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FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI Citometria a flusso La citometria a flusso è una metodica per lanalisi e caratterizzazione.

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1 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI Citometria a flusso La citometria a flusso è una metodica per lanalisi e caratterizzazione di particelle microniche, soprattutto di origine biologica. Una sospensione di particelle (ad esempio cellule) viene convogliata da un sistema fluidico laminare di trasporto in un capillare fino al punto di misura.

2 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI Principio di funzionamento Un fascio luminoso focalizzato intercetta il flusso di particelle e vengono generati segnali dallincontro di ogni singola particella con la radiazione elettromagnetica. I segnali sono raccolti da un sistema di lenti, specchi dicroici e filtri ottici, e inviati ai rispettivi trasduttori che li convertono in segnali elettrici. Questi segnali elettrici vengono amplificati ed elaborati da un analizzatore che provvede alla rappresentazione grafica e allanalisi statistica.

3 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI software Schema di un citometro a flusso Sorgente luminosa raggio capillare fotomoltiplicatore particella

4 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI Sistema fluidico Il sistema fluidico è di fondamentale importanza in quanto può influenzare il segnale letto dal rilevatore. Poiché il citofluorimetro rilevi una ad una le particelle presenti nel campione di partenza in maniera omogenea è necessario che lo strumento sia dotato di un sistema che immetta nel capillare ogni singola particella nello stesso punto.

5 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI E necessario che nel capillare si instauri un flusso laminare (non turbolento). In condizioni di flusso laminare le forze di inerzia idrodinamica esercitate sulle particelle le mantengono durante il loro moto al centro del capillare (idrofocalizzazione del flusso). Flusso laminare

6 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI In tali condizioni di flusso si possono considerare due regimi fluidici coassiali: quello interno (core flow) contiene le particelle, quello esterno (sheat flow) mantiene queste ultime lungo lasse ideale di flusso. particella flusso interno flusso esterno Flusso laminare/2

7 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI Agendo sul sistema pneumatico di trasporto che controlla la differenza di velocità tra il flusso interno e flusso esterno si regola la velocità di flusso delle particelle allinterno del capillare per ottenere segnali per singole particelle. Flusso laminare/3

8 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI I segnali originati sono solitamente di tre tipi: 1)Diffusione a basso angolo (Forward scatter) 2)Diffusione a 90° (Side scatter) 3)Fluorescenza Tali segnali sono quindi legati alle caratteristiche fisiche della particella e alla eventuale presenza di molecole fluorescenti localizzate in esse. Tipi di segnale

9 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI Forward Scatter raggio fotomoltiplicatore particella raggi diffratti (intensità dipendente dalle dimensioni della particella)

10 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI Il segnale di Forward Scatter non dipende solo dalle dimensioni delle cellule, ma anche dalla posizione della particella nel capillare quando il laser colpirà la particella Particelle delle medesime dimensioni che generano due segnali di Forward Scatter differenti Forward Scatter/2

11 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI Side Scatter Il Side Scatter è in relazione con le caratteristiche superficiali della particella in quanto il segnale è in relazione allo scattering della luce incidente da parte della superficie della particella. SS FS

12 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI La citometria a flusso è in larga parte utilizzata per la caratterizzazione di cellule intere. In questi casi la sorgente utilizzata è laser ad Argon, di potenza tra i 15 mW e 5 W, centrata su una lunghezza donda di 488 nm (blu). La sorgente al laser Ar possiede una elevata intensità, permette la focalizzazione della radiazione su di una sezione molto ridotta (dimensioni cellulari) e l eccitazione di numerosi fluorofori. Sorgenti luminose

13 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI La sorgente ad Ar ha un costo relativamente elevato e permette lemissione ad un ridotto numero di lunghezze donda: 514, 488 e 345 nm. Altri tipi di sorgenti laser a differenti sono impiegate in citometria a flusso: Kripton Elio Neon Sorgenti al laser

14 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI Una sorgente di radiazione più economica e policromatica è la lampada a vapori di mercurio. Tale sorgente ha questi svantaggi per limpiego in citometria a flusso: radiazione poco potente scarsa stabilità nella luce di emissione sistemi elettronici di compensazione rapido decadimento Altre sorgenti

15 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI Segnali legati alle caratteristiche cellulari: Volume (diametro) o dimensioni Rapporto nucleo/citoplasma Granulosità interna Rugosità di membrana FS SS Citometria a flusso di cellule Fluorescenza Presenza di marcatori di superficie Indicatori di attività enzimatica intracellulare Indicatori di vitalità

16 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI Coulter Cytometry Cella del citometro a flusso Injector Tip Fluorescence signals Focused laser beam Sheath fluid

17 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI Tipi di immunofluorescenza per FC DIRETTAINDIRETTA singoladoppia tripla La fluorescenza è ottenuta mediante il legame di uno o più anticorpi marcati con un fluorocromo ad uno o più antigeni di membrana. Queste tecniche vengono definite tecniche di immunofluorescenza diretta e indiretta

18 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI Coulter Cytometry PMT Filtri dicroici Filtri a banda passante Ottica a tripla fluorescenza Laser Cella a flusso

19 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI Analisi dei dati Dalla combinazione dei due tipi di segnali si ottiene un particolare diagramma bidimensionale detto citogramma a dot–plot In un citogramma ogni punto rappresenta un evento contato, dotato di un definito valore correlato ai parametri misurati. I citogrammi mettono in relazione correlazione 2 differenti parametri rilevati, solitamente 2 tipi di fluorescenza oppure una fluorescenza ed uno scattering (FS o SS)

20 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI 488 nm laser + - Charged Plates Single cells sorted into test tubes FS Sensor Fluorescence detector Citometro a flusso come selettore cellulare

21 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI Coulter Cytometry Citofluorimetro analizzatore

22 FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – ANALISI DI NANO E MICROSISTEMI Coulter Cytometry Citofluorimetro selezionatore cellulare


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