Approccio sperimentale allo studio

Presentazione sul tema: "Approccio sperimentale allo studio"— Transcript della presentazione:

1 Approccio sperimentale allo studio
Corso Animal Care, 2006 Approccio sperimentale allo studio di una patologia neurodegenerativa: la SLA. Marco Peviani Laboratorio di Neurobiologia Molecolare Dipartimento di Neuroscienze

2 Patologia neurodegenerativa: Sclerosi Laterale Amiotrofica
Animale da laboratorio / modello di patologia  La caratterizzazione del modello  Vantaggi  Limiti  Esempi applicativi

3 MALATTIE DEL MOTONEURONE
Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA) Morbo di Lou Gehrig Patologia neurodegenerativa progressiva

4 Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA)
Incidenza: 1-3 / 100’000 Prevalenza: 4-6 / 100’000 Onset: 4^ – 5^ decade di vita Sopravvivenza: 3-5 anni dalla diagnosi Sintomatologia: Debolezza muscolare, fascicolazioni, iperriflessia Difficoltà nella deglutizione e nell’articolazione del linguaggio Progressivo peggioramento dell’atrofia muscolare, infine paralisi Morte / Insufficienza respiratoria (muscoli toracici / diaframma) Farmaci disponibili: Riluzolo

5 Epidemiologia

6 ALS1

7 INDAGINI ISTOPATOLOGICHE
Medonca et al., Neur.Letters 2006 Migheli et al., Nature 1999

8 Cosa determina la morte del motoneurone?

9 Patologia neurodegenerativa  difficoltà per eseguire analisi / campioni post mortem
Patologia progressiva  cosa succede nel sistema nervoso durante il decorso della malattia? esistono alterazioni già a tempi precoci? Quando compaiono? cosa fa scatenare la malattia? esiste un punto in cui la neurodegenerazione è ancora reversibile? Patologia rara  difficoltà nel reperire casi da analizzare / trattare Terapie  non esistono terapie efficaci

10 Modello murino di SLA Topo SOD1G93A
SOD1 G93A (gene umano) Topo SOD1G93A

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12 Utilità del modello MODELLO ANIMALE
Patologia neurodegenerativa  difficoltà per eseguire analisi / campioni post mortem Patologia cronica  cosa succede nel sistema nervoso durante il decorso della malattia? esistono alterazioni già a tempi precoci? Quando compaiono? cosa fa scatenare la malattia? esiste un punto in cui la neurodegenerazione è ancora reversibile? MODELLO ANIMALE - possibilità di reperire campioni durante il corso della patologia - possibilità di eseguire analisi a tempi precoci (prima dell’insorgenza dei sintomi) - analisi dei meccanismi molecolari a base della malattia

13 Riduzione tono muscolare
Osservazione del fenotipo patologico Paralisi Alterazioni EMG Tremori Riduzione tono muscolare Deficit respiratori Birth Death 70 120 Days 170 Graphic representation of the clinical and neuropathological progression of disease in transgenic SOD1G93A mice

14 Analisi comportamento motorio
A partire da 70 giorni 2 volte alla settimana Test non parametrici  Attribuzione di punteggi (scores) sulla base di una osservazione del fenotipo Test parametrici  Misurazione di parametri quantitativi (peso/tempo/lunghezza…) Links: SITO JACKSON LAB.  Homepage: SITO ISOGENIC.INFO SITO eumorphia EMPReSS

15 Stadio non sintomatico
Lymbs adduction test (Tail suspension test / Extension reflex) Non parametrico Stadio non sintomatico Stadio avanzato della malatia Punteggio: 3

16 Parametrico 2. Peso corporeo (grammi)

17 Accelerazione costante
3. Rotarod test (secondi) Parametrico Accelerazione costante

18 3. Rotarod test (secondi)
Parametrico

19 4. Gait performance (centimetri) Parametrico
Luce Buio

20 5. Test della griglia (secondi)
Parametrico

21 5. Test della griglia (secondi)
Parametrico

22 6. Sopravvivenza (giorni)
Parametrico

23 Colture cellulari primarie
Prelievo tessuti Colture cellulari primarie Incrocio con altri animali transgenici Trattamenti in vivo Graphic representation of the clinical and neuropathological progression of disease in transgenic SOD1G93A mice

24 “lymbs adduction test” Riduzione tono muscolare
Prelievo tessuti Birth Death 70 120 Days 170 Impairment “test della griglia” Deficit “lymbs adduction test” Impairment “Rotarod test” Gait impairment Alterazioni EMG Tremori Paralisi Riduzione tono muscolare Pre-sympt. stage Sympt. stage End stage

25 Analisi istopatologiche Analisi di IHC
Analisi biochimiche Western/ Northern/ RT-PCR… proteomica  cinetiche enzimatiche Tessuti fissati Tessuti freschi Prelievo tessuti Analisi istopatologiche conta dei motoneuroni  micr. elettronico Analisi di IHC distribuzione di proteine di interesse

26 Analisi biochimica Accumulo di SOD1 mutata nel midollo spinale dei topi SOD1G93A al progredire della patologia Cheroni et al., Neur.Dis. 2005 Analisi proteomica degli aggregati di SOD Triton-insolubili, che si accumulano nei topi SOD1G93A Basso et al., JBC 2005 Attivazione di p38MAPK (fosforilazione) nel midollo spinale dei topi SOD1G93A Tortarolo, Veglianese et al., MCN 2003

27 Analisi al microscopio elettronico
Comparsa di vacuoli e mitocondri con struttura alterata nei motoneuroni dei topi SOD1G93A, già a tempi precoci Bendotti et al., J.Neur.Sc. 2001

28 Analisi della distribuzione di proteine di interesse
Attivazione di p38 MAPK nei motoneuroni dei topi SOD1G93A già a tempi precoci/colocalizzazione di p38 attivata con i motoneuroni che mostrano segni di degenerazione Tortarolo, Veglianese et al., MCN 2003

29 Up-regolazione di TNFa-R1 e TNFa-R2 nei motoneuroni dei topi SOD1G93A già a tempi precoci
Veglianese et al., MCN 2005

30 Screening di molecole potenzialmente terapeutiche
neuroni astrociti microglia Co-colture Colture cellulari primarie Screening di molecole potenzialmente terapeutiche

31 Tortarolo, Spaltro – Lab. Bendotti

32 meccanismo patologico
Incrocio con altri animali transgenici Identificazione proteina/pathway target Ruolo nella patologia? Ipotesi di meccanismo patologico TOPO SOD1G93A X Miglioramento? Modifica? Animale transgenico con up-regolazione della proteina/pathway Animale transgenico privato della proteina (KNOCK-OUT ) Animale transgenico come “tool di rilevazione”

33 Incrocio con topi transgenici per: XIAP (pathway anti-apoptotico)
Wootz et al., Exp.Cell.Res. 2006 Incrocio con topi Knock-out per: TNFa (pathway neuroinf.) Gowing et al., Neur.Dis. 2006 Rai (pathway anti-apoptotico) Peviani, Cheroni - Lab. Bendotti TNFa-R (pathway neuroinf.) Daleno - Lab. Bendotti Tools Topi NFL-YFP (Neurofilamenti) Topi Ub-GFP (pathway proteasoma) Cheroni – Lab. Bendotti

34 Neuroprotective agents for clinical trials in ALS
Trattamenti in vivo Neuroprotective agents for clinical trials in ALS Traynor et al., Neurology 2006 Targets in ALS: designing multidrug therapies Carrì, Grignaschi, Bendotti, TRENDS in Pharm. Sc. 2006 (USA) (Europa)

35 Trattamenti nel modello animale
Somministrazione cellule staminali

36   Modello con nr. < di copie
Limiti del modello Il roditore è un organismo diverso da quello umano Diversa anatomia (anche nel SNC) Diversa fisiologia Diverse dimensioni Gli animali da laboratorio non sono tutti uguali Differenze tra ceppi in-bred e ceppi out-bred Ceppi in-bred diversi hanno caratteristiche diverse [ Differenze di sesso (M/F)] Topo SOD1G93A vs UOMO UOMO (ALS1): mutazione in un allele della SOD1  patologia TOPO: serve overespressione della SOD1mutata per avere patologia (TOPO SOD1G93A – 20 copie del gene)   Topo SOD1 wild-type   Modello con nr. < di copie   Confronto con altri modelli (diverse mutazioni SOD; diverso transgene)

37 Identificazione targets
Limiti Patologia umana TERAPIA Modello animale Informazioni Validazione Test ipotesi Identificazione targets Limiti Altri modelli Altri sistemi