Spingere, tirare o …? Come aumentare/modificare l’amido?

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1 Spingere, tirare o …? Come aumentare/modificare l’amido?
Brute force is no substitute for understanding Come aumentare/modificare l’amido?

2 Rilevanza dell’amido * Cibo (wheat, rice, maize & potato) >109 t/yr
* Additivo in prodotti per consumo umano (farmaci…) * Usi industriali: (cartaria, tessile, estrattiva …) 7x107 t/yr * Etanolo… E’ amido purificato (separato dal resto) The UK alone consumes approximately 880,000 tonnes of starch annually, 3/4 of which is eaten, while the rest is destined for industry. Starch and its derivatives are already widely employed in the manufacture of paper, textiles and adhesives, and due to their biodegradable and renewable nature they are increasingly being considered as an environmentally-friendly alternative to the use of synthetic additives in other products, including plastics, detergents, pharmaceutical tablets, pesticides, cosmetics, oil-drilling fluids…

3 Uso dell’amido nell’industria cartaria:
Starch Technology Very comprehensive website on starch technology, raw materials, properties, uses and extraction. The largest users of starch in the EU (30 %) are the paper, cardboard and corrugating industries. Other important fields of starch application are textiles, cosmetics, pharmaceuticals, construction and paints. In the medium and long run starch will play an increasing role in the field of “renewable raw materials” for the production of biodegradable plastics, packaging material and moulds. Uso dell’amido nell’industria cartaria: Paper industry is one of the largest users of starch. Starch is, in fact, the third most prevalent raw material component in paper, only surpassed by cellulose fiber and mineral filler. Depending on the type of paper produced, starch content in the final products may be as high as 10% by paper weight. Starch used in paper manufacture is generally found in three application areas which are wet end internal sizing, surface sizing and coating In Germany alone the paper and adhesives industry require 500,000 tonnes of highly purified amylopectin each year. Then there is the textile industry too, which uses the starch to glaze threats prior to weaving. The food industry is also relevant.

4 ~70 Mt di amido nel 2010; una crescita annua del 4%
~70 Mt di amido nel 2010; una crescita annua del 4%

5 Amylopectin is not soluble in water.
Starch is made of about 70% amylopectin and 30% amylose by weight (la proporzione dipende dalla coltura, varietà, stadio…) Amylopectin Amylopectin is not soluble in water.  addensante (aumenta la viscosità) L’amilopectina è un addensante, perchè aumenta la viscosità della soluzione, ingombrante com'è essendo ramificata. Ma non è un gelificante, come invece l'amilosio, che essendo lineare può legarsi ad altre molecole e formare un reticolo e gelificare intrappolando l'acqua. Large and highly branched Branched polymer with linear streches with α(1→4) glycosidic bonds and branches with α(1→6) bonds every 24 to 30 glucose units. Contains 2,000 to 200,000 glucose units

6 Amylose is soluble in water, assumes a spyral shape in solution
Linear polymer, units Amylose is soluble in water, assumes a spyral shape in solution  Gelificante Amylose starch is less readily digested than amylopectin (why?)  dal punto di vista nutrizionale diluisce il carico da glucosio ed è interessante per i diabetici Biogenesis of potato starch granules

7 L’industria chiede sostanze arricchite (e.g. solo amilopectina).
L’industria chiede sostanze arricchite (e.g. solo amilopectina). Purificabili con procedimenti industriali (costosi).  è possibile ottenere amidi modificati per mezzo di mutanti spontanei o transgenici (alterando GBSS, SSI, I & III …).

8 High Amylopectin High Amylose
National Center for Genetic Engineering and Biotechnology Thailand

9 Waxy corn: 100 % amylopectin, normal corn 75 % amylopectin
Varietà con un contenuto di amilosio/amilopectina alterato esistono già per numerosi organismi: Waxy mutants (maize, rice, cassava, broad bean, pea, wheat, barley, potato…, even Chlamydomonas) present little or no amylose. Waxy corn: 100 % amylopectin, normal corn 75 % amylopectin High amylopectin maize mutants Waxy corn is not new; it was found in China in The waxy trait is controlled by a single recessive gene, the wx gene. All’estremo opposto: Amylomaize: a unique corn starch with high (>50%) amylose. Similar mutants in cassava…

10 Introduzione delle patate OGM per uso industriale e nuovi scenari nei materiali ecologici A cura di Rossella Gigli E' notizia recente che la BASF, in collaborazione con l'olandese AVEBE, sta lavorando allo sviluppo di patate geneticamente modificate al fine di produrre tuberi con livelli maggiori di amido, soprattutto nella tipologia molecolare dell'amilopectina. Queste patate, come la già autorizzata Amflora, aprono interessanti scenari nel settore degli impieghi non-food della fecola di patate.  ELENCO DEGLI USI (interessante)

11  15 years to get approval in the EU…
Due pesi, due misure… Amflora potato: starch consists almost solely of amylopectin Ottenuta nel ‘94 tramite antisenso contro un’isoforma di GBSS. Prima applicazione del 1996  15 years to get approval in the EU… Visser RG, Somhorst I, Kuipers GJ, Ruys NJ, Feenstra WJ, Jacobsen E. (1991) Inhibition of the expression of the gene for granule-bound starch synthase in potato by antisense constructs. Mol Gen Genet. 225: B. Kull et al.: Genetic engineering of potato starch composition: inhibition of amylose biosynthesis in tubers from transgenic potato lines by expression of antisense sequences of the gene for granule-bound starch synthase. (1995) J. Genet. & Breed. 49: 69-76 Proof of concept:

12 Super-patata del Fraunhofer Inst.
Muth J, Hartje S, Twyman RM, Hofferbert HR, Tacke E, Prüfer D. (2008) Precision breeding for novel starch variants in potato. Plant Biotechnol J. 6: Super-patata del Fraunhofer Inst. “This fall (2009), 100 tonnes of the new super potato that exclusively produces amylopectin were harvested.” Forse che queste non sono modificazioni genetiche? Same phenotype, essentially same genotype (loss of function)…

13 Ingegneria metabolica per aumentare l’amido
Oltre alla composizione (amylose vs. amylopectin) è possibile modificare ed in particolare aumentare la quantità di amido? Diversi gruppi hanno provato ad alterare gli enzimi della via biosintetica. I risultati? Modesti, nel migliore dei casi, o non riproducibili Un esempio storico consiste nell’uso di una ADP-glucosio PPasi desensitizzata rispetto all’inibitore a feedback 3-PGA (Stark et al., 1992), ma questi risultati non hanno potuto essere riprodotti da un altro gruppo (usando un’altra varietà di patata). Il sistema modello utilizzato è principalmente la patata. Esamineremo in dettaglio alcuni tentativi di modificazione del contenuto di amido.

14 Schema della sintesi dell’amido
Da Kossmann e Lloyd (2000), ridisegnato Suc pol. lineare 1→4 pol. ramificato 1→4, 1 → 6 CYTOSOL Suc Amylopectin Amylose UDP-Glucose + Fructose ADP-Glucose Glucose-1-Phosphate G-1-P Glucose-6-Phosphate G-6-P PLASTID G6P è un passaggio obbligato in patata

15 starch Import Pi Suc Suc6P SPP Inv Susy UDP UDP ADP Gluc Fru SPS Stasy
APOPLAST CYTOSOL Pi PLASTID Suc Suc6P SPP Inv starch Susy UDP UDP ADP Gluc Fru SPS Stasy UDP-Gluc PPi ADP-Gluc UGPase PPi HK GK FK UTP AGPase G1P ATP G1P cPGM ADP pPGM PGI ADP G6P F6P G6P Glycolysis

16 Termodinamica Geigenberger et al. (2004)

17 1° approccio: spingere La sintesi di amido è limitata dalla disponibilità di zuccheri o zuccheri fosfati? Aumentiamo l’idrolisi del saccarosio (invertasi citosolica, saccarosio fosforilasi, …) Aumentiamo la capacità di fosforilare gli zuccheri (GK) Esempio di manipolazione: patata che esprime l’invertasi e che è stata poi super-trasformata con la gluco-kinasi. Transgeni ingegnerizzati allo stesso scopo (es. Sucrose Phosphorylase) mostrano fenotipi analoghi Trethewey et al. (1998) Combined expression of glucokinase and invertase in potato tubers leads to a dramatic reduction in starch accumulation and a stimulation of glycolysis. Plant J 15:

18 Contenuto in carboidrati
The original aim of this work was to increase starch accumulation in potato tubers by enhancing their capacity to metabolise sucrose. Invertasi Invertasi + Glucokinasi Contenuto in carboidrati

19 Zuccheri fosforilati Un grosso aumento delle concentrazioni, ma una riduzione nel flusso ad amido. L’omeostasi dei metaboliti, specialmente degli zuccheri fosforilati è andata a pallino...

20 Aumenta la glicolisi e la respirazione
Tuber-specific expression of a yeast invertase and a bacterial glucokinase in potato leads to an activation of glycolysis and a reduction of starch Altri tentitivi con lo stesso scopo (aumentare gli zuccheri fosforilati): - Saccarosio fosforilasi - Xilosio isomerasi - ...

21 starch Import Pi Suc Suc6P SPP Inv Sucrose phosphor. Susy UDP UDP ADP
APOPLAST CYTOSOL Pi PLASTID Suc Suc6P SPP Inv Sucrose phosphor. starch Susy UDP UDP ADP Gluc Fru SPS Xylose Isomerase Stasy UDP-Gluc PPi ADP-Gluc UGPase PPi HK GK FK UTP AGPase G1P ATP G1P cPGM ADP pPGM PGI ADP G6P F6P G6P Glycolysis

22 Sucrose phosphorylase
Suc + Pi  G1P + F I trasformanti possiedono l’attività enzimatica attesa Trethewey et al. (2001) Expression of a bacterial sucrose phosphorylase in potato tubers results in a glucose-independent induction of glycolysis. Plant Cell Environ 24:

23 Cosa provoca la SuPho? Meno peso in patate e minor densità (cioè meno amido per pianta)

24 Riduzione del contenuto di amido e della resa in tuberi
È possibile calcolare la quantità di amido prodotta da ciascuna pianta (come moli di C6/g di tuberi) Anche in questo caso aumenta la glicolisi e la respirazione

25 La sovraespressione della Saccarosio fosforilasi comporta...

26 Altri metaboliti

27 I livelli degli altri enzimi

28 Aumenta la sintesi del saccarosio …

29 …ma anche la sua idrolisi.

30 Che relazione tra futile cycling e ATP demand?
Fernie et al. (2002) Tuber-specific expression of a yeast invertase and a bacterial glucokinase in potato leads to an activation of sucrose phosphate synthase and the creation of a sucrose futile cycle

31 Sucrose(P) biosynthesis
Suc6P UDP-Gluc UDP Pi SPP F6P SPS + UDP-glucose + D-fructose 6-phosphate    UDP + sucrose 6-phosphate SPS activity is stimulated by an increase in 1) substrates (F6P and UDP-G), 2) allosteric activator (G6P) 3) a decrease in inhibitor (Pi) 4) activation of SnRK1 (stimulated by G6P)… [what about T6P?] In the transgenics all metabolites change in the direction of an activation of SPS.

32 ATP scende, ADP sale

33 Ma allora chi controlla la sintesi di amido???
2° approccio: tirare TEORIA: sintesi di amido limitata dall’incorporazione di ADP-G (il “rate limiting step”!) da parte della ADP-G PPasi Aumentiamo la quantità di ADP-G PPasi o diminuiamo la sensibilità all’inibitore a FeedBack Risultati non esaltanti (un piccolo aumento nel flusso ad amido) o non riproducibili (nel caso di ADPG PPasi desensitizzata: A 4–5-fold increase in activity of the enzyme, achieved by transformation with the Escherichia coli ADPglucose pyrophosphorylase gene glgC-16, had no detectable effect on the starch content of developing or mature tubers. No significant effects were found on the contents of ADPglucose, UDPglucose, glucose 1-phosphate, glucose 6-phosphate, PPi, ATP and ADP. Ma allora chi controlla la sintesi di amido???

34 Una sintesi dell’analisi condotta su una decina di transgeni...
Geigenberger P, Stitt M, Fernie AR. (2004) Metabolic control analysis and regulation of the conversion of sucrose to starch in growing potato tubers. Plant, Cell and Environment 27:655–673. Circa 30 papers!!!

35 MCA della sintesi dell’amido
Geigenberger et al. (2004)

36 La sintesi dell’amido ha un RLS!
Si tratta dell’importo di ATP dal citosol al plastidio La quantità di trasportatore limita il flusso CJ è intorno a 0.9 Serie di evidenze per il ruolo del metabolismo degli adenilati nel regolare il flusso ad amido Ci sono anche altre reazioni con un certo controllo…

37 Valori del coefficiente di controllo del flusso ad amido

38 Tjaden et al. (1998)

39 wt as (a) Wild-type, (b) antisense line 676
Morphology and number of wt and transgenic tubers wt as (a) Wild-type, (b) antisense line 676

40 Notare che i tuberi antisenso mostrano una strana morfologia, con numerosi bitorzoli
sense (c) antisense line 654, and (d) sense line 62

41 (a) Wild-type, (b) antisense line 676, (c) antisense line 594, and (d) antisense line 654. Note the pronounced elongation and adventitious budding.

42 sense wt as

43 CJ ≈ 1 ΔG≈0

44 Nothing is for free Bologa et al (2003)
Oxygen gradients within potato tubers expressing Invertase or Sucrose phosphorylase (analysed using a microelectrode) Nothing is for free

45 Increasing ATP consumption makes the tuber dangerously anoxic
Growing tuber Stem WT INV Expression of an ADH1-GUS reporter-gene in wt and transgenic tubers expressing invertase in the cytosol Bologa et al (2003) Plant Physiology 132:

46 Percentages of label metabolized to starch
Wild type Suc Phosphorylase Nei tuberi SuPho la marcatura contribuisce meno all’amido (il resto viene respirato)

47 Il sensore è plastidiale?
Phenotype of fully mature potato tubers constitutively expressing plastidial apyrase. Riewe et al., (2008) Apyrase: enzima che idrolizza ATP Il sensore è plastidiale? (il fenotipo è simile ai tuberi antisenso per il traslocatore e che quindi probabilmente consumano meno ATP e hanno più ossigeno disponibile...)

48 La sintesi di amido è limitata dal flusso di ATP
Strategia sensata nell’economia cellulare perchè se molto troppo ATP viene impiegato per fare amido, la cellula risponde aumentando la respirazione Il tubero rischia di andare in ipossia/anossia con tutti i conseguenti pericoli Altri transgeni che aumentano il flusso ad amido, se esistono, potrebbero essere molto sensibili alle condizioni colturali (es. terreni fradici) Sono stati pubblicati altri transgeni che sembrano aumentare il flusso ad amido...

49 Production of high-starch, low-glucose potatoes through over-expression of the metabolic regulator SnRK1 Overexpressing SnRK McKibbins et al. Plant Biotechnol J :409-18

50 SnRK attiva la trascrizione e stimola l’attività di due enzimi della via dell’amido

51 L’aumento di amido, in questo caso, sembra più wishful thinking che reale
MA: Antisense expression of SnRK1 in potato tubers does not result in a decrease in starch levels (Purcell et al., 1998).

52 3° approccio: luck! Evidenze sperimentali che la sintesi di amido può essere limitata dal rifornimento di ATP * La sovraespressione (o riduzione) del traslocatore plastidiale per ATP/ADP comporta un aumento (o una diminuzione) dell’accumulo di amido in maniera praticamente lineare. * Incubando fettine di tubero con adenina, si aumenta il pool degli adenilati e anche la velocità di sintesi dell’amido. ci sono altri enzimi che esercitano un’azione sul metabolismo degli adenilati?

53 Nessuna differenza fenotipica nella parte aerea…
Alterare la quantità di ATP a livello del plastidio manipolando l’adenilato kinasi plastidiale Regierer et al. (2002) Nessuna differenza fenotipica nella parte aerea…

54 …aumenta il pool degli adenilati
ATP aumenta ADP aumenta AMP aumenta ADP-G aumenta (3-7x) ATP/ADP scende ec costante

55 e aumenta il contenuto in amido!

56 …con differenze nella quantità, peso e densità dei tuberi e anche nel contenuto di quegli aminoacidi che richiedono ATP

57 …no no-one licensed the ADK patent which is a great pity
…no no-one licensed the ADK patent which is a great pity. Since it is reproducible. I would also have thought a company would have approached me about the Centeno Plant Cell paper this year but they did not. I am sure regulatory costs and public perception played there parts in both decisions. However, I have no evidence for either statement. (Fernie, pers. communic.)

58 Altro esempio Centeno et al. (2011) Malate plays a crucial role in starch metabolism, ripening, and soluble solid content of tomato fruit and affects postharvest softening. Plant Cell 23:

59 Articolo da leggere con attenzione (uno dei pochi)

60 Amflora Visser RG, Somhorst I, Kuipers GJ, Ruys NJ, Feenstra WJ, Jacobsen E. (1991) Inhibition of the expression of the gene for granule-bound starch synthase in potato by antisense constructs. Mol Gen Genet. 225: B. Kull et al (1995) Genetic engineering of potato starch composition: inhibition of amylose biosynthesis in tubers from transgenic potato lines by expression of antisense sequences of the gene for granule-bound starch synthase. J. Genet. & Breed. 49: 69-76 Muth J, Hartje S, Twyman RM, Hofferbert HR, Tacke E, Prüfer D. (2008) Precision breeding for novel starch variants in potato. Plant Biotechnol J Aug;6(6): VIB report (molto ben fatto):

61 Sintesi di amido 1 Kossman & Lloyd Understanding and influencing starch biochemistry (2000) Crit. Rev. Plant Sci. 19: 2 Geigenberger P, Stitt M, Fernie AR. (2004) Metabolic control analysis and regulation of the conversion of sucrose to starch in growing potato tubers. Plant, Cell and Environment 27:655–673. 3 Sweetlove et al. (1999) The contribution of adenosine 5 '-diphosphoglucose pyrophosphorylase to the control of starch synthesis in potato tubers Planta 209: 4 Trethewey et al., (1998) Induction of the activity of glycolytic enzymes correlates with enhanced hydrolysis of sucrose in the cytosol of transgenic potato tubers Plant Cell Environ. 22:71-79 5 Trethewey et al., (1999) Combined expression of GlucoKinase and invertase in potato tubers leads to a dramatic reduction in starch accumulation and a stimulation of Glycolysis Plant J. 15: 6 Fernie et al. (2002) Altered metabolic fluxes result from shifts in metabolite levels in sucrose phosphorylase-expressing potato tubers. Plant, Cell & Environment, 25: Continua....

62 7 Urbanczyk-Wochniak et al
7 Urbanczyk-Wochniak et al. (2003) Expression of a bacterial xylose isomerase in potato tubers results in an altered hexose composition and a consequent induction of metabolism. Plant Cell Physiol. 44: 8 Tjaden J, Mohlmann T, Kampfenkel K, Henrichs G, Neuhaus HE (1998) Altered plastidic ATP/ADP-transporter activity influences potato (Solanum tuberosum L.) tuber morphology, yield and composition of tuber starch. Plant Journal 16: 9 Loef et al. (2001) Increased levels of adenine nucleotides modify the interaction between starch synthesis and respiration when adenine is supplied to discs from growing potato tubers. Planta 212: 10 Regierer et al. (2002) Starch content and yield increase as a result of altering adenylate pools in transgenic plants. Nat Biotechnol. 20: 11 Oliver et al. (2008) Decreased expression of plastidial adenylate kinase in potato tubers results in an enhanced rate of respiration and a stimulation of starch synthesis that is attributable to post-translational redox-activation of ADP-glucose pyrophosphorylase. J Exp Bot. 2008 12 Riewe et al. (2008) Metabolic and developmental adaptations of growing potato tubers in response to specific manipulations of the adenylate energy status. Plant Physiol. 146:

63 Sweetlove LJ, Burrell MM, ap Rees T
Sweetlove LJ, Burrell MM, ap Rees T. (1996) Starch metabolism in tubers of transgenic potato (Solanum tuberosum) with increased ADPglucose pyrophosphorylase. Biochem J. 320:493-8. Lloyd JR, Springer F, Buléon A, Müller-Röber B, Willmitzer L, Kossmann J. (1999) The influence of alterations in ADP-glucose pyrophosphorylase activities on starch structure and composition in potato tubers. Planta. 209: Bologa et al (2003) A Bypass of Sucrose Synthase Leads to Low Internal Oxygen and Impaired Metabolic Performance in Growing Potato Tubers. Plant Physiology 132: