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FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE METODI COLORIMETRICI E SPETTROFOTOMETRICI Sono un gruppo di tecniche analitiche.

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1 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE METODI COLORIMETRICI E SPETTROFOTOMETRICI Sono un gruppo di tecniche analitiche che si basano sulla interazione di radiazione elettromagnetica con la materia Da tempo sono tra i metodi di rivelazione e quantificazione più impiegati in Chimica Analitica Clinica Esistono diversi tipi di metodi, basati sia su interazioni con specie molecolari che atomiche Assorbimento Emissione

2 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE METODI COLORIMETRICI E SPETTROFOTOMETRICI Sono un gruppo di tecniche analitiche che si basano sulla interazione di una radiazione elettromagnetica con la materia Esistono diversi tipi di metodi, basati sia su interazioni con specie molecolari che atomiche

3 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE MECCANISMO DELLINTERAZIONE Assorbimento: la luce viene assorbita da un atomo, ione o molecola portandoli ad un più alto stato di energia Emissione: rilascio di un fotone da parte di un atomo, ione o molecola portandoli ad un più basso stato di energia In funzione del tipo di interazione utilizzato, possiamo distinguere metodi di assorbimento e di emissione.

4 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE LE RADIAZIONI ELETTROMAGNETICHE ( I ) Energia del fotone = h h = costante di Planck (6,626 x J s) = frequenza (s -1 ) Allaumentare di la frequenza e lenergia del fotone diminuiscono = c c = velocità della luce Unità di più comuni: nm = m Å = m m = m

5 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE LE RADIAZIONI ELETTROMAGNETICHE ( II ) TipoLunghezza dondaEnergiaInterazione < 0,1 nmemissione nucleare raggi X0,1-10 nmtransizioni elettroniche (elettroni interni) UV nmtransizioni elettroniche (elettroni di valenza) Vis nmtransizioni elettroniche (elettroni di valenza) IR800 nm-100 mtransizioni vibrazionali Microonde100 m- 1 cmtransizioni rotazionali onde radio1 cm- metriassorbimento nucleare

6 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE LO SPETTRO ELETTROMAGNETICO = c / E = h Energia Ultravioletto Visibile Infrarosso Raggi cosmiciRaggi gamma Raggi XUltravioletto VisibileInfrarosso Microonde RadarTelevisione NMR RadioUltrasuoni Suoni (udibile) Infrasuoni Frequenza [Hz] Lunghezza donda [m]

7 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE IL PROCESSO DI ASSORBIMENTO Una sostanza assorbe la luce solo quando lenergia della radiazione corrisponde a quella necessaria per far avvenire una transizione Le transizioni possono essere: Elettroniche Vibrazionali Rotazionali Le ultime due riguardano solo le molecole

8 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE Transizioni elettroniche Provocano modifiche nella distribuzione degli elettroni di un atomo o di una molecola: Molecola (ridistribuzione degli elettroni negli orbitali molecolari) * n n* Atomo (ridistribuzione degli elettroni negli orbitali atomici) IL PROCESSO DI ASSORBIMENTO

9 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE TRANSIZIONI ELETTRONICHE E SPETTRO ATOMICO S2S2 S1S1 S0S0 E E S 0 S 2 S 0 S 1 S 0 S 2 S 0 S 1 I

10 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE SPETTRO DI ASSORBIMENTO ATOMICO Anche con atomi, che è il caso più semplice, si ha un processo di assorbimento relativamente complesso. Latomo di idrogeno presenta uno spettro di assorbimento a righe complesso dovuto a transizioni elettroniche allinterno dei sottolivelli s,p,d,f

11 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE Transizioni vibrazionali Causano modifiche nella lunghezza di un legame e quindi nella separazione media di due nuclei (IR) A B A B Transizioni rotazionali Causano modifiche dellenergia di una molecola quando essa ruota rispetto al suo centro di gravità (microonde) A----B A----B IL PROCESSO DI ASSORBIMENTO

12 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE Lassorbimento della luce da parte delle molecole è un processo molto complesso In una molecola ogni livello di energia elettronica è suddiviso in un certo numero di sottolivelli vibrazionali In aggiunta ciascun sottolivello vibrazionale è ulteriormente suddiviso in sottolivelli rotazionali IL PROCESSO DI ASSORBIMENTO

13 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE IL PROCESSO DI ASSORBIMENTO Livelli Elettronici (interazioni UV) Sotto-livelli Vibrazionali (interazioni IR) Sotto-livelli Rotazionali (interazioni microonde)

14 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE Linterazione con una molecola e lassorbimento coinvolgono quindi non solo livelli elettronici, ma anche sotto-livelli vibrazionali e rotazionali. Le interazioni con altre molecole avranno anchesse un effetto, con il risultato che lo spettro di assorbimento sarà a bande (ci saranno talmente tante transizioni che sarà impossibile distinguere le une dalle altre). ASSORBIMENTO MOLECOLARE

15 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE TRANSIZIONI ELETTRONICHE E SPETTRO DI ASSORBIMENTO MOLECOLARE ASSORBIMENTO MOLECOLARE E S0S0 S1S1 S2S2 I Energia dei livelli elettronici Energia dei livelli vibrazionali Energia dei livelli rotazionali Transizioni elettroniche

16 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE ASSORBIMENTO MOLECOLARE TRANSIZIONI ELETTRONICHE NELLA FORMALDEIDE Transizione n * Transizione n * (285 nm) Transizione * Transizione * (187 nm) H C O H C O H C O H

17 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE UV/Vis, IR La identificazione di un composto si può effettuare sulla base del suo spettro di assorbimento, mediante confronto con lo spettro di un materiale noto o di uno standard di riferimento. Ciò viene fatto principalmente con la tecnica IR poiché lo spettro IR contiene più informazioni rispetto a quello UV e Vis. ANALISI QUALITATIVA

18 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE Lassorbimento di radiazioni nel UV, Vis e IR copre un ampio range di lunghezze donda. Eseguendo una scansione, cioè misurando lassorbimento alle diverse lunghezze donda, si ottiene lo spettro di assorbimento della sostanza in esame SPETTRI UV/Vis, IR Esempio di spettro di assorbimento molecolare: Lunghezza donda UVVisible Near IR ANALISI QUALITATIVA

19 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE UV/Vis - Transizioni elettroniche IR - Transizioni vibrazionali (interazioni di legame) Gli spettri UV e Vis si ottengono con lo stesso strumento mentre quelli IR, a causa soprattutto dei differenti materiali e sorgenti necessari, richiedono un altro tipo di strumentazione. Le informazioni che si ottengono sono diverse: ANALISI QUALITATIVA SPETTRI UV/Vis, IR

20 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE Locchio umano vede il colore complementare di quello assorbito COLORE E TRASMISSIONE DELLA LUCE

21 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE ASSORBIMENTO E COLORE COMPLEMENTARE rosso arancio giallo-verde verde verde-bluastro blu-verdastro blu violetto blu-verde blu-verdastro porpora rosso-porpora rosso arancio giallo giallo-verde Lunghezza donda (nm)Colore assorbitoColore complementare

22 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE La legge fondamentale su cui si basano i metodi di assorbimento è quella di Lambert e Beer la quantità di luce assorbita da una soluzione è funzione della concentrazione della sostanza assorbente e della lunghezza del cammino ottico ANALISI QUANTITATIVA PP - dP dN P = potenza della radiazione incidente N = numero di molecole che assorbono nel cammino ottico K = costante di proporzionalità

23 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE ANALISI QUANTITATIVA Poiché N dipende sia dalla concentrazione c che dal cammino ottico b si ha: a è comunemente definita come assorbività ed include anche il termine di conversione dei logaritmi da base e a base 10:

24 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE T= P/P0

25 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE P/P 0 è anche denominata Trasmittanza (T) -logT = A dove A viene definita Assorbanza A = bc Il rapporto P/P 0 è la misura della luce che passa attraverso la soluzione e non viene assorbita ANALISI QUANTITATIVA P0P0 c b P

26 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE LA LEGGE DI LAMBERT E BEER Concentrazione Assorbanza

27 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE EQUAZIONI FONDAMENTALI

28 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE Ogni strumento presenta caratteristiche diverse quindi è meglio determinare lassorbività utilizzando standard E possibile utilizzare qualsiasi unità di concentrazione: Molarità, Normalità, ppm, ecc. Se la concentrazione viene espressa in Molarità ed il cammino ottico in cm, lassorbività viene definita come assorbività molare ( ) ed ha unità M -1 cm -1 DETERMINAZIONE DELLA ASSORBIVITA

29 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE Se si ha una piccola variazione di durante le misure e non si è al valore di max si potrebbe ottenere una notevole variazione nella risposta MISURA DELL ASSORBANZA Piccolo errore Piccolo errore Grande errore Grande errore Stessa variazione di lunghezza donda Stessa variazione di lunghezza donda

30 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE MISURA DELL ASSORBANZA La determinazione della concentrazione di una soluzione può essere effettuata mediante due approcci di base: 1.Lassorbività della sostanza è nota o è stata già determinata mediante standard 2.Metodo del rapporto: si basa sulla misura dellassorbanza di uno standard noto e del campione incognito

31 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE 1: Una soluzione di Co(H 2 O) 2+ presenta unassorbanza a 530 nm in una cella di 1.00 cm. Il valore dellassorbività molare e è 10 Ln -1 cm -1. Qual è la sua concentrazione? A = bc c = A / b C = 0.20 / 10 x 1 = M

32 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE 2: Lassorbanza di una soluzione di MnO 4 - è a 525 nm. Una soluzione 1.0x10 -4 M di MnO 4 - presenta unassorbanza di quando è stata misurata alle stesse condizioni. Determinare la concentrazione della soluzione a concentrazioni non nota. In questo esempio non si conosce la lungehzza della cella, ma siccome è la stessa per le due misure, non è necessario conoscerla. Quindi è facile calcolare il valore della concentrazione incognita: C x = (0.500/0.200) 1.0x10 -4 = 2.5x10 -4 M Questo metodo considera che si lavora nel range lineare.

33 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE Sebbene nella legge di Lambert e Beer compaia lassorbanza della soluzione, la grandezza fisica che viene effettivamente misurata è la trasmittanza. Lerrore nella determinazione di una concentrazione mediante una misura spettrofotometrica ( c) è quindi legato allerrore che si ha nella misura della trasmittanza ( T). Applicando la legge sulla propagazione degli errori alla legge di Lambert e Beer si ha: c/c = ( / TlogT) T ERRORE NELLA MISURA DELL ASSORBANZA

34 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE Landamento di c/c in funzione di T è il seguente: Errore relativo in funzione della %T Errore relativo su conc. 80% 20% %T ERRORE NELLA MISURA DELL ASSORBANZA

35 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE MISURA DELL ASSORBANZA Questa deviazione potrebbe essere dovuta al fondo, ad una interferenza o ad una mancanza di sensibilità Questa deviazione potrebbe essere dovuta ad un auto- assorbimento o ad un insufficiente passaggio della luce attraverso la soluzione Ambito lineare Deviazione dalla relazione lineare Molte sostanze danno una risposta lineare solo in un certo intervallo di concentrazione

36 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE Con il termine luminescenza si indicano tutti quei processi (fluorescenza, fosforescenza) che comportano lemissione di radiazione da parte delle molecole. La luminescenza può essere indotta da diversi processi, fra i quali lassorbimento di radiazione. In tal caso si parla di fluorescenza e fosforescenza, che si verificano ad una energia inferiore a quella alla quale la radiazione viene assorbita, e lo spettro di emissione è approssimativamente limmagine speculare di quello di assorbimento. Intensità di emissione (M -1 cm -1 ) assorbimentoemissione SPETTROFLUORIMETRIA-LUMINESCENZA

37 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE E possibile dimostrare che, quando lassorbanza della soluzione è sufficientemente bassa (A 0,05) esiste una proporzionalità diretta fra lintensità dellemissione P F e la concentrazione: dove P 0 è la potenza della radiazione incidente e k è una costante che contiene, fra laltro, il valore della resa quantica di emissione dellanalita Le misure di emissione non sono misure assolute: Per effettuare misure quantitative è quindi indispensabile utilizzare una curva di calibrazione concentrazione PFPF A 0,05 ASPETTI QUANTITATIVI

38 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE SPETTROFLUORIMETRIA vs. SPETTROFOTOMETRIA SpettrofotometriaSpettrofluorimetria ApplicabilitàAmpiaRistretta (relativamente poche sostanze emettono) Intervallo di linearitàAmpioRistretto Sensibilità (oppure Media Elevata limite di rivelazione) (è possibile utilizzare rivelatori più sensibili o aumentare P 0 )

39 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE BIOLUMINESCENZA E CHEMILUMINESCENZA La luminescenza è lemissione di radiazione elettromagnetica nellUV, visibile o IR da parte di atomi o molecole come risultato della transizione da uno stato elettronicamente eccitato ad un livello energetico più basso, solitamente lo stato fondamentale La chemiluminescenza (CL) è un fenomeno di luminescenza in cui lenergia per generare lo stato elettronicamente eccitato deriva da una reazione chimica La bioluminescenza (BL) è un fenomeno di chemiluminescenza nel visibile che si verifica in organismi viventi

40 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE Si parla di chemiluminescenza quando lemissione non è indotta da assorbimento di radiazione ma da una reazione chimica. Il numero di analiti naturalmente luminescenti è relativamente ristretto. In molti casi è però possibile rendere luminescenti analiti non emittenti mediante derivatizzazione, ovvero attraverso una reazione chimica indicatrice che comporta il legame dellanalita ad una specie luminescente. APPLICAZIONI DELLA LUMINESCENZA A + B C * C + h - Luminol (used to detect blood) - phenyl oxalate ester (glow sticks)

41 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE Luciferin (firefly) Glowing Plants Luciferase gene cloned into plants Bioluminescenza APPLICAZIONI DELLA LUMINESCENZA

42 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE STRUMENTAZIONE PER SPETTROFOTOMETRIA I componenti principali della strumentazione UV/Vis e IR sono simili, indipendentemente dalla radiazione che deve essere misurata Ogni strumento comprenderà i seguenti componenti: sorgente di luce cella per il campione selettore di lunghezza donda rivelatore

43 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE STRUMENTAZIONE Schema a blocchi di un tipico spettrofotometro UV/ Vis per assorbanza risposta Campione Sorgente Selettore di Rivelatore Chemiluminometro Nelle misure di luminescenza lemissione di radiazione da parte del campione è ottenuta o mediante eccitazione del campione stesso con radiazione di unopportuna lunghezza donda o per reazione chimica risposta Sorgente Selettore di Rivelatore Selettore di Campione

44 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE CONTENITORI PER IL CAMPIONE (CUVETTE) Devono essere trasparenti a tutte le che si utilizzano Devono essere di geometria (cammino ottico) definita Quelle più comunemente utilizzate per analisi quantitative sono parallelepipedi con cammino ottico di 1 cm Intervallo di trasparenza: Silice nm Vetro nm Plastica nm quarzo o silice fusa vetro o plastica KBr, NaCl UV Visibile IR Cuvette standard a)volume complessivo 2-3 ml b)volume complessivo 0,2-1 ml ab

45 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE RIVELATORI In questi rivelatori la radiazione colpisce un catodo iniziale, provocando lemissione di elettroni: effetto fotoelettrico Gli elettroni prodotti vengono moltiplicati attraverso la collisione con una serie di catodi intermedi La corrente misurata è così amplificata, rispetto a quella iniziale, di un fattore molto elevato (10 6 – 10 7 ) anodo catodo catodi intermedi Fotomoltiplicatori (PM)

46 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE SPETTROFOTOMETRO A SINGOLO RAGGIO monocromatore fenditura di ingresso fenditura di uscita cella porta campione rivelatore sorgente elemento disperdente (prisma/reticolo)

47 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE RIVELATORI Rivelatori a stato solido: fotodiodo Quando si applica un opportuno potenziale ad un cristallo di Si drogato si ottengono due aree: In condizioni di riposo non si ha passaggio di corrente regione p regione n n - ricche di elettroni p - ricche di cariche positive

48 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE RIVELATORI Rivelatori a stato solido: fotodiodo Quando il fotodiodo viene esposto alla luce, la radiazione incidente produce nuove coppie di cariche positive e negative allinterno del materiale, permettendo il passaggio della corrente. Lintensità di corrente è proporzionale alla quantità di luce incidente. Un fotodiodo costa meno di un fotomoltiplicatore.

49 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE RIVELATORI Array di fotodiodi E costituito da una serie di fotodiodi, ricavati ad intervalli di spazio regolari su di un microchip. Ciascuno fotodiodo risponde ad una data lunghezza donda Inserito in uno strumento con una ottica opportuna, questo tipo di rivelatore permette di misurare simultaneamente radiazioni di diverse lunghezze donda reticolo

50 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE SPETTROFOTOMETRO A SINGOLO RAGGIO A SERIE DI DIODI reticolo lampada a deuterio fenditura cella porta campione otturatore lampada a tungsteno rivelatore a serie di diodi lente Questi strumenti sono in grado di effettuare la misura in un tempo brevissimo (anche meno di un secondo), permettendo quindi di studiare anche variazioni spettrali che avvengono in tempi molto brevi. Possiedono però certe limitazioni: ad esempio, la risoluzione è limitata dal numero degli elementi del rivelatore a serie di fotodiodi, e di solito non è minore di 0,5-1 m.

51 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE SPETTROFOTOMETRO A DOPPIO RAGGIO Uno spettrofotometro a doppio raggio misura contemporaneamente lassorbimento della radiazione da parte del campione e del riferimento Il rapporto fra queste due grandezze rappresenta lassorbimento dovuto allanalita, ed è indipendente da tutte le altre variabili legate alla variazione della lunghezza donda Esistono due tipi di spettrofotometri a doppio raggio: spettrofotometri a doppio raggio nel tempo spettrofotometri a doppio raggio nello spazio

52 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE SPETTROFOTOMETRO A DOPPIO RAGGIO NEL TEMPO chopper sorgente monocromatore fenditura di ingresso fenditura di uscita campione rivelatore elemento disperdente riferimento Uno spettrofotometro a doppio raggio nel tempo utilizza un chopper (di solito uno specchio rotante) per inviare alternativamente la radiazione attraverso il campione ed attraverso il riferimento La radiazione alternativamente trasmessa da campione e riferimento viene poi misurata da un unico rivelatore

53 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE SPETTROFOTOMETRO A DOPPIO RAGGIO NELLO SPAZIO Esistono limitazioni applicative per gli spettrofotometri a doppio raggio nel tempo: ad esempio non è possibile misurare correttamente variazioni di assorbanza che avvengono a velocità confrontabili o maggiori di quella di rotazione del chopper. Non è quindi possibile effettuare studi cinetici che coinvolgono reazioni veloci In uno strumento a doppio raggio nello spazio il fascio di radiazione viene diviso in due parti mediante uno specchio fisso, ed i due fasci vengono inviati rispettivamente sul campione e sul riferimento Non esistono parti mobili, ed è possibile studiare anche processi molto veloci Sono però necessari due rivelatori distinti, che devono possedere caratteristiche simili

54 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE SPETTROFOTOMETRO A DOPPIO RAGGIO NELLO SPAZIO specchio divisore di fascio sorgente monocromatore fenditura di ingresso fenditura di uscita campione rivelatore elemento disperdente riferimento rivelatore

55 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE CRITERI DI SCELTA DI UN METODO COLORIMETRICO Specificità della reazione Campo di proporzionalità A/[C] Stabilità del colore Riproducibilità Limpidità della soluzione Sensibilità Convenienza (tempo/costo)

56 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE METODI DI DOSAGGIO DELLE PROTEINE Assorbimento diretto a 280 nm Kjeldahl (idrolisi e det. dellazoto) Biureto (reattivo al rame) Lowry (rame + reattivo di Folin) Bradford (Coomassie Blu) (Fluorescamina)

57 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE DETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DI PROTEINE IN SOLUZIONE Cromofori di una proteina: legame peptidico Tyr max a 276 nm Trp max a 280 nm Phe max a nm (poco) ci si riferisce all aminoacido libero Metodo gravimetrico (pesata) Bisogna avere molto campione a disposizione ed allo stato puro altrimenti lerrore può essere molto elevato. Ha siti che possono reagire con altri gruppi, molecole,...

58 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE Cromofori nelle proteine Il legame peptidico (210 nm) Ponte disolfuro (250 nm) Centrato a 280 nm DETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DI PROTEINE IN SOLUZIONE

59 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE DETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DI PROTEINE IN SOLUZIONE

60 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE Metodo diretto E necessario avere a disposizione molta proteina (metodo assoluto). A 280 nm qual è il contributo di ciascun aa allAssorbanza totale? Phe Tyr Trp cambia da proteina a proteina Non cè solo un problema di composizione ma di interazione fra anelli aromatici diversi Se ci sono più Tyr non è dato dalla somma, dipende dalla posizione che occupano sulla catena. Metodo indiretto Ad es. Bradford sono metodi relativi Blu di Comassie legato alla proteina è blu se non è legato è marroncino. A 595 nm si misura lAssorbanza del complesso PD e non D. DETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DI PROTEINE IN SOLUZIONE

61 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE METODI INDIRETTI Molto spesso non è importante sapere la quantità assoluta, ma avere un metodo riproducibile che sia sensibile e che permetta di valutare la quantità in maniera relativa (avendo a disposizione uno standard). Blu di Comassie si lega alle proteine, ma a tutte in egual misura? P + C PC Lequilibrio deve essere tutto spostato a destra Deve essere completa, bisogna usare cioè un largo eccesso di colorante. Riassumendo: 1) la quantità che si lega deve essere la stessa per tutte le proteine; 2) la reazione deve essere completa; 3) il colorante libero non deve assorbire. DETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DI PROTEINE IN SOLUZIONE

62 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE Metodo di Lowry Metodo di Lowry sensibilità: qtà inferiori a 10 g/ml Quando si mescola alla soluzione proteica il reagente di Folin (tungstato, molibdato e fosfato di sodio) ed una soluzione di solfato di rame si sviluppa un colore blu-porpora che può essere letto a 600 nm. Tris e tamponi zwitterionici (PIPES, HEPES) interferiscono. Il colore sviluppato dipende dal contenuto di tirosina e triptofano. Reaction schematic for the Modified Lowry Protein Assay. DETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DI PROTEINE IN SOLUZIONE

63 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE Metodi dellacido bicinconinico (BCA). Simile al Lowry, dipende dalla conversione di Cu++ in Cu+ in condizioni alcaline che viene poi rilevato mediante reazione con il BCA per ottenere un color porpora letto a 562 nm. E più sensibile rispetto al Lowry (qtà inferiori a 0.5 g/ml) e più tollerante per la presenza di altri composti. DETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DI PROTEINE IN SOLUZIONE

64 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE Bradford Protein Assay The Bradford assay is a protein determination method that involves the binding of Coomassie Brilliant Blue G-250 dye to proteins. The dye exists in three forms: cationic(red), neutral (green), and anionic (blue). Under acidic conditions, the dye is predominantly in the doubly protonated red cationic form (Amax = 470 nm). However, when the dye binds to protein, it is converted to a stable unprotonated blue form (Amax = 595 nm). It is this blue protein-dye form that is detected at 595 nm in the assay using a spectrophotometer or microplate reader. DETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DI PROTEINE IN SOLUZIONE

65 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE Work with synthetic polyamino acids indicates that Coomassie Brilliant Blue G-250 dye binds primarily to basic (especially arginine) and aromatic amino acid residues. The extinction coefficient of a dye-albumin complex solution is constant over a 10- fold concentration range. Thus, Beer's law may be applied for quantitation of protein. Certain chemical-protein and chemical-dye interactions interfere with the assay. Interference from non-protein compounds is due to their ability to shift the equilibrium levels of the dye among the three colored species. DETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DI PROTEINE IN SOLUZIONE

66 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE Metodo di Bradford Tietz max = 595 nm Tietz

67 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE Selezione della proteina standard La proteina ideale da usare come standard è la forma assolutamente pura della proteina da dosare. In assenza di tale proteina si può usare unaltra proteina come standard relativo. Il miglior standard relativo deve dare una colorazione simile a quella della proteina da saggiare. Le proteine più usate come standars sono il BSA e la gamma-globulina DETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DI PROTEINE IN SOLUZIONE

68 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE DETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DI PROTEINE IN SOLUZIONE

69 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE CreatinaCreatinina Picrato APPLICAZIONI CLINICHE: SPETTROFOTOMETRIA DIRETTA + H 2 O - H 2 O + La creatinina è il prodotto di eliminazione per via renale della creatina: il tasso di creatinina è quindi un indice della funzionalità renale Possibili interferenze con composti chetonici, glucosio, proteine Complesso giallo =520 nm Reazione di Jaffe

70 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE METODI SPETTROFOTOMETRICI DIRETTI uricasi Determinazione dellacido urico nel siero 3. Lallantoina non assorbe a 290 nm quindi la concentrazione dellacido urico si ottiene per differenza 1. Misura di assorbanza a 290 nm: assorbono altri costituenti 2. Aggiunta di uricasi: decomposizione del solo acido urico

71 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE SPETTROFOTOMETRIA INDIRETTA I metodi spettrofotometrici indiretti fanno uso di reazioni enzimatiche Questi metodi coprono dal 50% al 70% delle analisi di un laboratorio clinico Sono molto sensibili perché sfruttano come risposta il turn-over del substrato Sono basati su reazioni primarie e reazioni indicatrici

72 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE H 2 O HRP Reazione indicatrice fenolo 4-amminofenazone Reattivo di Trinder Composto chinoide rosso-arancio max =510 nm SPETTROFOTOMETRIA INDIRETTA Determinazione del Glucosio con Glucosio Ossidasi (GOD) Reazione primaria C 6 H 12 O 6 + H 2 O + O 2 Acido gluconico + H 2 O 2 GOD

73 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE TEST OTTICO DI WARBURG N + R NH 2 O N R NH 2 O.. + H + + 2e - + H NAD NADH E la reazione indicatrice piu impiegata in spettrofotometria indiretta per applicazioni cliniche: Massimi di assorbanza separati permettono misure cinetiche

74 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE DENATURAZIONE DEL DNA

75 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE TRANSIZIONI ELETTRONICHE E SPETTRO DI ASSORBIMENTO MOLECOLARE ASSORBIMENTO MOLECOLARE E S0S0 S1S1 S2S2 I Energia dei livelli elettronici Energia dei livelli vibrazionali Energia dei livelli rotazionali Transizioni elettroniche Linterazione con una molecola e lassorbimento coinvolgono quindi non solo livelli elettronici, ma anche sotto-livelli vibrazionali e rotazionali. Lo spettro di assorbimento è a bande in quanto ci sono talmente tante transizioni che è impossibile vederle distinte le une dalle altre.

76 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE (M -1 cm -1 ) assorbimento Intensità di emissione eccitazione em fissa ecc variabile emissione em variabile ecc fissa SPETTRI DI EMISSIONE ED ECCITAZIONE

77 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE CELLE PER IL CAMPIONE Cuvette per sistemi a flusso Cuvette standard a)volume complessivo 2-3 ml b)volume complessivo 0,2-1 ml ab Strato di liquido tra due lastre di NaCl Cuvetta per IR Cella per gas

78 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE SELETTORE DI LUNGHEZZA DONDA Questo componente è fondamentale se: Si è interessati ad una singola lunghezza donda Si devono esplorare in sequenza diverse lunghezze donda (scansione), ad esempio per ottenere uno spettro di assorbimento Il ruolo di un selettore di lunghezze donda è quello di far sì che solo una specifica arrivi al campione e/o al detector.

79 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE SELETTORE DI LUNGHEZZA DONDA Filtri interferenziali MAX = 2dn / N dove: d = spessore n = indice di rifrazione N = ordine MAX = 2dn / N dove: d = spessore n = indice di rifrazione N = ordine Strato metallico semiriflettente Strato sottile di CaF 2 o MgF 2 d

80 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE RIVELATORI Rivelatori più comuni Tipo diintervallo di proprietàuso Rivelatore(nm)misuratatipico Fototubo I correnteUV Fotomoltiplicatore I correnteUV/Vis Stato Solido varievarie Termocoppia I correnteIR Termistore I correnteIR

81 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE ELABORAZIONE DEL SEGNALE E RISPOSTA Il segnale in uscita dal rivelatore viene infine amplificato al fine di produrre un segnale facilmente misurabile. La maggior parte degli strumenti attualmente in commercio è in grado di eseguire ulteriori elaborazioni del segnale (medie, uso di filtri per migliorare la qualità del segnale, …) e di presentarlo in una forma adeguata (display, stampati, file dati, …). Spesso il sistema è anche in grado di effettuare tutti i calcoli necessari per avere direttamente il risultato dellanalisi.

82 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE SPETTROFOTOMETRO A DOPPIO RAGGIO NEL TEMPO Questo approccio riduce gli errori legati a variazioni nellemissione della lampada e nella risposta del rivelatore, poiché lassorbimento del campione viene misurato relativamente a quello del riferimento. Il rumore di fondo viene inoltre ridotto utilizzando un amplificatore lock- in che misura solo i segnali con la giusta frequenza, cioè quella con la quale il fascio di radiazione viene alternato fra campione e riferimento. Con uno spettrofotometro a doppio raggio nel tempo si possono ottenere facilmente spettri, ed il rumore di fondo viene notevolmente ridotto. R C Assorbimento del campione

83 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE SELETTORE DI LUNGHEZZA DONDA Reticoli Sono attualmente i monocromatori più utilizzati nella moderna strumentazione analitica Consistono di solito in una superfice riflettente contenente una serie di incavi paralleli Sono classificati in base al numero di linee/mm, che varia in funzione dellintervallo di utilizzazione: - UV/Vis: linee/mm - IR : linee/mm Sono classificati in base al numero di linee/mm, che varia in funzione dellintervallo di utilizzazione: - UV/Vis: linee/mm - IR : linee/mm


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