La Diagnostica Allergologica Molecolare: novità e ricadute pratiche nell'ambulatorio del Pediatra Luciana Indinnimeo Dipartimento di Pediatria e NPI.

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1 La Diagnostica Allergologica Molecolare: novità e ricadute pratiche nell'ambulatorio del Pediatra Luciana Indinnimeo Dipartimento di Pediatria e NPI Sapienza, Roma

2 Dall’estratto alla molecola
Strumenti di primo livello nella diagnostica clinica delle allergie: Skin Prick Test: Ricerca delle IgE specifiche in vitro Rilevano la presenza in vivo delle IgE specifiche Si avvale di metodiche ELISA Limiti Differente concentrazione e composizione proteica tra gli estratti allergenici da fonti definite solo recentemente negli estratti vengono quantizzate (μg/ml) le concentrazioni delle proteine allergeniche maggiori. Impossibilità di stabilire nei pazienti polisensibili se ci sia co-sensibilizzazione o co-riconoscimento

3 Fonte allergenica: contenitore materiale degli allergeni (es
Fonte allergenica: contenitore materiale degli allergeni (es. il latte, l’uovo,) Allergeni: proteine provenienti dalle fonti allergeniche, possono presentare un elevato numero di determinanti antigenici o epitopi. Epitopi: sequenze aminoacidiche lineari o conformazionali riconosciute da uno specifico anticorpo IgE. Il ripiegamento strutturale è importante per il meccanismo della sensibilizzazione immunologica e nella relativa risposta anticorpale.

4 I reagenti sono standardizzati e quantificati (peso in grammi).
Allergeni molecolari: molecole allergeniche di cui la fonte è naturale purificata o prodotta con la tecnica del DNA ricombinante I reagenti sono standardizzati e quantificati (peso in grammi).

5 Il progresso della diagnostica in vitro avviene con l’impiego delle singole molecole allergeniche purificate naturali o ottenute con i metodi della biologia molecolare e l’identificazione delle IgE specifiche per le singole proteine (ImmunoCAP) ISAC: test multiplo, consente di costruire allergen microarray Valutazione simultanea delle IgE specifiche per 112 molecole allergeniche purificate, naturali o ricombinanti provenienti da 43 fonti allergeniche quali polline di erbe, graminacee, alberi, epiteli di animali, alimenti, veleni d’insetto, muffe. Individua l’esatto profilo di produzione delle IgE specifiche del soggetto in esame.

6 Per utilizzare correttamente la diagnosi molecolare nelle allergie è necessario conoscerne alcuni aspetti fondamentali

7 Nomenclatura delle molecole allergeniche
Phleum pratense 1 r = recombinant n = native s = synthetic rPhl p 1 Prime 3 lettere del Genere Prima lettera della Specie ordine di identificazione Dermatophagoides pteronyssinus 1.016 r = recombinant n = native s = synthetic Der p Der p isoforms prime 3 lettere del Genere prima lettera della Specie ordine di identificazione a. similar molecular size b. identical biological function, if known, e.g. enzymatic action c. > 67% identity of amino acid sequences. Modified da Marsh DG, Bull WHO, 1975 7

8 Classificazione delle molecole allergeniche
Allergeni genuini: specie-specifici, caratteristici della specie biologica di appartenenza, possono presentare affinità strutturali notevoli con molecole omologhe ristrette a quella specie. sono marcatori di sensibilizzazione Allergeni cross-reattivi: panallergeni, molecole simili (ma non identiche), presenti in specie biologiche anche non correlate. marcatori di possibile cross-reattività

9 Panallergeni Profilina Calcium-Binding-Protein
Pathogenesis Related Protein Lipid Transfer Protein Storage Protein Tropomiosina

10 PROFILINA Funzione: Proteina conformazionale, con struttura altamente conservata, presente in tutte le cellule eucariotiche. Regola l’aggiunta di monomeri ai filamenti di actina preformata e quindi la cinesi cellulare. Denaturata dal calore e dalla digestione gastrica. Famiglie: sono presenti come allergeni minori nei pollini (Graminacee, Betulla, Ambrosia, Artemisia), come allergeni maggiori di molti alimenti di origine vegetale (Rosacee, Nocciola, Sedano, Arachidi, Pomodoro, Latice). Significato clinico: vista l’analogia tra profiline appartenenti a specie diverse, la sensibilizzazione verso una può determinare cross- reattività tra diversi inalanti e tra inalanti ed alimenti. Il 10-30% dei pz con allergia alimentare associata ad una pollinosi è sensibilizzato alla profilina.

11 PROFILINA Struttura tridimensionale della profilina del polline di betulla (Bet v 2) e dell’Hevea brasiliensis (Hev b 8, latice): la struttura si compone di due α-eliche (in verde) e di un β-foglietto (in giallo) di 5 filamenti antiparalleli. Le 2 profiline hanno una omologia di sequenza del 75% (Hauser10).

12 All’origine della reattività delle IgE specifiche verso le profiline vi è la sensibilizzazione tramite le vie respiratorie ai pollini: Graminacee (Phl p 12) in Europa centro-meridionale, Betulla (Bet v 2) in nord Europa. Una volta sensibilizzati, l’ingestione di vegetali con profiline determina usualmente reazioni locali indotte dagli alimenti in genere crudi: -SOA associata o meno a lieve angioedema -SINDROME POLLINE-ALIMENTI quando c’è un coinvolgimento sistemico in assenza di sintomi orali.

13 Betulla verrucosa e panallergeni
Termolabile, si associa ad OSA e a reazioni allergiche a frutta e vegetali nell’Europa del Nord CBP Le proteine Bet v 1 correlate sono potenti allergeni inalanti da polline di alberi dalla fioritura precoce dell’ordine botanico delle Fagales. Dopo sensibilizzazione primaria all’allergene del polline, la maggior parte dei pazienti tende a sviluppare sintomi allergici dopo ingestione di proteine omologhe Bet v 1 correlate presenti in un vasto range di frutta ( mela, pera ciliegia, kiwi, jackfruit), noci (nocciola) e vegetali( carota, sedano, prezzemolo). Le proteine PR-10 sono termolabili e instabili alla digestione da parte della pepsina Mothes N et al Int Arch Allergy Immunol Dec;135(4):357-73 13 13

14 Diagnosi di allergia alle profiline
Pazienti polisensibili ai pollini con rinite o asma lieve, con o senza SOA da ingestione di alcuni alimenti: I Livello SPT contenente la profilina naturale purificata del polline della palma da dattero che ha una elevata cross-reattività con le altre profiline. II Livello mediante la biologia molecolare, ricerca di IgE specifiche effettuata con: CAP (Phadia) che consente di determinare 3 singole profiline (Bet v2, Phleum p12, Hev b8). ISAC test che consente la simultanea ricerca delle IgE specifiche verso 5 profiline.

15 SOA per alimenti + riscontro di IgE specifiche per profiline, in assenza di altri allergeni dei vegetali e della frutta che possono causare reazioni allergiche gravi…. Tranquillizzare il paziente nell’assunzione di quegli alimenti, perché i sintomi non dovrebbero essere mai più gravi della SOA.

16 PATHOGENESIS RELATED PROTEINS
Funzione: proteine conformazionali ubiquitarie tra i procarioti e gli eucarioti, codificate, ma indotte da situazioni patologiche (agenti infettivi virali, batterici o fungini) o stress abiotici (ormonali, traumatici o climatici). Sono sensibili al calore e agli enzimi digestivi. Famiglia: rappresentano l’allergene maggiore del polline della Betulla (Bet v1), si trovano anche in altri pollini ed alimenti vegetali (Rosacae  mela, pera, ciliegia, pesca, albicocca, fragola; Fabacae  soia, arachide, fagiolo; Apiacae  sedano, carota). Significato clinico: A seguito della sensibilizzazione primaria all’allergene pollinico della betulla si possono sviluppare sintomi allergici dopo ingestione di Bet v1 related proteins presenti in numerosi frutti, noci e vegetali, ma soprattutto con mela e nocciola.

17 Betulla verrucosa e panallergeni
Termolabile, si associa ad OSA e a reazioni allergiche a frutta e vegetali nell’Europa del Nord CBP Le proteine Bet v 1 correlate sono potenti allergeni inalanti da polline di alberi dalla fioritura precoce dell’ordine botanico delle Fagales. Dopo sensibilizzazione primaria all’allergene del polline, la maggior parte dei pazienti tende a sviluppare sintomi allergici dopo ingestione di proteine omologhe Bet v 1 correlate presenti in un vasto range di frutta ( mela, pera ciliegia, kiwi, jackfruit), noci (nocciola) e vegetali( carota, sedano, prezzemolo). Le proteine PR-10 sono termolabili e instabili alla digestione da parte della pepsina Mothes N et al Int Arch Allergy Immunol Dec;135(4):357-73 17 17

18 Lipid Tranfer proteins (LTP)
Sono veri panallergeni con variabile grado di crossreattività: 36 LTP agiscono come allergeni una volta ingeriti Fanno parte delle proteine di difesa delle piante contro l’attacco di batteri, funghi, virus e sono ubiquitariamente espresse in tutto il regno delle piante I più alti livelli di espressione sono stati rilevati nelle cellule periferiche associate con la parete cellulare e con la cuticola dei tessuti epidermici Per la loro resistenza alla digestione peptica e al calore sono considerati allergeni alimentari che possono causare gravi reazioni (allergeni alimentari di classe 1) Contrariamente alla famiglia delle PR-10 , gli LTP da pollini e frutta hanno una ridotta frequenza di omologia, perciò essi sono di rado implicati nella sindrome frutta-pollini infatti una cross reattività fra nsLTP fra pollini e piante alimentari è stata dimostrata solo per l’ Art v 3 dell’artemisia e il Prup 3 della pesca (Lombardero M et al Clin Exp Allergy 2004; 34:1415–142).Per la loro resistenza alla digestione peptica e al calore gli LTP sono considerati allergeni alimentari che possono causare gravi reazioni (allergeni alimentari di classe 1)Dopo ingestione, ma di rado anche inalazione o contatto possono manifestarsi: OAS ,sintomi gastrointestinali caratterizzati da violenti crampi intestinali fino all’orticaria angioedema e all’anafilassiL’allergia all’LTP può manifestrarsi a qualsieasi età Un rilevante numero di questi pazienti manifestano allergia alla frutta non collegata a pollinosi Una crossreattività degli LTP allergenici presenti negli alimenti è stata descritta anche fra specie botanicamente non correlateNon esistono studi longitudinali che dimostrino se i soggetti sono monosensibilizzati per tutta la vita o se svilupperanno sensibilizzazioni multiple entro questo gruppo di panallergeni La sensibilizzazione (rilievo di IgE specifiche) non implica allergia clinica (es sintomi da esposizione) infatti frutta o vegetali contenenti LTP dovranno essere evitati solo se compaino sintomi importanti dopo esposizione La concentrazione di LTP nella frutta varia in rapporto alla localizzazione della molecola.Sono stati riportati casi di pazienti che mangiano pesca sbucciata senza accusare I sintomi Al momento sono stati descritti 36 LTP che agiscono quali allergeni una volta ingeriti Radauer C et al JACI 2008:121:847-52 18 18 18 18

19 Allergia alla nocciola
Proteine di deposito LTP 19 19 19

20 Lipid Tranfer proteins
Famiglia:presenti nella buccia della frutta appartenente alla famiglia delle Rosacee (soprattutto pesca  Pru p3), ma anche delle Betulacee (nocciola  Cor a8) ed in altri alimenti vegetali (arachide  Ara h8, mais, orzo, uva, verza, etc.) Per la loro localizzazione, si ha una maggiore allergenicità nella buccia rispetto alla polpa.

21 SEED STORAGE PROTEINS (SSP)
Funzione: proteine quali le 11S globuline (famiglia delle Cupine), le 2S albumine, come Ara h2 (famiglia delle Prolamine) e le 7S viciline, allergeni PREDOMINANTI nella maggior parte dei semi e della frutta a guscio come arachidi, soia, noci, semi di cereali. Struttura chimica molto stabile al calore e alle proteasi. Significato clinico: marker di rischio per gravi reazioni sistemiche; esse sono di gran lunga il primo allergene alimentare responsabile di gravi reazioni anafilattiche nell’adulto mentre nel bambino sono il terzo allergene alimentare dopo latte e uova. Proteine di deposito nel grano: Tri a 18; Tri a 19, una gliadina, conosciuta come ω-gliadina "veloce", responsabile dei quadri di anafilassi correlata all’esercizio fisico.

22 TROPOMIOSINA Proteina di 34-42 kd termostabile
Funzione: proteina altamente conservata, presente nelle cellule muscolari e non muscolari di tutte le specie di vertebrati ed invertebrati. Contribuiscono alla contrazione muscolare, al trasporto di mRNA ed al supporto meccanico della cellula. Resistente al calore. Famiglia: presente in due phylum del regno animale: artropodi (crostacei, acari, insetti e nematodi) e molluschi; le diverse tropomiosine hanno un’elevata omologia di sequenza  le cross-reattività possono assumere significato clinico rilevante.

23 Cross-reattività La tropomiosina è l’allergene maggiore dei crostacei e uno dei principali responsabili della cross-reattività tra crostacei, acari, insetti e nematodi. Der p Tropomiosina Granchio: Chaf1 Gamberetti: Pen a 1 Aragosta: Pan s1 Crostacei Ostrica: Cra g1 Lumaca: Tur c1 Calamaro: Tod p1 Molluschi

24 Un solo estratto, quante componenti.
Allergene KD Der p 1 cysteine protease 25 Der p 2 14 Der p 3 trypsin 28/30 Der p 4 amylase 60 Der p 5 Der p 6 chymotrypsin Der p 7 22/28 Der p 8 glutathione transferase Der p 9 collagenolytic serine pro. Der p 10 tropomyosin 36 Der p 11 paramyosin 103 Der p 14 apolipophorin like prot. Der p 20 arginine kinas e 40* Dermatophagoides pteronyssinus European house dust mite Der p 1 antigen P1, cysteine protease 25 C 62, see list of isoallergens Der p 2 14 62A-C, see list of isoallergens Der p 3 trypsin 28/30 63 Der p 4 amylase 60 P 64 Der p 5 65 Der p 6 chymotrypsin 66 Der p 7 22/28 67 Der p 8 glutathione transferase 67A Der p 9 collagenolytic serine pro. 67B Der p 10 tropomyosin 36 Y14906 Der p 11 paramyosin 103 AY189697, 67C Der p 14 apolipophorin like prot. Epton p.c. Der p 20 arginine kinase 40* Thomas p.c. 24

25 La sensibilizzazione ai Dermatofagoidi (Der p10) è stata riscontrata in oltre il 90% degli allergici ai gamberetti. Con la sensibilizzazione alla tropomiosina del gamberetto, la probabilità di manifestare reazioni all’ ingestione di altri crostacei è alta; dal 38% all’80%. Solo il 10-15% dei soggetti sono contemporaneamente allergici ai crostacei ed ai molluschi. Manifestazioni cliniche: Tropomiosina dei crostacei e molluschi: i sintomi si manifestano al contatto o all’inalazione (la trop. è ancora presente nei vapori in seguito alla cottura) con l’alimento; in genere si verificano entro due ore dall’ingestione. Variano dall’ORTICARIA, SOA, CAPOGIRI, VOMITO, DIARREA, TOSSE FINO allo SHOCK ANAFILATTICO e FDEIA. La tropomiosina dell’Acaro (Dep p10) difficilmente è causa di sintomi respiratori.

26 Diagnosi di allergia alla Tropomiosina - CHI?
Bambini che presentano sensibilizzazione allergica ai crostacei e ai molluschi, all’Acaro della polvere, agli artropodi e all’Anisakis. Bambini con allergia all’Acaro della polvere da sottoporre ad ITS potrebbe essere utile richiedere l’indagine molecolare per accertarsi che la sensibilizzazione all’Acaro sia dovuta agli allergeni maggiori (Der p1 o Der p2) e non alla Tropomiosina (Der p10). Vrtala S, Allergy 2008

27 Iter diagnostico nell’allergia alimentare
- Anamnesi rigorosa - E.O. con la presenza di un quadro clinico compatibile - Test diagnostici in vivo e in vitro (Prick-test, IgE specifiche) che supportano il sospetto diagnostico ma vanno valutati nel contesto clinico - Diagnostica molecolare - Test diagnostico che prevede una dieta di eliminazione e un successivo test di provocazione: Test di Provocazione Orale (TPO) in doppio cieco controllato contro placebo (DBPCFC) è il gold standard per la diagnosi. American College of Allergy, Asthma, & Immunology.Food allergy: a practice parameter. Ann Allergy Asthma Immunol 2006; 96:S1-68.

28 Cosa aggiunge la Diagnostica Molecolare?
Valuta il rischio clinico della reazione Ci permette di valutare il rischio clinico connesso con la sensibilizzazione. La sensibilizzazioni ad allergeni stabili può causare reazioni locali e sistemiche, mentre la sensibilizzazione a componenti labili determina soprattutto reazioni locali Spiega i sintomi dovuti alla cross-reattività Possiamo distinguere i sintomi dovuti ad anticorpi cross-reagenti, da quelli causati da una sensibilizzazione genuina. Discriminazione tra allergeni maggiori e allergeni minori Identifica correttamente i pazienti per la ITS Definendo il profilo di sensibilizzazione e utilizzando un estratto compatibile aumenta le probabilità di successo del trattamento