere lontani dai margini (per evitare confusione con i Corpi di Heinz). Reticolociti e Corpi di Heinz

73 “Morfologia del Sangue”
Contengono RNA (colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile) sono più grandi dei globuli rossi MCVr > MCVgbr possono avere un diverso contenuto di RNA (cioè un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione D’Onofro e Zini “Morfologia del Sangue”

74 Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es. M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico). Quando la sostanza filamentosa è abbondante, possono assumere l’aspetto di emazie policromatofile, con sfumature di colore bluastro

75 Anche la punteggiatura basofila è un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala.

76 Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza giorni Reticolociti Midollari Tempo di Permanenza 2-3 giorni Barriera EMATO- MIDOLLARE Eritroblasti Ortocromatici La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive

77 CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Dacie & Lewis MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986 .…strisci non troppo sottili, ma non con cellule sovrapposte…. ....oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mm… ….fattori importanti sono l’acutezza visiva, la pazienza del tecnico, la qualità ed il potere risolvente del microscopio…. ….nel caso che ci siano pochi reticolociti, è necessario contare un numero elevatissimo di cellule….

78 Metodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacità di indurre l’aggregazione e la precipitazione dei ribosomi, in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma. I coloranti oggi in uso sono: Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine) il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento) l’Azur B Queste colorazioni definite vitali (o sopravitali) devono essere eseguite a fresco, senza fissazione, indispensabile affinchè i coloranti penetrino attraverso la membrana per provocare la precipitazione del RNA.

79 Metodi citofluorimetrici
RBC Reticolociti Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza d’onda ed emettono ad una lunghezza d’onda maggiore PLT Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati, sostituiti poi da emocitometri dedicati Auramina-O I parametri misurati sono: l’intensità della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellulari; l’intensità della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA. Arancio di Tiazolo

80 Viene costruito così un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate:
le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensità di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione. Vantaggi notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manuali obiettività più elevata velocità di esecuzione

81 Svantaggi la mancanza di calibratori stabili e affidabili
la mancanza di materiale di riferimento autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un “zero”) Interferenze Leucocitosi specie Linfocitosi della LLC Cause di interferenza nella conta possono essere: Le leucocitosi spiccate, specie i piccoli linfociti della LLC Gli aggregati piastrinici e la presenza di macrotrombociti I corpi di Jolly il cui DNA si colora intensamente I Corpi di Heinz I parassiti della malaria (Flow cytometric monitoring of parasitamia ….Wernli M. EJH 1991); Fattori plasmatici (farmaci fluorescenti , fluorescina nella angiografia retinica). Aggregati piastrinici e macrotrombociti Heinz Jolly plasmodi

82 Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dell’assorbimento luminoso Oxazina 750 Viene costruito così un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate: le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensità di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione. Nuovo blu di metilene

83 Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazioni:
Valori numerici (% e assoluti) Indici di maturazione (LFR, MFR, HFR e IRF) Indici qualitativi a) prevalentemente volumetrici (MCVr, MRV,…) b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobina (CHr, Ret He,…)

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89 citogenetica

90 LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA, CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (Bcr/Abl)

91 Traslocazioni cromosomiche
Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma all’altro Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia (Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni, dalle inversioni e dalle inserzioni) Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciò può comportare conseguenze: se il gene trasferito è un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto, può risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido Questa è la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi

92 Traslocazioni cromosomiche
Deregolazione dell’espressione genica: overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene Espressione di una proteina di fusione: giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomi

93 Specificità delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia, si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale: esempio tipico la t(15;17) della APL Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(14;18) nel linfoma follicolare, ma è presente anche in altri NHL e nei soggetti normali, sebbene il numero di copie sia molto basso

94 Traslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piu’ fattori di trascrizione, ma anche tirosin o serin protein chinasi, recettori di membrana cellulare, fattori di crescita, con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo cellulare

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96 Gene di fusione BCR/ABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste nelle cellule normali Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9, con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta “breakpoint cluster region” (BCR) perché è in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma. Il gene di fusione BCR/ABL è specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che l’alterazione cromosomica Ph1 e genica (BCR/ABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica, eritrocitica, piastrinica e linfocitica B)

97 LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
Nelle leucemie acute mieloblastiche, la traslocazione t(8;21) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida. LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2) Nelle leucemie acute mieloblastiche, con traslocazione t(8;21) ne consegue il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di un trascritto e di una proteina ibrida tra questi due geni. La remissione clinica, ematologica e citogenetica delle LAM con t(8;21) non si accompagna nella maggior parte dei casi alla remissione molecolare. In alcuni pazienti lungo-sopravviventi senza segni di malattia permane una piccola quota di trascritto (anche dopo trapianto allogenico), senza che si verifichi la recidiva. Il riscontro di MRD in questo tipo di leucemia non assume pertanto un rilievo clinico-prognostico. Il prodotto della t(8;21) non avrebbe un ruolo biologico indipendente nella comparsa del fenotipo leucemico, ma necessiterebbe dell'aggiunta di un secondo stimolo oncogeno. 97

98 t(15;17)(q22;q21) Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA La traslocazione t(15;17) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dell'acido retinoico (RAR) sul cromosoma 17, ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15.

99 Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4 Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11 LEUCEMIA ACUTA MIELOMONOCITICA Con eosinofili Inv(16)(p13q22) 99

100 LIMITI DELLA CITOGENETICA CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia è strettamente correlato alla quantità e alla qualità delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare

101 LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce l’origine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi - Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici - Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme all’immunofenotipo - Valuta la risposta ad una terapia evidenziando un’eventuale Malattia Minima Residua - Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo osseo da donatore di sesso diverso

102 FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi - Elevata specificità, sensibilità e rapidità Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi

103 ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni cromosomiche Frequenza (%) Citogenetica FISH Trisomia 12 10-15 15 13q14 10 53 11q21 8 19 6q 6 9 17p 4

104 MALATTIA MINIMA RESIDUA: DEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche. Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva.

105 Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche Sensibilità Morfologia bassa sensibilità e 5% specificità Immuno scarsa specificità % Fenotipizzazione Citogenetica lento, richiede 1% preparazione metafasi FISH lento, applicabile ai nuclei in 0.3-5% Iinterfase PCR conoscenza delle sequenze >0.001% falsi positivi