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30 aprile 2009EMANUELE SALIMBENI CARATTERIZZAZIONE ELETTROFISIOLOGICA DI CARDIOMIOCITI DERIVATI DA CELLULE STAMINALI IN GITA A FIRENZE!!!

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Presentazione sul tema: "30 aprile 2009EMANUELE SALIMBENI CARATTERIZZAZIONE ELETTROFISIOLOGICA DI CARDIOMIOCITI DERIVATI DA CELLULE STAMINALI IN GITA A FIRENZE!!!"— Transcript della presentazione:

1 30 aprile 2009EMANUELE SALIMBENI CARATTERIZZAZIONE ELETTROFISIOLOGICA DI CARDIOMIOCITI DERIVATI DA CELLULE STAMINALI IN GITA A FIRENZE!!!

2 30 aprile 2009EMANUELE SALIMBENI Università degli Studi di Firenze Dipartimento di Farmacologia Preclinica e Clinica "Mario Aiazzi Mancini" FACOLTA DI MEDICINA

3 30 aprile 2009EMANUELE SALIMBENI

4 30 aprile 2009EMANUELE SALIMBENI IL CUBO

5 30 aprile 2009EMANUELE SALIMBENI

6 30 aprile 2009EMANUELE SALIMBENI CENTRI OSPITATI Centro Interdipartimentale di Servizi di Spettrometria di Massa (C.I.S.M.)Centro Interdipartimentale di Servizi di Spettrometria di Massa (C.I.S.M.) Centro Interuniversitario di Medicina Molecolare e Biofisica Applicata (C.I.M.M.B.A.)Centro Interuniversitario di Medicina Molecolare e Biofisica Applicata (C.I.M.M.B.A.) Centro per i Servizi di Stabulazione degli Animali di Laboratorio (Ce.S.A.L.)Centro per i Servizi di Stabulazione degli Animali di Laboratorio (Ce.S.A.L.)

7 30 aprile 2009EMANUELE SALIMBENI

8 30 aprile 2009EMANUELE SALIMBENI COSA FANNO NEL C.I.M.M.B.A? LABORATORIO DI ELETTROFISIOLOGIA CARDIACA

9 30 aprile 2009EMANUELE SALIMBENI Rimodellamento Elettrofisiologico e Molecolare della cellula e tessuto cardiaco durante lo sviluppo fisiologico e durante alcune patologie cardiache Studio di farmaci antiaritmici e delle sostanze che modulano la frequenza cardiaca.

10 30 aprile 2009EMANUELE SALIMBENI QUALI MODELLI? Cardiomiociti ex-vivo, isolati da campioni di cuore (umano o animale) patologico; Cardiomiociti ex-vivo, isolati da campioni di cuore (umano o animale) patologico; Cardiomiociti in vitro: Cardiomiociti in vitro: -cardiomiociti ottenuti dal differenziamento di cellule staminali embrionali -cardiomiociti ottenuti dal differenziamento di cellule staminali embrionali -cardiomiociti immortalizzati; -cardiomiociti immortalizzati; Cellule trasfettate per lo studio delle isoforme e della regolazione dei canali HCN, che mediano la corrente If. Cellule trasfettate per lo studio delle isoforme e della regolazione dei canali HCN, che mediano la corrente If.

11 30 aprile 2009EMANUELE SALIMBENI PER CAPIRCI: COSA HO FATTO IO? ASSISTITO AD ALCUNI ESPERIMENTI DI PATCH-CLAMP ESEGUTI CON DIVERSI SET-UP SU CARDIOMICITI DERIVATI DA CELLULE STAMINALI EMBRIONALI, VOTLI A RACCOGLIERE DATI SU: 1.CORRENTI IONICHE; 2.POTENZIALI DI MEMBRANA; 3.POTENZIALI DAZIONE; 4.EFFETI DI FARMACI E ALTRE SOSTANZE SU TALI GRANDEZZE.

12 30 aprile 2009EMANUELE SALIMBENI Liter delle cellule: PRODOTTE IN AUSTRALLIA DIFFERENZIATE IN SVIZZERA (GINEVRA) FATTE INVECCHIARE E CARATTERIZZATE A FIRENZE EURO

13 30 aprile 2009EMANUELE SALIMBENI INVECCHIAMENTO EARLY 15-40: Più facile da mantenere. LATE : Più difficili da conservare.

14 30 aprile 2009EMANUELE SALIMBENI EARLY: 1.ICal; 2.IKr; 3.If sparisce; LATE: 1.Ito 2.IK1;

15 30 aprile 2009EMANUELE SALIMBENI PATCH -CLAMP PRIMO PASSO: INVECCHIAMENTO SECONDO PASSO: DIVISIONE (ENZIMA, VINCERE ELASTICITA) TERZO PASSO:PIASTRINE (SOSPESO ENZIMA, VETRO) QUARTO PASSO: SOLUZIONI

16 30 aprile 2009EMANUELE SALIMBENI INTRA (ELETTRODO): 1.FISIOLOGICA; 2.IONI DI SELZIONE; 3.EGTA. PH=7.2; PRESSIONE OSMOTICA PARI ESTERNA; UNICA.

17 30 aprile 2009EMANUELE SALIMBENI EXTRA (PIASTRINA): TYRODE 1.NaCl 140 mM; 2.KCl 5,4 Mm; 3.MgCl2 1,2 mM; 4.Glucosio; 5.HEPES (Acido); pH=7.3 Inseguito CaCl2 2mM ; DIFFERENZIATE

18 30 aprile 2009EMANUELE SALIMBENI Set-up: insieme di tutti gli elementi che permettono di fare la misura 1.microscopio; 2.amplificatore Axon; 3.multi canale; 4.braccio e elettrodi; 5.provette con dentro le soluzioni extra-cellulari; 6.perfusore per fare entrare le soluzioni nei vetrini; 7.Aspiratore (occhio posizionamento); 8.Aspiratore per suzione 9.Rilevatore temperatura.

19 30 aprile 2009EMANUELE SALIMBENI SEAL 1.Elettrodo lontano Seal=200 MΏ; 2.Elettrodo appoggiato Seal=3 MΏ; 3.Suzione Seal=50 MΏ; 4.Rottura Seal=80 MΏ; 5.Perfusione e ulteriore suzione=100 MΏ. Il G Ώ E UN SOGNO!!!!!!! PROBLEMI DI PERFUSIONE (TROPPO, POCO…) TENUTA DELLHOLDER.

20 30 aprile 2009EMANUELE SALIMBENI PROTOCOLLO I=V/Rseal Rseal sale I scende PULSE 2 mV PERFUSIONE: AIUTA LA FORMAZIONE DEL SEAL DIFFICOLTA: CELLULE PICCOLE E PIATTE INCUBAZIONE; ROTTURA OVERLOAD

21 30 aprile 2009EMANUELE SALIMBENI POSSO ANCHE CALCOLARE Capacità di membrana (automatico); Capacità di membrana (automatico); Reisitenza di membrana; Reisitenza di membrana; Time costant Time costant Resistenza foro (apertura protocollo) Resistenza foro (apertura protocollo) capacità foro; capacità foro; Se cè del leakage si elimina inserendo una resistenza in serie al seal (set-up nuovo). Se cè del leakage si elimina inserendo una resistenza in serie al seal (set-up nuovo).

22 30 aprile 2009EMANUELE SALIMBENI STUDIO DELLE CORRENTI E DEI POTENZIALI 1.Perfondere con la soluzione extra adatta; 2.Applicare un protocollo; 3.Registrare; 4.Fare esperimenti con protocolli e soluzioni extra diverse (perfusione, aspirazione); 5.Ricominciare;

23 30 aprile 2009EMANUELE SALIMBENIIf

24 30 aprile 2009EMANUELE SALIMBENI

25 30 aprile 2009EMANUELE SALIMBENI ESPERIMENTO ISOPRENALINA: ANTAGONISTA DEI RECETTORI BETA- ADRENERGICI (AUMENTA If) PER VEDERE COME VIENE MODULATA If NEL CORSO DELLA MATURAZIONE DELLE CELLULE (CAMBIAMENTO CANALE) REVERSIBILITA LAVAGGIO ACETILCOLINA/CARBACOLO (ANALOGO STABILE): CORRENTE DI POTASSIO, POICHE VENGONO ATTIVATI I RECETTORI MUSCARINICI CHE AUMENTANO LA Gk

26 30 aprile 2009EMANUELE SALIMBENI INaCa

27 30 aprile 2009EMANUELE SALIMBENI

28 30 aprile 2009EMANUELE SALIMBENI REGISTRAZIONI

29 30 aprile 2009EMANUELE SALIMBENI

30 30 aprile 2009EMANUELE SALIMBENI THANKS TO ALL THE C3MIGers


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