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FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Citometria a flusso La citometria a flusso è una metodica per lanalisi e caratterizzazione.

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1 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Citometria a flusso La citometria a flusso è una metodica per lanalisi e caratterizzazione di particelle microniche, soprattutto di origine biologica. Una sospensione di particelle (ad esempio cellule) viene convogliata da un sistema fluidico laminare di trasporto in un capillare fino al punto di misura.

2 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Principio di funzionamento Un fascio luminoso focalizzato intercetta il flusso di particelle e vengono generati segnali dallincontro di ogni singola particella con la radiazione elettromagnetica. I segnali sono raccolti da un sistema di lenti, specchi dicroici e filtri ottici, e inviati ai rispettivi trasduttori che li convertono in segnali elettrici. Questi segnali elettrici vengono amplificati ed elaborati da un analizzatore che provvede alla rappresentazione grafica e allanalisi statistica.

3 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI software Schema di un citometro a flusso Sorgente luminosa raggio capillare fotomoltiplicatore particella

4 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Sistema fluidico Il sistema fluidico è di fondamentale importanza in quanto può influenzare il segnale letto dal rilevatore. Poiché il citofluorimetro rilevi una ad una le particelle presenti nel campione di partenza in maniera omogenea è necessario che lo strumento sia dotato di un sistema che immetta nel capillare ogni singola particella nello stesso punto.

5 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI E necessario che nel capillare si instauri un flusso laminare (non turbolento). In condizioni di flusso laminare le forze di inerzia idrodinamica esercitate sulle particelle le mantengono durante il loro moto al centro del capillare (idrofocalizzazione del flusso). Flusso laminare

6 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI In tali condizioni di flusso si possono considerare due regimi fluidici coassiali: quello interno (core flow) contiene le particelle, quello esterno (sheat flow) mantiene queste ultime lungo lasse ideale di flusso. particella flusso interno flusso esterno Flusso laminare/2

7 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Agendo sul sistema pneumatico di trasporto che controlla la differenza di velocità tra il flusso interno e flusso esterno si regola la velocità di flusso delle particelle allinterno del capillare per ottenere segnali per singole particelle. Flusso laminare/3

8 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI I segnali originati sono solitamente di tre tipi: 1)Diffusione a basso angolo (Forward scatter) 2)Diffusione a 90° (Side scatter) 3)Fluorescenza Tali segnali sono quindi legati alle caratteristiche fisiche della particella e alla eventuale presenza di molecole fluorescenti localizzate in esse. Tipi di segnale

9 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Forward Scatter raggio fotomoltiplicatore particella raggi diffratti (intensità dipendente dalle dimensioni della particella)

10 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Il segnale di Forward Scatter non dipende solo dalle dimensioni delle cellule, ma anche dalla posizione del capillare nel il laser colpirà la particella Particelle delle medesime dimensioni che generano due segnali di Forward Scatter differenti Forward Scatter/2

11 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Side Scatter Il Side Scatter è in relazione con le caratteristiche superficiali della particella in quanto il segnale è in relazione alla riflessione della luce incidente da parte della superficie della particella. SS FS

12 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI La citometria a flusso è in larga parte utilizzata per la caratterizzazione di cellule intere. In questi casi la sorgente utilizzata è laser ad Argon, di potenza tra i 15 mW e 5 W, centrata su una lunghezza donda di 488 nm (blu). La sorgente al laser Ar possiede una elevata intensità, permette la focalizzazione della radiazione su di una sezione molto ridotta (dimensioni cellulari) e l eccitazione di numerosi fluorofori. Sorgenti luminose

13 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI La sorgente ad Ar ha un costo relativamente elevato e permette lemissione ad un ridotto numero di lunghezze donda: 514, 488 e 345 nm. Altri tipi di sorgenti laser a differenti sono impiegate in citometria a flusso: Kripton Elio Neon Sorgenti al laser

14 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Una sorgente di radiazione più economica e policromatica è la lampada a vapori di mercurio. Tale sorgente ha questi svantaggi per limpiego in citometria a flusso: radiazione poco potente scarsa stabilità nella luce di emissione sistemi elettronici di compensazione rapido decadimento Altre sorgenti

15 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Segnali legati alle caratteristiche cellulari: Volume (diametro) o dimensioni Rapporto nucleo/citoplasma Granulosità interna Rugosità di membrana FS SS Citometria a flusso di cellule Fluorescenza Presenza di marcatori di superficie Indicatori di attività enzimatica intracellulare Indicatori di vitalità

16 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Coulter Cytometry Cella del citometro a flusso Injector Tip Fluorescence signals Focused laser beam Sheath fluid

17 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Coulter Cytometry Forward Angle Light Scatter FALS Sensor Laser

18 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Coulter Cytometry 90 Degree Light Scatter FALS Sensor 90LS Sensor Laser

19 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Coulter Cytometry Laser Fluorescence Detectors Fluorescence FALS Sensor Fluorescence detector (PMT3, PMT4 etc.)

20 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Tipi di immunofluorescenza per FC DIRETTAINDIRETTA singoladoppia tripla La fluorescenza è ottenuta mediante il legame di uno o più anticorpi marcati con un fluorocromo ad uno o più antigeni di membrana. Queste tecniche vengono definite tecniche di immunofluorescenza diretta e indiretta

21 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Immunofluorescenza singola diretta Anticorpo I (a) Antigene a Fluorocromo 1

22 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Immunofluorescenza singola indiretta Anticorpo I (a) Anticorpo II (a) Antigene a Fluorocromo 1

23 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Immunofluorescenza doppia diretta Anticorpo I (b) Anticorpo I (a) Antigene a Antigene b Fluorocromo 1 Fluorocromo 2

24 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Immunofluorescenza doppia indiretta Anticorpo I (b) Anticorpo I (a) Antigene a Antigene b Anticorpo II (b) Anticorpo II (a) Fluorocromo 1 Fluorocromo 2

25 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Immunofluorescenza tripla diretta Anticorpo I (b) Anticorpo I (a) Antigene a Antigene b Fluorocromo 1 Fluorocromo 2 Fluorocromo 3 Antigene c Anticorpo I (c)

26 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Immunofluorescenza tripla indiretta Anticorpo I (b) Anticorpo I (a) Antigene a Antigene b Fluorocromo 2 Fluorocromo 3 Antigene c Anticorpo I (c) Anticorpo II (b) Anticorpo II (a)Fluorocromo 1

27 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Coulter Cytometry PMT Filtri dicroici Filtri a banda passante Ottica a tripla fluorescenza Laser Cella a flusso

28 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Analisi dei dati Dalla combinazione dei due tipi di segnali si ottiene un particolare diagramma bidimensionale detto citogramma a dot–plot In un citogramma ogni punto rappresenta un evento contato, dotato di un definito valore correlato ai parametri misurati. I citogrammi mettono in relazione correlazione 2 differenti parametri rilevati, solitamente 2 tipi di fluorescenza oppure una fluorescenza ed uno scattering (FS o SS)

29 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Coulter Cytometry Citogramma FS/SS: studio morfologico

30 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI FSC SSC linfociti granulociti monociti eritrociti FS/SS di cellule del sangue

31 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI T-lymphocytes % T-lymphocytes % smooth cells B-lymphocytes 5-10% B-lymphocytes 5-10% villous cells T-lymphocytes B-lymphocytes Mean diameter: 8 m Morphology: dense large nucleus thin cytoplasm Linfociti umani sani CD45+/CD19+ CD45+/CD19-

32 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Morphology: larger B-lymphocytes, lower nucleus density Mean diameter: 14 m Linfociti umani neoplastici CD45+/CD19+ 2 m Mean diameter: 8 m Morphology: dense large nucleus thin cytoplasm 2 m Healthy B-lymphocytes Raji lymphocytes Burkitts lymphoma cell line

33 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Raji cells B (19+) CD45 SS CD45 FS Healthy lymphocytes CD45/FS e CD45/SS di linfociti sani e neoplastici B (19+) T (19-) T (19-) + B (19+) Other leukocytes

34 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Citogramma CD45/CD19 Rappresentazione bidimensionale della doppia fluorescenza di una popolazione di linfociti B+T sani e linfociti B neoplastici 5 % 95% healthy B cells healthy T cells

35 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Neoplastic B cells Healthy T and B cells CD45 SS Healthy T and B cells neoplastic B cells Rappresentazione bidimensionale di fluorescenza singola e scattering di una popolazione di linfociti B+T sani e linfociti B neoplastici Citogramma CD45/FS e CD45/SS

36 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Injector Tip Fluorescence signals Focused laser beam Sheath fluid Flow Cell Light Source: Argon laser is the most popular light source (wavelength 488 nm). Citometro a flusso come cell sorter

37 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI 488 nm laser + - Charged Plates Single cells sorted into test tubes FS Sensor Fluorescence detector Citometro a flusso come selettore cellulare

38 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Coulter Cytometry Citofluorimetro analizzatore

39 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Coulter Cytometry Citofluorimetro selezionatore cellulare

40 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Coulter Cytometry Morfologia - Gate

41 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Coulter Cytometry Morfologia - Gate

42 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Schema di un citofluorimetro Specchio dicroico fa passare solo una lunghezza donda mentre le altre vengono riflesse Filtro bloccante blocca a 488 nm Filtro band pass fa passare dolo i 525 nm laser (2W) 488 nm 525 nm specchio dicroico specchio normale filtro bloccante filtro band pass visto in sezione!! 10 mW 0,02 mW 2 mW

43 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI I segnali inviati dai sensori, proporzionali in maniera continua alle dimensioni del parametro misurato, vengono trasformati dai fotomoltiplicatori in impulsi elettrici veri e propri che vengono poi interpretati da software opportuni in valori numerici (utilizzati poi per costituire i plot di analisi).

44 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI I segnali inviati dai sensori (proporzionali alle caratteristiche fisiche delle cellule) vengono trasformati dai fotomoltiplicatori e fotodiodi (interfaccia dello strumento) in segnali elettrici. Questi ultimi devono, a loro volta, essere amplificati in modo da avere massimi di picco evidenziabili in forma lineare o logaritmica.

45 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Forward Scatter FSC Numero di eventi FSC Numero di eventi

46 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Citofluorimetro – Rappresentazione grafica

47 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI La rappresentazione più semplice di un dato citometrico è un istogramma in cui gli eventi osservati danno un diagramma di distribuzione.

48 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Sullasse delle ascisse è riportata una delle caratteristiche misurate dal citometro, solitamente il Forward Scatter (dimensione delle cellule) o la fluorescenza. Sullasse delle ordinate è riportato il numero di eventi.

49 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Esempio di istogramma Numero di eventi 0 FSC

50 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Un istogramma può essere rappresentato in scala lineare o logaritmica.

51 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Scala lineare Si utilizza una rappresentazione lineare quando la variazione del segnale è entro limiti ristretti. Solitamente vengono utilizzati istogrammi lineari per la misura del contenuto di DNA in una popolazione cellulare (quando il rapporto tra i picchi è intorno al fattore 2).

52 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Scala lineare Es: analisi DNA di una popolazione di cellule normali rappresentata su scala lineare

53 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Scala logaritmica Si utilizza una rappresentazione logaritmica quando la variazione del segnale, determinato dalla non omogeneità della popolazione, è ampia. Solitamente vengono utilizzati istogrammi logaritmici per la misura della fluorescenza (soprattutto quando le differenze tra controllo positivo e negativo sono > 10 2 – 10 3 ).

54 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Scala logaritmica Es: analisi di una popolazione di linfociti marcati con anti–CD4 fluoresceinato

55 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Immunofluorescenza per analisi del ciclo cellulare Questo tipo di analisi è utile per evidenziare le differenti fasi del ciclo cellulare in cui si possono trovare le cellule di una determinata popolazione.

56 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Per marcare il DNA si utilizza lo ioduro di propidio, colorante intercalante del DNA che viene eccitato a 488 nm ed emette nello spettro del rosso (625 nm). Lo ioduro di propidio è in grado di penetrare esclusivamente nelle cellule permeabilizzate o morte. preparare la linea cellulare preparare la soluzione permeabilizzante le cellule (Triton X–100) contenente PI unire la soluzione di PI alla linea cellulare

57 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI + cellula cellula permeabilizzata PI cellula marcata citosol nucleo membrana

58 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Compensazione La compensazione è importantissima per impedire che lemissione di un fluorocromo possa essere rilevata anche da un fotomoltiplicatore destinato al rilevamento di una differente lunghezza donda (ovvero per la rilevazione dellemissione da parte di un fluorocromo diverso).

59 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Esempio di compensazione Lunghezza donda (nm) Intensità relativa FITC PEDuo–CHROME

60 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Nellesempio precedente si nota che il FITC emette in un range di lunghezze donda ( ) in parte rilevate anche dal canale per la lettura del fluorocromo PE. La stessa cosa succede per il Duo–CHROME, che emette sia vicino al canale per il FITC sia in corrispondenza del canale per il PE.

61 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI La compensazione si ottiene sottraendo elettronicamente il segnale proveniente del fluorocromo che interferisce al segnale rilevato dal fotomoltiplicatore per la lettura del fluorocromo di interesse. Ciò è importantissimo per identificare le migliori condizioni di lavoro per le quali la lettura di cellule legate ad un anticorpo marcato con uno specifico fluorocromo non vengano rilevate dal fotomoltiplicatore per un altro tipo di fluorocromo.

62 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Rappresentazione di una popolazione di linfociti con compensazioni diverse COMPENSAZIONE ASSENTE

63 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Rappresentazione di una popolazione di linfociti con compensazioni diverse COMPENSAZIONE CORRETTA

64 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Rappresentazione di una popolazione di linfociti con compensazioni diverse COMPENSAZIONE ECCESSIVA

65 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Fotodiodi e fotomoltiplicatori Una volta che la radiazione è stata deviata dalla particella (a seconda del parametro preso in considerazione) questa collide contro i detector. Tali detector sono solitamente costituiti da fotodiodi, ovvero materiale in grado, una volta stimolati da una radiazione, di generare una piccola corrente elettrica.

66 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Nel caso di una doppia fluorescenza indiretta bisogna specificare il tipo di immunoglobuline utilizzate come anticorpo primario e come secondario. Solitamente gli anticorpi primari sono entrambi IgG monoclonali (mAb) di topo (mouse), ma differenti nella sottoclasse: per lantigene a si può utilizzare una IgG1 mentre per lantigene b una IgG2A.

67 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Gli anticorpi secondari, invece, sono di solito policlonali (goat anti–mouse o GAM). Questi anticorpi riconoscono i diversi isotipi delle Ig legate alla cellula. Nel caso illustrato precedentemente lanticorpo II anti–Ab I a (GAM–FITC) riconosce come isotipo IgG1, mentre lanticorpo II anti–Ab I b (GAM–PE) riconosce come isotipo IgG2A. Ciò è importantissimo per far si che non si creino legami aspecifici tra le varie Ig presenti.

68 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Rappresentazione grafica dei segnali rilevati Istogramma Bidimensionale (Dot–Plot)

69 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Gate La selezione elettronica delle cellule da esaminare (ovvero il gate) è una caratteristica molto importante dei citometri a flusso. Esso permette di isolare una particolare sottopopolazione cellulare in base a determinati parametri, per poi valutarne importanti caratteristiche che rimarrebbero mascherate dalla presenza delle restanti popolazioni.

70 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Dot–Plot con Gate Es: rappresentazione bidimensionale di una popolazione di sangue periferico dopo lisi dei globuli rossi

71 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Il Dot–Plot è utilizzato soprattutto per rappresentare i segnali di fluorescenza.

72 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Coulter Cytometry CITOMETRIA DI FLUSSO

73 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Coulter Cytometry Cose`? LA CITOMETRIA DI FLUSSO E LA MISURAZIONE DELLE PROPRIETA CELLULARI, SIA STRUTTURALI SIA FISICHE O FISIOLOGICHE DI OGNI SINGOLA CELLULA.

74 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Coulter Cytometry Citometro di Flusso E UNO STRUMENTO CHE CI PERMETTE DI ANALIZZARE INDIVIDUALMENTE LE CELLULE, FACENDOLE PASSARE DAVANTI AD UNA CAMERA DI RILEVATORI, CON UNA ELEVATA VELOCITA DI ANALISI.

75 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Coulter Cytometry Citometro di Flusso - Funzionamento l Funziona con misurazione esclusiva della luce. l Utilizza sospensioni di particelle o cellule da analizzare. l Illuminazione con Laser (la maggioranza in commercio) l Sistema Multiparametrico con 2 misurazioni della dispersione della luce laser e fino a 8 fluorescenze simultaneamente per ogni particella. l Dati classificati in parametri con una risoluzione di 1024 canali e rappresentati sotto forma di istogrammi o citogrammi. l Valutazione statistica dei dati (percentuale, canale medio di accumulo, conta, deviazione standard, coefficiente di variazione ecc.)

76 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Coulter Cytometry Citometro di Flusso - Sorgenti di Illuminazione LAMPADE A MERCURIO Emettono un ampio rango di lunghezze donda (da UV fino 600 nm) Difficile da focalizzare in aree molto piccole con grande perdita di intensità. LASER Luce coerente, monocromatica (produce meno autofluorescenza) non dispersa,la quale può essere focalizzata in aree piccole (nel ordine dei micron) senza perdere praticamente intensità

77 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Coulter Cytometry Citometro de Flusso - Tipi di Laser Gas di Argon con emissione a 488 nm –e il più usato perché eccita la maggior parte dei fluorocromi adoperati in citometria. Gas Argon Sintonizzabile da 350 a 529 nm. –si usa per la sua emissione UV ad alta stabilitá e la emissione a 488 nm. Miscela di gas helio-neon –con emissione a 633 nm. –con emissione a 544 nm. Miscela di gas argon-kripton. –emissioni sintonizzabili da UV fino 630 nm. Dissoluzione di Rodamina (dye laser) –eccitata con un laser ad argon, emette radiazione laser continuada 580 a 650 nm circa. La selezione delle lunghezze donda si fa a traverso un collimatore.

78 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Coulter Cytometry Citometro di Flusso - Rilevatori FOTODIODI Utilizzati per rilevare la dispersione di luce incidente frontale (FS) e laterale (SS). La quantità di luce incidente si regola tramite filtri ottici. Questi impulsi dopo vengono amplificati ottenendo in uscita impulsi di fino a 10 volts di ampiezza. FOTOMOLTIPLICATORI (PMT) Utilizzati per la rilevazione della fluorescenza, che sono dei segnali più deboli rispetto ai FS e SS. I segnali vengono amplificati a traverso la sensibilità del PMT (voltaggio applicato al rilevatore che va da 0 fino 2000 V), ottenendo in uscita impulsi di fino a 10 volts di ampiezza.

79 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Coulter Cytometry Citometro di Flusso - Tipi di Segnali I fotomoltiplicatori generano tre tipi basici di segnali: PICCO: e il segnale primario, della durata uguale al tempo che impiega la cellula ad attraversare il laser (de 2 a 10µs) e la massima altezza indica la massima emissione di luce che accade quando la particella si trova in mezzo alla zona di illuminazione. INTEGRALE: segnale derivata dalla prima, la cui massima altezza si raggiunge quando la particella ha attraversato totalmente la zona di illuminazione (da 2 a 10 µs). Si utilizza questo segnale per popolazioni abbastanza omogenee. LOGARITMICO: signale derivata del integrale, utilizzata per quantificare popolazioni molto eterogenee.

80 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Coulter Cytometry Camera di Flusso - Beam Shaper

81 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Coulter Cytometry 488 nm laser + - Fluorescence Activated Cell Sorting Charged Plates Single cells sorted into test tubes FALS Sensor Fluorescence detector

82 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Coulter Cytometry Fluorescein (FITC) 400 nm500 nm600 nm700 nm Wavelength Protein Excitation Emisson 300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm

83 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Coulter Cytometry Propidium Iodide 400 nm500 nm600 nm700 nm PI DNA Excitation Emisson 300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm

84 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Coulter Cytometry Excitation Emisson 300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm Phycoerytherin (PE) Protein

85 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Coulter Cytometry Allophycocyanin (APC) Protein nm (HeNe ) Excitation Emisson 300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm

86 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Coulter Cytometry Ethidium PE cis-Parinaric acid Texas Red PE-TR Conj. PI FITC 600 nm300 nm500 nm700 nm400 nm Common Laser Lines

87 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Coulter Cytometry Sistema Ottico a 3 Colori

88 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Coulter Cytometry PMT Dichroic Filters Bandpass Filters Flow Cytometry Optics Laser Flow cell

89 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Coulter Cytometry Optical Filters Dichroic Filter/Mirror at 45 deg Reflected light Transmitted LightLight Source

90 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Coulter Cytometry Standard Band Pass Filters Transmitted Light White Light Source 630 nm BandPass Filter nm Light

91 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI DISPERSI Coulter Cytometry Standard Long Pass Filters Transmitted Light Light Source 520 nm Long Pass Filter >520 nm Light Transmitted Light Light Source 575 nm Short Pass Filter <575 nm Light Standard Short Pass Filters


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