FLUIDI BIOLOGICI Sangue Volume totale Componenti

Presentazione sul tema: "FLUIDI BIOLOGICI Sangue Volume totale Componenti"— Transcript della presentazione:

1 FLUIDI BIOLOGICI Sangue Volume totale Componenti
7-8% del peso corporeo L di sangue in un individuo di 70 Kg Componenti Parte corpuscolata: eritrociti, leucociti, piastrine Parte liquida: plasma Coagulazione / Sedimentazione Valore ematocrito (%) = Componente Valori Eritrociti U *1012/L D *1012/L Reticolociti 25-100*109/L Piastrine *109/L Globuli Bianchi 4-10*109/L Granulociti neutrofili 2-7*109/L Granulociti eosinofili *109/L Granulociti basofili 1-2*106/L Linfociti 1-4.5*109/L Monociti *109/L X 100 volume corpuscoli volume totale

2 FLUIDI BIOLOGICI Sangue Valore ematocrito (%) = X 100
volume corpuscoli volume totale Valore ematocrito (%) = 45% Normale < 45% Anemia > 45% Policitemia > 45% Leucemia

3 FLUIDI BIOLOGICI Plasma e Siero Plasma Siero 90% di Acqua
10% di Sostanze solide Sostanze solide del plasma Proteine semplici Albumina (69 kDa), 45 g/L, 21.8 mmHg Globuline (a1, a2, b, g) (140 kDa), 25 g/l, 6.0 mmHg Fibrinogeno (400 kDa), 3 g/l, 0.2 mmHg Proteine coniugate (lipoproteine e glicoproteine) Enzimi Sali inorganici Siero Plasma senza Fibrinogeno

4 Proteine plasmatiche e Diagnosi clinica
FLUIDI BIOLOGICI Proteine plasmatiche e Diagnosi clinica Il plasma è uno tra i fluidi biologici analizzati più frequentemente a scopi diagnostici perché riflette l’attività di altri organi e la sua composizione non è modificata sostanzialmente da una propria attività metabolica La misura delle variazioni dell’attività di enzimi plasmatici può essere utilizzata, oltre che per la diagnosi, anche a scopo prognostico

5 Proteine plasmatiche e Diagnosi clinica
FLUIDI BIOLOGICI Proteine plasmatiche e Diagnosi clinica Proteine semplici Cirrosi epatica: diminuita sintesi di albumina Nefrosi: eliminazione di albumina nelle urine Anomalie ereditarie: incapacità di sintetizzare proteine plasmatiche (fibrinogeno, g-globuline, albumina) Enzimi Tumore prostatico: aumentata fosfatasi alcalina Pancreatiti: aumentata amilasi Distrofia muscolare: aumentate aldolasi e creatina chinasi Infarto del miocardio: aumentate GOT, LDH, MDH Danni epatici: aumentati isoenzimi del LDH

6 FLUIDI BIOLOGICI Urina Volume delle 24 ore nell’adulto
1200 – 1500 mL (600 mL < normali < 2000 mL) Poliuria (> 2000 mL / 24 ore) Diabete insipido (mancato riassorbimento tubulare dell’acqua) Insufficienza renale cronica (persa capacità di concentrare l’urina) Oliguria (< 600 mL / 24 ore) Disidratazione Glomerulonefrite

7 FLUIDI BIOLOGICI Urina Colore Limpidezza / Torbidità pH
Normale: giallo-paglierino, giallo-ambra, giallo Anormale: giallo-verdognolo, rosso-giallastro, rosso-bruno, … Limpidezza / Torbidità pH Normalmente acido (5.5 – 6.5) pH < 5.0: acidosi diabetica, metabolica, respiratoria pH > 7.0: alcalosi metabolica, respiratoria Densità o peso specifico Normalmente d = – 1.022 40 – 70 g / 24 ore (urea, creatinina, cloruri, fosfati, solfati) Valori elevati: diabete mellito (aumento di glucosio), oliguria Valori bassi: diabete insipido, nefrite cronica

8 FLUIDI BIOLOGICI Bile Liquido denso e viscoso di colore variabile dal giallo, al bruno, al verde coinvolto nel metabolismo dei lipidi (sali biliari) Volume giornaliero di 500 – 1000 mL Produzione nel fegato / Accumulo nella colecisti Prelievo mediante sondaggio duodenale (bile coledoica, colecistica, epatica) Studio della funzionalità della colecisti e delle vie biliari Cristalli di colesterolo (calcolosi biliare di colesterolo)

9 FLUIDI BIOLOGICI Liquido amniotico Volume
~ 25 mL alla 10a settimana di gravidanza 800 – 1000 mL al termine Alla sua formazione contribuiscono: Urine fetali (dalla 20a settimana) Secreti dell’albero tracheo-bronchiale, delle ghiandole salivari, della mucosa buccale Secrezioni dell’apparato respiratorio (fasi avanzate) L’analisi del liquido amniotico è di grande importanza dal punto di vista clinico perché consente di studiare lo stato e lo sviluppo del feto

10 Analiti nel liquido amniotico
FLUIDI BIOLOGICI Analiti nel liquido amniotico Alfa-fetoproteina (AFP) Diminuisce a partire dalla 14a settimana fino alla fine della gravidanza Utilizzata per determinare con una certa accuratezza l’età del feto Valori elevati di AFP sono presenti nel caso di difetti del tubo neurale Fosfolipidi (fosfatidilcolina / sfingomielina) Indice di maturità polmonare fetale Valore massimo alla 38a settimana Creatinina Indice di maturità fetale (sviluppo delle masse muscolari e maturazione del rene) Valore soglia di maturità fetale: 2 mg / dL

11 FLUIDI BIOLOGICI Saliva
Liquido viscoso, opalescente prodotto dalle ghiandole salivari Volume giornaliero di 1000 – 1500 mL pH compreso tra 6 e 7 Principali componenti organici: ptialina (a-amilasi) e mucina Attraverso le ghiandole salivari vengono escrete sostanze di natura farmacologica, sostanze tossiche (es. sali di mercurio e piombo), ormoni (es. cortisolo) e virus (es. rabbia)

12 FLUIDI BIOLOGICI Versamenti cavitari
Raccolte patologiche di liquido in cavità preformate rivestite di epitelio Principali cavità: pleurica, peritoneale, pericardica I trasudati si formano per ragioni idrodinamiche che provocano fuoriuscita della parte liquida del sangue (es. ascite nella cirrosi epatica) Gli essudati si formano per vasodilatazione attiva dei capillari in corso di processi infiammatori. Si ha fuoriuscita non solo di plasma, ma anche di cellule (leucociti) Analisi di versamenti cavitari Ricerche batteriologiche Ricerche parassitologiche (es. echinococco nella cavità pleurica) Ricerca di cellule neoplastiche

13 CAMPIONAMENTO, PRELIEVO E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI BIOLOGICI
Queste fasi sono molto importanti da un punto di vista analitico La attendibilità del dato analitico finale, quindi la sua qualità, dipende non solo dalla “bontà” del metodo utilizzato e dalla qualità di esecuzione del metodo stesso, ma anche dalla appropriatezza delle modalità di campionamento, prelievo e conservazione dei campioni, che devono quindi essere standardizzate Queste fasi determinano la variabilità pre-analitica di un metodo

14 CAMPIONAMENTO Scelta della fase del ciclo biologico più opportuna per la raccolta dei campioni La raccolta dei campioni deve essere effettuata nelle condizioni più idonee per fornire dati attendibili Le condizioni ottimali, inoltre, dovrebbero essere relativamente facili da riprodurre perché in esse vengono definiti i valori di riferimento Tali condizioni variano a seconda del tipo di indagine da effettuare In molti casi la condizione ideale è lo stato basale: paziente a riposo, a digiuno da ore, esente dall’assunzione di farmaci o sostanze che potrebbero interferire con qualche processo metabolico Nello screening delle portatrici di distrofia muscolare di Duchenne il prelievo di sangue viene effettuato nel tardo pomeriggio, dopo una giornata di lavoro, perché in queste condizioni l’attività sierica della creatinfosfochinasi (CK) risulta più elevata rispetto ai controlli sani, mentre in condizioni basali rientra solitamente nell’intervallo di riferimento

15 CAMPIONAMENTO Si adottano diverse modalità di campionamento a seconda dello scopo per cui il prelievo viene eseguito Indagine diagnostica Monitoraggio dell’azione di farmaci o di terapie fisiche Prove funzionali da carico Le condizioni basali non sono sufficienti per standardizzare il prelievo Altri fattori possono modificare significativamente qualche parametro biochimico o ematologico Esercizio muscolare (innalzamento LDH per 24 ore) Stato ansioso (aumento leucociti, alterazione equilibrio acido-base) Postura ed uso del laccio emostatico

16 CAMPIONAMENTO Monitoraggio dell’azione di farmaci
Analisi del farmaco circolante (prelievi ad intervalli definiti in base alla farmacocinetica) Monitoraggio degli effetti terapeutici (stato basale) Monitoraggio degli eventuali effetti tossici (stato basale) Prove funzionali da carico Curva da carico con glucosio per via orale per valutare il metabolismo dei glucidi (1 prelievo basale + 5 prelievi ogni 30 min) Glicemia post-prandiale per accertare sospetto diabete (prelievo 2 ore dopo un pasto ricco di glucosio)

17 PRELIEVO Sangue venoso, capillare, arterioso Sangue venoso
Idoneo per la maggior parte delle analisi Prelevato dalle vene dell’avambraccio e della regione anteriore del gomito Prelevato con siringhe sterili in provette di plastica o in vacutainer di vetro siliconato Sangue capillare In realtà è un misto di sangue arterioso, capillare, venoso e liquido interstiziale Prelevato dal lobo dell’orecchio o dalla falange distale mediante lancetta sterile per puntura cutanea Usato quando occorre un piccolo volume di sangue (< 1 mL), nei neonati e bambini piccoli, ustionati, ecc. Sangue arterioso Utilizzato per determinare la concentrazione dei gas ematici (O2, CO2) e il pH, cioè parametri misurati per valutare l’equilibrio acido-base del sangue Prelevato da arterie del braccio o dalla femorale mediante siringhe sterili

18 PLASMA o SIERO ? Quando si deve analizzare la parte liquida del sangue, si potrebbero utilizzare indifferentemente plasma o siero, tranne quando si deve determinare il fibrinogeno Una tendenza è quella di utilizzare il plasma come oggetto di studio più “fisiologico” rispetto al siero Infatti, il processo della coagulazione in vitro coinvolge non solo la parte corpuscolata ed i fattori della coagulazione ma, attraverso i danni subiti dalle cellule inglobate nel coagulo, induce la liberazione di parte del contenuto cellulare, con conseguente variazione significativa di alcuni parametri biochimici nel siero rispetto al plasma D’altra parte, per ottenere il plasma (per impedire la coagulazione) è necessario aggiungere sostanze chimiche che a loro volta potrebbero alterare il campione Si potrebbe anche effettuare la defibrinazione del sangue con metodo fisico (agitazione continua del sangue a contatto con bacchette o palline di vetro fino a deplezione completa di fibrinogeno e di piastrine). Questo sistema è però dispendioso e non applicabile all’analisi di routine. È riservato alla preparazione di materiale per il controllo di qualità in ematologia e alla ricerca clinica

19 PLASMA Per molte indagini ematologiche e per le emocolture il sangue deve essere mantenuto fluido, evitando così la coagulazione Le indagini riguardanti la struttura e/o le funzioni delle cellule ematiche richiedono che le cellule stesse restino inalterate La scoagulazione del sangue si ottiene con l’aggiunta di sostanze chimiche (anticoagulanti) che esercitano il loro effetto con meccanismi diversi: Chelanti del calcio Eparina Normalmente le provette in cui si raccoglie il sangue sono già predisposte e contengono una quantità stabilita di anticoagulante in forma solida o di soluzione concentrata. È indicato il livello corrispondente alla quantità di sangue da raccogliere in modo da ottenere la concentrazione finale ottimale di anticoagulante L’uso improprio o inaccurato degli anticoagulanti può contribuire ad aumentare la variabilità pre-analitica

20 ANTICOAGULANTI Chelanti del calcio Eparina
Legano in modo irreversibile gli ioni Ca2+ presenti nel sangue indispensabili in varie fasi della cascata emocoagulativa L’EDTA (acido etilendiamminotetracetico) è il più usato (sale disodico oppure bi- o tripotassico) È necessario per studi morfologici delle cellule ematiche Il citrato di sodio viene utilizzato per la determinazione della VES e per studi di funzionalità piastrinica, in cui EDTA ed eparina non possono essere usati perché provocano aggregazione piastrinica Un altro chelante del calcio è una miscela di ossalati di ammonio e di potassio Eparina Agisce come cofattore dell’antitrombina III, in combinazione con la quale inattiva rapidamente la trombina e il fattore X (dieci) attivato L’eparina è molto usata ma NON è utilizzabile per studi morfologici perché conferisce alle cellule una colorazione scura

21 SIERO Se l’analisi viene effettuata sul siero il campione di sangue viene lasciato 1 – 2 ore a T.A. per consentire la formazione del coagulo Viene poi centrifugato a 3000 g (forza centrifuga relativa) per 10 min per consentire il recupero del maggiore volume possibile di siero Spesso, per facilitare la separazione tra coagulo e siero, le provette in cui il sangue viene raccolto contengono sostanze con peso specifico intermedio tra quelli delle cellule ematiche e del siero, ad esempio perline di polistirene che durante la centrifugazione si dispongono tra coagulo e siero Il siero deve essere separato dal coagulo il più presto possibile per evitare il rilascio di sostanze dalle cellule, che potrebbero alterarne la composizione

22 ANTICOAGULANTI Tappo grigio: ossalato, fluoruro e idoacetato Tappo giallo: tubo sterile senza anticoagulanti Tappo verde: eparina Tappo rosso: per siero Tappo rosso-nero: per siero con gel-separatore Tappo blu: citrato Tappo lavanda: EDTA

23 Vacutainer tube® Red top Red-Grey Mottled top Gold top Light green top
Contains: Effect on specimen: Uses: None Blood clots and serum separated by centrifugation Chemistries, Immunology, serology,Blood Bank Contains: Effect on specimen: Uses: Serum separating tube with clot activator Form clot quickly, separate the serum at the bottom Blood type screening and chemistries Gold top Light green top Contains: Effect on specimen: Uses: Separating gel and clot activator gel at the bottom to separate blood from serum on centrif. Serology, endocrine, immunology, HIV Contains: Effect on specimen: Uses: Plasma saeparating tube Na-Heparin Plasma separated at the bottom of the tube Chemistries

24 Vacutainer tube® Lavender/Purple top Light blue top Dark green top
Contains: Effect on specimen: Uses: EDTA (liquid form) Forms calcium salt to remove calcium Hematology and Blood Bank Contains: Effect on specimen: Uses: Sodium citrate Forms calcium salt to remove calcium Coagulation tests, tube filled 100% Dark green top Dark blue top Contains: Effect on specimen: Uses: Sodium heparin or litium heparin inactivates thrombin ammonia,lactate,lithium level, Contains: Effect on specimen: Uses: Sodium heparin or Na2EDTA Forms calcium salts Toxicology and drugs test

25 Vacutainer tube® Light gray top Yellow top Tan/brown top Black top
Contains: Effect on specimen: Uses: Sodium fluoride potaxium oxalate Antyglycolitic agent to preserve glucose Lithium level, glucose Contains: Effect on specimen: Uses: ACD (acid-citrate-dextrose) Complement inactivation Paternity tests, DNA studies Tan/brown top Black top Contains: Effect on specimen: Uses: Sodium heparin inactivates thrombin serum lead determination Contains: Effect on specimen: Uses: Sodium citrate (buffered) Forms calcium salts Westergren sedimentation rate

26 Vacutainer tube® Orange top Contains: Thrombin Effect on specimen:
Uses: Thrombin Quickly clots blood STAT chemistries blood

27 EMOLISI Rottura dei globuli rossi con conseguente liberazione di emoglobina nel siero o nel plasma Visibile macroscopicamente perché il colore passa dal giallo al rosato- rosso L’emolisi è una delle ragioni più frequenti di inadeguatezza qualitativa dei campioni di sangue Errori di tipo analitico-metodologico Errori dovuti a cause fisiologiche

28 Interferenze di tipo analitico-metodologico
EMOLISI Interferenze di tipo analitico-metodologico Interferenze fisiche Assorbimento dell’emoglobina attorno a 405 nm e a nm che interferisce su analisi colorimetriche Errori controllabili mediante strumenti che effettuano letture a due lunghezze d’onda Interferenze chimiche Inibizione di reazioni di diazotazione o di reazioni enzimatiche utilizzate per la determinazione di certi analiti

29 Interferenze di tipo fisiologico
EMOLISI Interferenze di tipo fisiologico Sono dovute ad ineguale distribuzione di molte sostanze tra la parte liquida e la parte corpuscolata del sangue Ad esempio, glucosio, colesterolo totale, esteri del colesterolo, Na+, Cl- hanno concentrazione più elevata nel plasma che nei globuli rossi, perciò nei casi di emolisi massiva si ha una diluizione di questi componenti Al contrario (più frequentemente e con maggiore rilevanza) enzimi quali fosfatasi acida, transaminasi, lattato deidrogenasi e ioni quali K+ hanno concentrazione più elevata all’interno degli eritrociti piuttosto che nel plasma, perciò in caso di emolisi si ha una sovrastima

30 Analiti Globuli rossi Plasma
EMOLISI Livelli di concentrazione di alcuni analiti nei globuli rossi e nel plasma Analiti Globuli rossi Plasma 74,0 40,0 2,5 139 16 100 52 19 58,000 500 90,0 8,0 4,6 194 129 140 4,4 104 26 360 25 Glucosio mg/dl Azoto non proteico mg/dl Acido urico mg/dl Colesterolo totale mg/dl Colesterolo esteri mg/dl Na+ mmol/l K+ mmol/l Cl- mmol/l HCO3- LDH mU/ml GOT(AST) mU/ml

31 CAUSE DI EMOLISI Biologiche Meccaniche Chimiche o osmotiche Fisiche
Anemie emolitiche per difetti endogeni o esogeni Endogeni: difetti morfologici o deficienze di enzimi endoeritrocitari Esogeni: anticorpi (emolisine) acquisiti in seguito a reazioni trasfusionali, anemie emolitiche autoimmuni, infezioni, assunzione di farmaci Meccaniche Uso di aghi troppo sottili e/o aspirazione eccessiva durante il prelievo Centrifugazione a velocità troppo elevata Chimiche o osmotiche Presenza di disinfettanti, detergenti, acqua o altre sostanze chimiche sulla cute, nell’ago o nella provetta Fisiche Conservazione prolungata del campione in condizioni non idonee, soprattutto di temeperatura (troppo elevata o troppo bassa) Ad esempio, il congelamento provoca cristallizzazione dell’acqua endoeritrocitaria e rottura delle membrabe

32 TRATTAMENTO PRE-ANALITICO
Invio Reparti clinici Accettazione Ambulatori utenza esterna Spedizione intra o extramurale Ricezione controllo selezione Ematologia microbiologia emocoagulazione ecc... Chimica Centrifugazione Separazione siero-plasma Conservazione +4°C; -20°C Consegna agli analisti Eventuale deproteinizzazione Eventuale conservazione

33 CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI
Idealmente il campione biologico dovrebbe essere analizzato immediatamente Nella realtà questo accade solo per le urgenze, mentre in tutti gli altri casi i campioni vengono conservati per un certo tempo prima dell’analisi per ragioni economiche ed organizzative Inoltre, può essere necessario conservare i campioni per ripetere l’analisi o effettuare analisi diverse successivamente Un altro fattore critico da tenere in considerazione, per il suo possibile effetto sulla variabilità pre-analitica, è il trasporto dei campioni dal luogo di prelievo al laboratorio di analisi

34 CAUSE DI ALTERAZIONE DEI CAMPIONI
I campioni biologici possono alterarsi per cause diverse ed in tempi diversi Schematicamente: Cause di natura fisica Tempi relativamente lunghi Cause di natura chimico-fisica Tempi brevi o medi Cause di natura biochimica Tempi brevissimi o brevi e/o biometabolica In realtà si può avere sovrapposizione di cause

35 CAUSE DI ALTERAZIONE DEI CAMPIONI
Cause di natura fisica Riguardano prevalentemente cambiamenti di fase (liquido-solido, liquido-vapore) Evaporazione Provoca aumento della concentrazione degli analiti, quindi inficia l’accuratezza della misura Dipende da temperatura, umidità relativa, ventilazione, geometria e volume di riempimento del contenitore Solubilità Sangue, siero e plasma hanno una componente proteica che funge da stabilizzatore Nell’urina abbassamenti di temperatura a valori ambiente o di frigorifero (+4°C) e variazioni di pH possono ridurre la solubilità (precipitazione) Adsorbimento Elementi oligominerali (metalli) possono essere adsorbiti sulla parete dei contenitori. Sono necessari materiali inerti Desorbimento Cessione di materiale dai contenitori, in particolare metalli. Il vetro presenta questo problema, polipropilene e teflon sono più appropriati

36 CAUSE DI ALTERAZIONE DEI CAMPIONI
Cause di natura chimico-fisica Includono processi chimico-fisici in grado di indurre modificazioni nella composizione o nella struttura di alcuni costituenti biochimici Fotolisi Dovuta all’interazione della luce solare con molecole fotoassorbenti che vengono alterate (ad es. bilirubina, composti porfirinici, vitamine) Denaturazione Modificazione sterica o strutturale di siti attivi di proteine enzimatiche o recettoriali tissutali Può dipendere da tempo, temperatura, pH, composizione della matrice biologica Aggregazione A carico di proteine tra cui si formano legami a basso contenuto energetico: ponti disolfuro, legami idrogeno, forze di van der Waals ed elettrostatiche Alterazione delle caratteristiche di legame delle proteine stesse

37 CAUSE DI ALTERAZIONE DEI CAMPIONI
Cause di natura biochimica e/o biometabolica In vivo è attivo un sistema di regolazione omeostatica che mantiene costante la concentrazione dei metaboliti In vitro questo sistema manca Inoltre, cambiano la temperatura e la natura delle pareti del “contenitore” e si ha contatto con l’aria Anche in poche ore si possono avere drastici aumenti o decrementi di concentrazione di alcuni analiti

38 CAUSE DI ALTERAZIONE DEI CAMPIONI
Cause di natura biochimica e/o biometabolica Variazione concentrazione acido lattico in vitro a Tamb KF Variazione concentrazione ammonica plasmatica in vitro a Tamb con anticoagulanti EDTA eparina

39 CAUSE DI ALTERAZIONE DEI CAMPIONI
Provvedimenti Conservazione alla temperatura ottimale Conservazione al buio Liofilizzazione Modificazione del pH Aggiunta di sostanze chimiche per evitare fenomeni indesiderati (ad es. sostanze che impediscono l’ossidazione dei gruppi –SH e la formazione di ponti disolfuro, quali il ditiotreitolo, DTT)

40 S2totale = S2pre-analitica + S2analitica + S2post-analitica
VARIABILITÀ GLOBALE La variabilità globale di un test di laboratorio è espressa in termini statistici dalla varianza totale S2totale = S2pre-analitica + S2analitica + S2post-analitica

41 VARIABILITÀ PRE-ANALITICA
La variabilità pre-analitica dipende da condizioni che possono influenzare: Composizione del materiale biologico del soggetto Campionamento Variabilità biologica (età, sesso, razza) Composizione del materiale biologico come conseguenza delle modalità di effettuazione del prelievo (ad es. emolisi) Composizione, proprietà o morfologia del materiale biologico come conseguenza del trattamento immediato (ad es. anticoagulanti) Composizione, proprietà o morfologia del materiale biologico come conseguenza della conservazione

42 VALORI DI RIFERIMENTO Per alcune patologie, la sola presenza dell’analita in oggetto costituisce la conferma che la patologia in esame è in atto. In genere però una patologia si traduce in una semplice variazione del parametro in esame, quindi il risultato analitico deve essere confrontato con i valori “normali” per la popolazione, di solito indicati come “valori di riferimento”. Per essere utile dal punto di vista diagnostico, un valore di riferimento deve spesso essere valutato all’interno di un solo settore della popolazione, che sia più “omogeneo” (es. con simili caratteristiche genetiche ed ambientali) e confrontabile con il paziente in esame. In questo modo il valore di riferimento acquista un rilevante “valore predittivo”.

43 VALORI DI RIFERIMENTO Quali parametri influenzano i valori di riferimento? - Fattori genetici. Molte anomalie nel metabolismo sono legate a fattori genetici. Criteri distintivi importanti sono i gruppi sanguigni e gli antigeni di istocompatibilità. - Fattori fisiologici. Molte condizioni fisiologiche determinano variazioni consistenti in alcuni parametri biochimici. Età (livelli ormonali, azotemia, colesterolo…) Sesso (sideremia, acido urico, livello ormonale,gonadotropine, azotemia…) Eccesso di peso (colesterolo, trigliceridi…) Ora e giorno del prelievo (variazioni periodiche del colesterolo, catecolamine, sideremia…) Modalità del prelievo (bicarbonati, proteine…) Postura (attraverso la diversa distribuzione dell’acqua nell’organismo influenza calcio, proteine, colesterolo…) Spesso problematico è il caso dei bambini, specialmente durante i primi giorni o le prime settimane di vita, in quanto esistono parametri fisiologici il cui range “normale” varia molto rapidamente col passare del tempo. - Fattori esogeni. Includono l’alimentazione (colesterolo, trigliceridi), l’attività fisica o professionale, il fumo, l’alcool, l’assunzione di farmaci…

44 Distribuzione gaussiana - Distribuzione log-gaussiana
VALORI DI RIFERIMENTO Convenzionalmente, si definiscono “normali” i valori che comprendono il 95% dei risultati ottenuti in una popolazione apparentemente sana, supponendo con ciò che ogni specie tenda a contenere le variazioni delle grandezze biologiche entro certi limiti. L’intervallo corrispondente è l’intervallo di riferimento. Il modo con cui si ricavano i valori “normali” dipende anche dal tipo di distribuzione statistica del parametro misurato nella popolazione: Distribuzione gaussiana - Distribuzione log-gaussiana - Distribuzione non classificabile o irregolare (es. distribuzione bimodale…)

45 VALORI DI RIFERIMENTO Distribuzione gaussiana. Se il parametro in esame presenta una distribuzione gaussiana all’interno della popolazione, l’intervallo di riferimento è quello compreso entro due deviazioni standard dalla media della popolazione. Le percentuali in oggetto sono comunque arbitrarie. E’ stato infatti proposto anche un criterio in base al quale i valori nei quali rientra l’80% della popolazione sarebbero “normali”, i valori dall’80% al 98% dubbi ed i valori nei quali rientra il 2% della popolazione sarebbero patologici. 95% 2,5% 2,5% - 2s s

46 VALORI DI RIFERIMENTO Distribuzione log-gaussiana. Spesso la distribuzione si presenta asimmetrica rispetto ad una distribuzione gaussiana con una maggiore percentuale di valori elevati. E’ abbastanza comune che in questo caso la distribuzione sia assimilabile ad una gaussiana se il diagramma viene costruito utilizzando il logaritmo del parametro in esame (es. una concentrazione) piuttosto che il parametro stesso. X Log X

47 VALORI DI RIFERIMENTO 2,5% 95% 2,5% nella popolazione Frequenza
Per distribuzioni non gaussiane e non riconducibili in alcun modo ad una gaussiana (ad esempio le distribuzioni bimodali) si utilizza il metodo dei percentili. La popolazione viene divisa in un certo numero di categorie in base al valore del parametro e se ne traccia il profilo sotto forma di istogramma. Su questo grafico si determinano i valori del parametro al di sopra (o sotto) i quali cade una percentuale prefissata della popolazione. 2,5% % ,5% Intervalli del parametro nella popolazione Frequenza

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49 INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO DI UN TEST

50 VALORI DI RIFERIMENTO La valutazione della capacità di un test di laboratorio di diagnosticare una determinata patologia (significato diagnostico) parte dall’esame delle differenze nel parametro in esame fra la popolazione sana e qualle malata, quindi dal confronto delle distribuzioni statistiche della grandezza nelle due popolazioni. Siccome il risultato del test è affetto da varianze dovute alla reale distribuzione della grandezza in esame che agli errori associati all’analisi, in generale esiste un certo grado di sovrapposizione fra i valori delle due popolazioni. La linea di demarcazione (valore discriminante) che classifica il test come positivo deve quindi venire scelta in modo oculato, in funzione di - forma della distribuzione nella popolazione normale e malata - dimensione e proporzioni delle popolazioni considerate - costo derivante da una decisione sbagliata

51 INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO DI UN TEST
Si definisce sensibilità clinica (positività) del test diagnostico la capacità del test di classificare come positivi gli individui veramente affetti dalla malattia. Essa viene comunemente espressa come: Sensibilità clinica = 100 VP/(VP + FN) dove VP (veri positivi) sono i risultati correttamente classificati dal test come positivi e FN (falsi negativi) sono i risultati di soggetti malati classificati erroneamente cone negativi (VP + FN sono ovviamente tutti i soggetti malati all’interno del campione esaminato). La specificità clinica (negatività) del test diagnostico è invece la capacità del test di classificare come negativi gli individui sani. Per analogia essa è data da: Specificità clinica = 100 VN/(VN + FP) dove VN (veri negativi) sono i risultati correttamente classificati dal test come negativi e FP (falsi positivi) sono i risultati di soggetti sani classificati erroneamente cone positivi (VN + FP sono ora i soggetti sani all’interno del campione esaminato).

52 INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO DI UN TEST
La somma delle due grandezze viene talvolta definita potenza diagnostica (assoluta) del test. sani malati sani malati sani malati TEST IDEALE Sensibilità clinica 100% Specificità clinica Potenza diagnostica 200% TEST INUTILE Sensibilità clinica 50% Specificità clinica Potenza diagnostica 100% TEST REALE Sensibilità clinica 50-100% Specificità clinica Potenza diagnostica %

53 INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO DI UN TEST
Nel caso reale la classificazione dei risultati come positivi o negativi passa attraverso la definizione di un punto di separazione (livello di normalità o “cut off”) che viene operativamente utilizzato per classificare i risultati come negativi o positivi. La scelta del valore specifico di “cut off”, che influenza sia la specificità che la sensibilità, dipende però dal particolare problema clinico considerato, dalla proporzione delle due popolazioni e dal costo relativo delle false attribuzioni positive o negative. sani malati “cut off” sani malati Sensibilità clinica = 100% specificità clinica bassa Sensibilità clinica bassa specificità clinica = 100%

54 INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO DI UN TEST
sani malati Il livello di normalità o “cut off” viene quindi scelto all’interno della zona di sovrapposizione fra le due popolazioni. Un altro parametro spesso utilizzato per definire le capacità di un test diagnostico è il valore predittivo o discriminante, dato dalla: Valore predittivo = 100 VP/(VP + FP) che indica quindi la percentuale dei casi positivi che risulta effettivamente affetta dalla malattia. In pratica questo parametro dipende non solo dalla sensibilità e dalla specificità, ma manche dalla prevalenza (percentuale della popolazione affetta dalla malattia). Sensibilità 95% e specificità 95% danno un valore predittivo del 95% se la prevalenza è del 50%. Il valore predittivo scende però al 16% ed al 2% se la prevalenza è dell’1% e dello 0,1%.

55 INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO DI UN TEST