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Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano ASSICURAZIONE DI QUALITÀ NEL LABORATORIO CHIMICO: VALIDAZIONE DEI METODI DI.

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1 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano ASSICURAZIONE DI QUALITÀ NEL LABORATORIO CHIMICO: VALIDAZIONE DEI METODI DI ANALISI E. DESIMONI, B. BRUNETTI

2 Introduzione 2 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano Ogni analisi chimica è richiesta per risolvere un problema. Tecnica, metodo, procedura ed eventualmente protocollo di analisi devono essere scelti in base alle necessità del committente (tempo necessario, qualità del risultato, costo). La validazione permette di verificare se quanto scelto e messo a punto dal laboratorio è effettivamente adatto allutilizzazione prevista ed a soddisfare le esigenze del committente.

3 Scopi della validazione di un metodo di analisi chimica sono:Introduzione 3 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano provare ladeguatezza della procedura in esame; documentare la competenza delloperatore a condurre il lavoro (per mezzo della verifica dei parametri di qualità ottenuti mediante adeguate procedure); fornire dati sufficienti alla definizione dei limiti di controllo utili alla verifica del rispetto dei parametri di qualità durante il lavoro giornaliero.

4 Introduzione 4 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano … Validazione dei metodi La validazione è la conferma attraverso esame e lapporto di evidenza oggettiva che i requisiti particolari per lutilizzazione prevista siano soddisfatti Il laboratorio deve validare i metodi non normalizzati, i metodi sviluppati/progettati dal laboratorio, i metodi normalizzati utilizzati al di fuori del proprio scopo e campo di applicazione prefissato, come pure estensioni e modifiche di metodi normalizzati per confermare che i metodi siano adatti all'utilizzazione prevista. La validazione deve essere estesa in modo da soddisfare le esigenze di una data applicazione o di un campo di applicazione. Il laboratorio deve registrare i risultati ottenuti, le procedure utilizzate per la validazione, così pure una dichiarazione circa l'idoneità del metodo per l'utilizzo previsto. … (dalla UNI CEI EN ISO/IEC 17025) Limportanza della validazione dei metodi danalisi è sancita dalla norma UNI CEI EN ISO/IEC

5 Introduzione 5 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano Nota 1: La validazione può comprendere procedure per il campionamento, la manipolazione e il trasporto. Nota 2: Le tecniche utilizzate per la determinazione della prestazione di un metodo dovrebbero essere una, o una combinazione delle seguenti: taratura, utilizzando campioni o materiali di riferimento; confronto dei risultati ottenuti con altri metodi; confronti interlaboratorio; valutazione sistematica dei fattori che influenzano il risultato; stima dellincertezza dei risultati sulla base della conoscenza scientifica dei principi teorici del metodo e dellesperienza pratica. Nota 3: Quando sono effettuati dei cambiamenti nei metodi non normalizzati validati, linfluenza di tali cambiamenti dovrebbe essere documentata, e se necessario, dovrebbe essere eseguita una nuova validazione. (dalla UNI CEI EN ISO/IEC 17025)

6 Introduzione 6 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano Il campo e l'accuratezza dei valori ottenibili da metodi validati (per esempio l'incertezza dei risultati, i limiti di rilevazione, la selettività del metodo, la linearità, la ripetibilità e/o la riproducibilità, la robustezza nei confronti di influenze esterne e/o la sensibilità incrociata nei confronti di interferenze provenienti dalla matrice del campione/oggetto da provare), così come valutati per l'utilizzo previsto, devono corrispondere alle esigenze del cliente. Nota 1: La validazione comprende la specifica dei requisiti, la determinazione delle caratteristiche dei metodi, un controllo che i requisiti possano essere soddisfatti utilizzando il metodo e una dichiarazione relativa alla validità. Nota 2: In funzione dello sviluppo del metodo, dovrebbero essere eseguiti riesami regolari per verificare che le esigenze del cliente continuino ad essere soddisfatte. Qualsiasi variazione dei requisiti che richieda modifiche al piano di sviluppo dovrebbe essere approvata e autorizzata. Nota 3: La validazione è sempre un bilancio fra i costi, i rischi e le possibilità tecniche. Vi sono molti casi in cui il campo e l'incertezza dei valori (per esempio laccuratezza, i limiti di rilevazione, la selettività, la linearità, la ripetibilità e la riproducibilità, la robustezza e/o la sensibilità alle interferenze) possono essere solo forniti in modo semplificato a causa di mancanza di informazioni. (dalla UNI CEI EN ISO/IEC 17025)

7 Esempi di situazioni sperimentali richiedenti la validazione:Introduzione Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano 7 un nuovo metodo analitico è sviluppato per scopi particolari; un metodo analitico in uso deve essere aggiornato, migliorato o esteso ad un nuovo problema analitico; il controllo di qualità evidenzia variazioni nel tempo delle prestazioni del metodo in uso; un metodo analitico in uso deve essere usato in un laboratorio diverso, da un operatore diverso, con una strumentazione diversa; è necessario dimostrare lequivalenza del metodo analitico in esame con un metodo standard.

8 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano Definizione generale del problema (C) Definizione analitica del problema (C & A) Scelta di metodo, tecnica, procedura, protocollo (A) Campionamento (C? A?) (Pre)trattamento del campione (A) Analisi (A) Valutazione dei dati (A) Conclusioni (A) Presentazione dei risultati (C & A) Il laboratorio deve considerare che la validazione di un nuovo metodo analitico riguarda lintera procedura analitica totale: C: committente A: chimico analitico C: committente A: chimico analiticoIntroduzione 8

9 La validazione implica la valutazione di uno o più parametri di qualità del metodo analitico messo a punto o aggiornato o adottato dal laboratorio. Specificità e recupero Taratura e riferibilità Accuratezza esattezza precisione Incertezza Limite di rivelabilità Campo di applicazione Robustezza Manuale UNICHIM N. 179/0 Introduzione 9 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano Specificità/calibrazione Precisione ripetibilità riproducibilità Esattezza Range di lavoro Limite di rivelabilità Limite di quantificazione Robustezza Sensibilità NMKL Procedure N. 4 Selettività/specificità Limite di rivelabilità Limite di quantificazione Range dinamico/lineare Accuratezza esattezza precisione Incertezza di misura Robustezza Recupero EURACHEM: The Fitness for Purpose of Analytical Methods

10 Le procedure di validazione dipendono dal tipo di analisi da eseguire. Parametri di interesse nelle procedure di validazione analisianalisi di metodi di:qualitativaquantitativaIntroduzione 10 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano Accuratezza (esattezza e precisione) - Range dinamico e lineare - Selettività/specificità Limite di rivelabilità Limite di quantificazione - Robustezza Recupero -

11 Introduzione 11 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano Gli strumenti tecnici della validazione: bianco: può essere il bianco dei reagenti o il bianco del campione campioni reali: verifica delle interferenze tipiche del lavoro di routine materiali fortificati: utili per il ldr, il recupero, ecc. materiali contenenti lanalita nativo materiali caratterizzati indipendentemente materiali standard usati per calibrazioni materiali di riferimento (meglio se certificati) statistica

12 Carte di controllo 12 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano Allo scopo è necessario mantenere il sistema analitico sotto controllo statistico, ovvero assicurarsi che il sistema analitico sia caratterizzato da fluttuazioni solo casuali attorno ad un valore di riferimento e che queste fluttuazioni (quantificate in funzione di una deviazione standard) rimangano costanti. Nel laboratorio di prova e taratura, il monitoraggio della stabilità di una procedura analitica può essere eseguito mediante luso di uno strumento semplice ma estremamente potente, ovvero delle carte di controllo. La costruzione delle carte di controllo richiede la disponibilità di un materiale di controllo (CM). I CM possono essere materiali di riferimento certificati (situazione ottimale ma spesso non realizzabile), materiali preparati allo scopo dal laboratorio, bianchi o, in determinati casi, campioni reali, e devono essere disponibili in quantità sufficiente a permettere il prelievo e lanalisi di numerosi campioni di controllo (CS). La composizione complessiva ed il livello di concentrazione dellanalita nel materiale di controllo devono riflettere adeguatamente la natura chimica dei campioni reali da analizzare. CARTE DI CONTROLLO Quando il metodo validato è usato per condurre il lavoro di routine, è necessario assicurarsi che i parametri di qualità stimati in precedenza valgano anche per i campioni reali, e che non peggiorino nel tempo.

13 Carte di controllo 13 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano La carta viene quindi posta in uso. Allo scopo, i campioni di controllo devono essere inseriti in ordine casuale, allinterno dei campioni di ogni corsa (analitica). Nel caso più semplice, i parametri utili alla definizione dei limiti di attenzione e di azione sono ricavati analizzando un numero adeguato di volte (almeno 15 – 20 volte) lo stesso campione di controllo. Lanalisi del campione di controllo può essere eseguita in giorni diversi, o da operatori diversi, in modo da permettere la considerazione di eventuali derive temporali o della diversa manualità degli operatori.

14 Carte di controllo 14 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano A seconda delle necessità imposte dallutilizzazione dei risultati delle misurazioni, si può decidere di eseguire, per esempio più di due analisi in doppio del CM per corsa unanalisi in doppio del CM per corsa unanalisi singola del CM per corsa Il risultato delle analisi dei CS deve essere immediatamente riportato sulla carta di controllo, e la sua accettabilità deve essere valutata in base ad opportune regole di controllo. Se il risultato dellanalisi del CS non può essere accettato, tutti i risultati relativi ai campioni reali analizzati nellambito della stessa corsa devono essere considerati potenzialmente errati e quindi rifiutati. Questi campioni devono essere rianalizzati dopo aver identificato le cause che hanno determinato il rifiuto del risultato del CS, ovvero dopo aver riportato il sistema analitico sotto controllo statistico. Dopo aver eseguito 10 – 15 corse, conviene ricalcolare parametri e limiti di controllo aggiungendo i nuovi risultati relativi al CS a quelli ottenuti nel corso della preparazione della carta. La nuova carta potrà essere quindi usata nelle analisi di routine.

15 Carta di Shewhart per risultati singoli Le carte di controllo più note sono le carte di Shewhart. La più semplice è quella per risultati singoli. Per costruirla, è necessario eseguire un numero adeguato di analisi del campione di controllo (N 20), calcolare il valore medio, µ, il range mobile medio e la deviazione standard,. 15 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano Luso del valore di ottenuto dal range mobile al posto di quello calcolabile tradizionalmente (mediante la nota formula per il calcolo della deviazione standard) è giustificato dal fatto che in tal modo si minimizza ogni possibile deriva temporale. dove d 2 è il fattore di correzione per il quale deve essere diviso il range mobile medio per ottenere. Avendo eseguito le N misurazioni del CM si applicano le equazioni n n /d 2 1/d 2 0,8862 0,5907 0,4857 0,4299 0,3249 I valori di 1/d 2 sono tabulati in funzione del numero di analisi replicate del CM eseguite in ogni corsa, n, usate per valutare il range:

16 Carta di Shewhart per risultati singoli 16 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano ESEMPIO N. 29 ESEMPIO N. 29 – Stimare i parametri di controllo, e, per la costruzione di una carta di Shewhart per risultati singoli. Allo scopo un campione di controllo viene analizzato 25 volte (N). I risultati (u.a.) sono i seguentI: x 1 : 25,15; x 2 : 25,01; x 3 : 24,92; x 4 : 25,37; x 5 : 25,00; x 6 : 25,01; x 7 : 24,94; x 8 : 25,31; x 9 : 24,94; x 10 : 24,94; x 11 : 25,11; x 12 : 25,28; x 13 : 25,00; x 14 : 24,87 x 15 : 25,05; x 16 : 24,98; x 17 : 25,06; x 18 : 24,80; x 19 : 25,32; x 20 : 25,17; x 21 :24,72; x 22 : 24,93; x 23 : 25,02; x 24 : 25,12; x 25 : 25,13. Il range mobile medio (n =2) risulta uguale a La deviazione standard risulta quindi uguale a Quella calcolata tradizionalmente sarebbe

17 Carta di Shewhart per risultati singoli Sulla base dei parametri di controllo così stimati, è possibile disegnare la carta di controllo. Allo scopo sono riportati in grafico il valore medio e due coppie di linee a: µ+2 : linea superiore di attenzione (UWL, upper warning line) µ-2 : linea inferiore di attenzione (LWL, lower warning line) µ+3 : linea superiore di azione (UAL, upper action line) µ-3 : linea inferiore di azione (LAL, lower action line) Il grafico risultante è il seguente: 17 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano

18 Carta di Shewhart per risultati singoli Regole di Westgard 1 2s : regola di attenzione che richiede un esame ulteriore dei dati quando una misura di controllo cade fuori dellintervallo 2s. Infatti, esistono solo 5 probabilità su 100 che un valore misurato per un campione di controllo, analizzato durante una corsa analitica, esca dall'intervallo µ ± 2s. 1 3s : la serie viene rifiutata quando una misura di controllo cade fuori dellintervallo 3s. Infatti, esistono solo 0,3 probabilità su 100 che un valore misurato per un campione di controllo, analizzato durante una corsa analitica, esca dall'intervallo µ ± 3s. 18 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano J.O. Westgard, P.L. Barry, Cost-effective quality control: managing the quality and productivity of analytical processes, AACC Press, Washington, DC (1986)

19 Carta di Shewhart per risultati singoli 19 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano In linea di principio, la carta di Shewhart per risultati singoli permette di evidenziare sia problemi di precisione che di bias, come evidenziato nella carta di Shewhart costruita con i seguenti risultati: 25,11; 24,80; 25,05; 24,75; 25,30; 25,15; 24,88; 25,00; 25,20; 24,95; 24,81; 24,28; 24,82; 24,65; 24,55; 24,80; 24,45; 24,27; 24,82; 24,73; 25,85; 25,11; 25,50; 24,12; 25,70; 24,22; 25,00; 24,28; 25,65.

20 Carte delle differenze 20 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano Per costruire la carta-D, il campione di controllo (simile ai campioni in esame) deve essere analizzato n volte (n 2) nel corso di ogni gruppo di analisi sui campioni reali. Le differenze tra lultimo ed il primo dei risultati delle analisi replicate relative al CM, eseguite in ogni gruppo di misurazioni, dovrebbero essere distribuite casualmente attorno allo zero. Nel caso di derive temporali, lultimo risultato sarà sempre maggiore (o sempre minore) del primo: i punti corrispondenti alle differenze calcolate analizzando i CM saranno localizzati prevalentemente sopra o sotto la linea di zero. La carta delle differenze richiede luso di materiali di controllo stabili! Nel caso siano usati campioni reali come CM, è essenziale verificare lassenza di variazioni fisiche, chimiche o biologiche tra le n analisi di controllo successive. I limiti di controllo possono essere calcolati dalla deviazione standard delle differenze limiti di attenzione: ± 2. s d limiti di azione: ± 3. s d dal range medio: limiti di attenzione: limiti di azione:

21 Carte di controllo 21 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano ESEMPIO N. 31 ESEMPIO N. 31 – Nel corso dellapplicazione di un metodo FIA- PIF (Photoinduced Fluorescence detection) alla determinazione di pesticidi aromatici, si desidera verificare il mantenimento dello stato di controllo statistico. Il range medio, valutato mediante elaborazione dei risultati di 20 analisi in doppio di un campione contenente 3,8 mg/L di diflubenzuron (scelto come CM) è risultato uguale a 0,20 mg/L. I limiti di controllo utili per le due carte (P:95% e P: 99,7%) sono quindi uguali a: Durante il lavoro di routine, lo stesso campione reale usato come CM è analizzato in doppio, allinizio (R1 i ) ed alla fine (R2 i ) di ogni corsa analitica; i risultati relativi alle 22 corse analitiche eseguite nelle prime due settimane di lavoro sono riportati qui a lato: Costruire la carta dei range e quella delle differenze. carta-R carta-D

22 Carte di controllo 22 Laboratorio di Chimica Analitica, DiProVe, Università degli Studi di Milano La carta-R, riportata a sinistra, non evidenzia variazioni temporali della precisione: il range oscilla allinterno dellintervallo di attenzione. La carta-D, riportata a destra, permette invece di rilevare una deriva positiva dei risultati a partire allincirca dalla corsa N. 13 o N. 14: da questo punto in poi tutte le differenze sono positive.


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