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ANALISI CITOFLUORIMETRICA E SUE APPLICAZIONI IN AMBITO BIOMEDICO.

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Presentazione sul tema: "ANALISI CITOFLUORIMETRICA E SUE APPLICAZIONI IN AMBITO BIOMEDICO."— Transcript della presentazione:

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2 ANALISI CITOFLUORIMETRICA E SUE APPLICAZIONI IN AMBITO BIOMEDICO

3 Definizione o CITOFLUORIMETRIA o CITOMETRIA A FLUSSO sospensioni cellulari monodisperse Metodica di laboratorio che permette unanalisi automatica di sospensioni cellulari monodisperse caratteristiche citologiche e/o biochimiche misurando le caratteristiche citologiche e/o biochimiche allinterno di un flusso laminare volume, granulosita, fluorescenza che interseca una sorgente luminosa, acquisendo e memorizzando piu parametri (volume, granulosita, fluorescenza) per ogni cellula acquisita

4 Principi di funzionamento Sistema fluidico (focalizzazione idrodinamica) Sistema ottico (laser Argon 488nm) Sistema elettronico (software CellQuest)

5 Sistema Fluidico

6 Sistema Ottico

7 Sistema Elettronico

8 Parametri LIGHT SCATTERING (Forward and Side Scatter) FLUORESCENZA (FITC, PE, PerCP, Cy5.5, Alexa, Biotina, PI, APC,...)

9 Light Scattering Sangue periferico

10 Fluorescenza Plot FITC/PE/Per CP Intensita F proporzionale ai siti di legame IMMUNOFLUORESCENZA DIRETTA

11 Marcatori(linfocitari): la nomenclatura CD Si considera membro di un Cluster differentiation un Marcatore di superficie che: identifica un particolare tipo cellulare o un certo stadio differenziativo ha una struttura biochimica definita è riconosciuto da un gruppo di MoAb diversi

12 Informazioni aggiornate (www.bsi.vt.edu/immunology)www.bsi.vt.edu/immunology

13 Applicazioni 1.determinazione dei marcatori di differenziamento cellulare, di superficie, intracitoplasmatici e intranucleari 2.valutazione del contenuto cellulare di DNA 3.discriminazione tra cellule vive, cellule apoptotiche e necrotiche 4.predisposizione per la separazione cellulare

14 Immunofenotipo Permette di IDENTIFICARE,NUMERARE E CARATTERIZZARE gli elementi acquisiti in caso di antigenti specifici limmunofenotipo può rispondere a domande su diagnosi, prognosi e malattia residua minima

15 Marcatori B-lineage TdT CD79a CD19 CD10 CD20 CD22 Cu SmIg

16 Marcatori T-lineage CD7 CD2 CD5 CD3 CD1 CD4 CD8 TdT TCR

17 Marcatori granulocitopoiesi CD34 CD13 CD33 CD117 CD11b CD16 CD66b CD66c CD15

18 Marcatori monocitopoiesi CD34 CD13 CD33 CD14 CD11b CD16 CD66b CD66c CD15

19 Marcatori eritrocitopoiesi CD34 CD45 CD33 CD71 CD105 CD36 GPA

20 Gating CD 45 ANTIGENE PAN LEUCOCITARIO, ovvero ESPRESSO CON CARATTERISTICA INTENSITA SU LEUCICITI PERIFERICI MA ESPRESSO IN MODO ANOMALO SU CELLULE BLASTICHE

21 Espressione CD45 Linfociti Monociti Cellule immature Granulociti maturi Granulociti immaturi Eritrociti

22 Scelta degli antigeni e Criteri di Positività ALTA SENSIBILITA (es.CD19 nelle ALL-B) ALTA SPECIFICITA (es.CD34, CD133) Positività?

23

24 ALL-T

25 CD1a, CD2, CD3, cyCD3, CD4, CD5, CD7, CD8, TdT,(CD34)

26 ALL-B, common

27 CD10, CD19, CD20, CD22, CD24, CD34, DR, IgM, cyIgM, Kappa, lambda, TdT, (CD15)

28 ALL-B, B matura

29 CD10, CD19, CD20, CD22, CD24, CD34, DR, IgM, cyIgM, Kappa, lambda, TdT

30 LAP

31 MPO, CD11b, CD13, CD14, CD15, CD16, CD33, CD34, DR, CD41, CD56, CD61 (CD2)

32 LAP G+15 dopo terapia con ATRA ESORDIO:popolazione blastica G+15:popolazione matura

33 LAM

34 Midollo osseo, liquido cefalorachidiano BM liquor

35 Midollo osseo, sangue periferico, liquido cefalorachidiano BM PB liquor

36 Neuroblastoma

37 DATI RICERCA Ciclo cellulare e apoptosi Pession et al., Targeted inhibition of NMYC by peptide nucleic acid in N-myc amplified human neuroblastoma cells: cell-cycle inhibition with induction of neuronal cell differentiation and apoptosis, Int J Oncol Feb;24(2): Differenziamento Pession et al., MLL-AF9 oncogene expression affects cell growth but not terminal differentiation and is downregulated during monocyte-macrophage maturation in AML-M5 THP-1 cells, Oncogene Nov 27;22(54):

38 VANTAGGI dellANALISI citofluorimetrica : multiparametricità possibilità di mettere in relazione più caratteristiche della stessa cellula analisi di grandi quantità di cellule riproducibilità ed affidabilità statistica delle acquisizioni grande sensibilità rapidità di analisi possibilità di ulteriori analisi a posteriori

39 Conclusioni La citofluorimetria completa il repertorio della diagnosi emato-oncologica : Identifica la malattia residua minima Distingue la ripresa di malattia VS da iperproduzione del midollo Determina la presenza di malattia disseminata (ALL latente, santuari exramidollari)


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