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DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Next topics…. Orariodatan° ore LC-MS – Prof. Zattoni 11-1212-111 Introduzione alla.

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1 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Next topics…. Orariodatan° ore LC-MS – Prof. Zattoni Introduzione alla proteomica Approcci analitici allanalisi di macromolecole biologiche. Progetti -omics Obiettivi dellindagine proteomica. Proteomica sistematica, funzionale, differenziale Spettrometria di massa per lanalisi di proteine Analizzatori di massa a quadrupolo, a tempo di volo, a trasformata di Fourier. Principi di doppia spettrometria di massa: modalità di acquisizione del segnale e modalità di scansione. Spettrometri di massa ibridi. Scelta della tecnica di ionizzazione e dellanalizzatore di massa. Considerazioni sulla risoluzione dello spettrometro: massa monoisotopica e massa media Approcci separativi multidimensionali Accoppiamento tra tecniche separative. Tecniche ortogonali, tecniche in tandem, hyphenation. Approcci allanalisi proteomica: Approcci top-down, bottom-up, shotgun. Frammentazione dei peptidi. Digestione enzimatica. Interpretazione dello spettro di massa di peptidi Strategie di indagine proteomica Approcci gel-based e gel-free. 2D PAGE MS/MS. 2D LC MS/MS. Sequenziamento de novo e identificazione da banca dati Accoppiamento della MS con tecniche separative multidimensionali per la proteomica. Approcci gel-based e gel-free. 2D PAGE MS/MS. 2D LC MS/MS. Sequenziamento de novo e identificazione da banca dati. Totale ore8

2 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Analisi di macromolecole biologiche Classi di macromolecole biologiche Proteine - Peptidi Acidi nucleici Polisaccaridi LipidiProprietà Alto/altissimo peso molecolare Proprietà chimico-fisiche eterogenee Campioni biologici estremamente complessi

3 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Metodologie analitiche integrate Campione complesso (cellula, fluido biologico) Tecniche preparative e/o separative (rimozione di interferenti, separazione degli analiti) Tecniche di caratterizzazione (identificazione e quantificazione degli analiti)

4 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Tecniche separative HPLC, SEC, CZE, elettroforesi su gel. Approcci multidimensionali con tecniche ortogonali o in tandem Tecniche MS Sorgenti: a bassa frammentazione ESI, MALDI Analizzatori: adatti allanalisi di valori m/z elevati (TOF, quadrupolo (con ESI), FT ICR. Spettrometria di massa tandem con analizzatori ibridi Tecniche analitiche

5 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE I progetti -OMICI Genoma Identificare tutta la serie di ordini che il codice genetico può impartire ad una cellula, per comprendere e prevenire situazioni patologicheTrascrittoma Identificare e quantificare tutta la serie di ordini che il genoma impartisce effettivamente alla cellula, per comprendere ed eventualmente correggere le modalità di regolazione genicaProteoma Caratterizzare e quantificare il contenuto proteico di un sistema cellulare, mediante la determinazione di profili di espressione differenziati nel tempo e nello spazio, comprensivi delle informazioni sulle interazioni molecolari

6 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Ruolo della MS in proteomica Proteomica sistematica Identificazione e sequenziamento di tutte le proteine contenute in un tessuto. (analisi di miscele di peptidi e proteine intere) Proteomica strutturale (o differenziale) Studio delle differenze di espressione (qualitative o quantitative) rilevabili nel proteoma al variare delle condizioni del tessuto (es. cellula sana vs. cellula malata (determinazione di mutazioni nella sequenza, modifiche post-traduzionali, modifiche conformazionali, sovra o sottoespressione) Proteomica funzionale Studio della funzione biologica delle proteine e delle loro interazioni con proteine e peptidi (Separazione in condizioni non denaturanti e caratterizzazione allo stato nativo)

7 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Proteomica sistematica Cellule, fluidi biologici Lisi, 2D-Gel Sequenziamento e identificazione (anche per confronto con il genoma)

8 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Proteomica differenziale Cellule patogene, trattate, ecc… Cellule sane, non trattate, ecc… Lisi, 2D-Gel

9 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Proteomica funzionale Interazioni Proteina-Peptide Legame covalente irreversibile Legame covalente reversibile Variazione del peso molecolare Nessuna variazione del peso molecolare Variazioni della conformazione Nessuna interazione Interazioni non covalenti

10 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Schema di uno spettrometro di massa Sistema di introduzione Sorgente di ioni Analizzatore di massa Sistema di vuoto Rivelatore SegnaleComputer Campione torr Campione Ioni

11 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Criteri per la scelta della sorgente Caratteristiche del campione Stato di aggregazione: solido, liquido. Metodo di introduzione: in flusso/discontinuo. Dimensione del campione Concentrazione dellanalita nel campione Caratteristiche dellanalita Peso molecolare Complessità della molecola Polarità (ionizzabilità)

12 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Sorgenti ioniche a pressione atmosferica Stato del campioneSorgente a flusso LiquidoElettrospray (ESI) – nanospray APCI ( atmospheric pressure chemical ionization ) APPI ( atmospheric pressure photoionization ) LC: flussi ~ 0.1 – 1 cm 3 min -1. Se leluente è acqua, 0.1 cm 3 min -1 = 5.6 mmol min -1 = 135 cm 3 min -1 (c.n.) Nano-HPLC: flussi ~ cm 3 min cm 3 min (c.n.)

13 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Classificazione delle sorgenti ioniche Sorgenti dure (elevata frammentazione) –Ionizzazione elettronica Sorgenti molli (bassa frammentazione) –Fotoionizzazione (APPI) –Ionizzazione chimica (APCI) –Desorbimento (ESI, MALDI)

14 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Applicabilità delle sorgenti a pressione atmosferica

15 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE ESI vs APCI - Sensibilità Sensibilità relativa Flusso (µL/min) La ESI è sensibile alla concentrazione dellanalita, la APCI alla sua quantità assoluta. Per questo la ESI si presta ad essere accoppiata alla micro e nano HPLC per applicazioni in cui il campione sia disponibile in quantità molto ridotte. zona di applicabilità ideale

16 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Meccanismo fisico dellelettrospray Lapplicazione di un potenziale elettrico ad alto voltaggio ad una goccia di liquido ne provoca la frammentazione in goccioline fini. La causa e la repulsione elettrostatica tra le cariche che si generano nella goccia.

17 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Sistema di nebulizzazione elettrospray Cono di Taylor Punta dellago

18 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Sistema di desolvatazione per elettrospray Campione Liquido di trasporto Gas di trasporto Cono di Taylor Capillare riscaldato Gas di desolvatazione 2-6 kV + - Gocce di circa 1 µm

19 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Meccanismo di deplezione degli ioni Soluzione del campione 4000 V Pressione atmosferica Calore o gas secco Il calore e/o il gas secco causano la riduzione delle dimensioni delle gocce Vapori del solvente Spettrometro di massa Livelli successivi di vuoto (2 torr – 0.1 torr – 0.01 torr) Limite di Rayleigh: Limite di dimensioni della al quale si prevede la frammentazione della goccia. Esplosione Coulombiana q 2 = 8π 2 ε 0 γd 3 q = carica totale della goccia ε 0 = permittività elettrica del mezzo γ = tensione superficiale della goccia d = diametro della goccia

20 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Lelettrospray genera spettri multicarica m/z La carica degli ioni è dovuta agli ioni metallici (es Na + ) o ai protoni associati alla molecola. Gli addotti carichi sono quindi della forma: (M + H) +, (M + 2H) 2+, …, (M + nH) n+

21 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE MALDI: vantaggi e limitazioni Sorgente a flusso sensibile alla concentrazione, ideale per laccoppiamento online con tecniche separative miniaturizzate e per lanalisi quantitativa Ionizzazione soft (nessuna frammentazione) di molecole polari ad alto peso molecolare. = Produce spettri multicarica La ionizzazione è un processo competitivo, per cui la simultanea presenza di più analiti o di sali può dare luogo ad interferenze. La complessità degli spettri multicarica limita linterpretazione degli spettri ottenuti da miscele complesse

22 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Sorgenti ioniche a desorbimento Lanalita viene codepositato su un bersaglio con una matrice, scelta per favorire la vaporizzazione dellanalita. Caratteristiche della matrice: –Elevata assorbività alla lunghezza donda del laser. –Massa molare abbastanza bassa da sublimare facilmente. –Bassa reattività chimica. –Stabilità al vuoto. Le matrici più utilizzate sono acidi aromatici Desorbimento/ionizzazione laser assistiti da matrice (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization, MALDI)

23 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Il processo MALDI Il bersaglio viene colpito da un impulso laser che viene assorbito dalla matrice e provoca la formazione di un plasma contenente gli atomi dellanalita ed atomi e ioni della matrice.

24 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE MALDI-TOF MS Range di massa fino a 10 6 Analizzatore a tempo di volo.

25 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Lo spettro di massa Spettro di massa di ioni monocarica (MALDI/TOFMS) Spettro di massa del batterio intero Escherichia coli Intensità relativa m/z

26 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE MALDI: vantaggi e limitazioni Poco sensibile alle contaminazioni (sali, tamponi, detergenti ecc.) Solitamente non richiede complessi passaggi di purificazione del campione. Può analizzare velocemente miscele complesse di analiti (lo spettro è facile da interpretare) = Non è una sorgente a flusso La ionizzazione è un processo competitivo, per cui la simultanea presenza di più analiti può dare luogo ad interferenze. Lanalisi quantitativa è limitata dalla ridotta omogeneità del campione.

27 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Schema di uno spettrometro di massa Sistema di introduzione Sorgente di ioniAnalizzatore di massa Sistema di vuoto Rivelatore SegnaleComputer Campione torr Campione (gassoso) Ioni

28 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Risoluzione La capacità di uno spettrometro di massa di differenziare le masse è generalmente espressa dalla risoluzione R definita come : R = m/Δm dove Δm è la differenza di massa tra due picchi adiacenti risolti e m è la massa nominale del primo picco (o la media delle masse dei due picchi). Due picchi sono considerati separati se laltezza della valle tra di essi è inferiore ad una certa percentuale della loro altezza (di solito il 10%). Uno spettrometro con una risoluzione di risolverà due picchi con valori di m/z 400,0 e 400,1 (o di 40,00 e 40,01). Gli spettrometri commerciali hanno R che variano circa tra 500 e

29 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Risoluzione Picchi risolti al 10% della valle Picchi risolti al 80% della valle Intensità Definizione alternativa La risoluzione di un picco isolato si può anche definire come larghezza δm del picco al x% dellaltezza. Spesso si prende x = 50%, e δm è la larghezza a metà altezza.

30 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Classi di analizzatori di massa A settore magnetico A doppia focalizzazione A quadrupolo lineare (Q) Trappola ionica a quadrupolo (QIT) A tempo di volo (TOF) A risonanza ciclotronica e trasformata di Fourier (FT-ICR)

31 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Analizzatore di massa a quadrupolo Potenziale nel quadrupolo

32 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Traiettorie dello ione piano xz piano yz piano xz piano yz Traiettoria instabile lungo x, stabile lungo y Traiettoria stabile sia lungo x che lungo y

33 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Traiettorie ioniche nella trappola a quadrupolo Moto degli ioni in direzione z Moto degli ioni in direzione r tempo Gli ioni vengono intrappolati forzandoli su traiettorie chiuse stabili allinterno della trappola. Quando la traiettoria di uno ione diventa instabile, questo esce dalla trappola e viene rivelato.

34 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Analizzatore di massa a quadrupolo Massimo valore m/z ~ (applicabile alla MS di proteine solo in accoppiamento con la ESI) Risoluzione ~ –I quadrupoli sono strumenti a bassa risoluzione –Si lavora normalmente alla risoluzione di una unità di massa. Leggero, di dimensioni contenute Facile da accoppiare alla cromatografia Efficiente trasmissione degli ioni Necessaria una elevata precisione nellallineamento delle barre degli elettrodi

35 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Analizzatore a tempo di volo (TOF) Ioni positivi Sorgente L d Zona di accelerazione con campo elettrostatico E V = 0 dE = V 0 = V V = V 0

36 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Reflectron TOF Sorgente Metodo per correggere la distribuzione di velocità, diminuendo Δt Reflectron TOF a stadio singolo

37 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Analizzatore di massa a tempo di volo Massimo valore m/z > Risoluzione fino a Il reflectron consente di: –Ridurre le dimensioni –Aumentare la risoluzione Ideale accoppiamento con sorgenti pulsate (ma adattabile anche a sorgenti continue) Efficiente trasmissione degli ioni

38 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Principi della ICRFT MS Gli ioni in un campo elettromagnetico si muovono su traiettorie circolari (o a spirale), generando esse stesse una radiazione elettromagnetica, la cui frequenza dipende dal rapporto m/z dello ione. Tale r.e.m. può essere rivelata da unantenna, generando un segnale che contiene le radiofrequenze di tutti gli ioni in funzione del tempo. Mediante trasformata di Fourier il segnale viene passato dal dominio del tempo al dominio delle frequenze, e di conseguenza al dominio delle masse (o meglio di m/z).

39 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Analizzatore a risonanza ciclotronica Piano di ricezione Piano di emissione

40 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Analisi di massa a trasformata di Fourier Segnale nel dominio del tempoSegnale trasformato nel dominio delle frequenze m/z

41 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Analizzatore di massa a ICR FT Massimo valore m/z > Risoluzione fino a Possibilità di intrappolare gli ioni. Massima accuratezza nella determinazione delle masse. Semplicità nel passaggio da ioni positivi a ioni negativi. Prezzi ancora proibitivi per molte applicazioni (500 –1 400 k)

42 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Separazioni multidimensionali 2D-PAGE: separazione bidimensionale ortogonale IEF + SDS PAGE Il risultato è evidentemente una separazione bidimensionale. I due processi separativi si sviluppano ortogonalmente Domande: - Tutti gli accoppiamenti fra tecniche separative danno origine a separazioni multidimensionali? - Come si definisce lortogonalità di due tecniche separative?

43 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Separazioni multidimensionali Tecniche correlate e non correlate Tecniche ortogonaliTecniche correlate

44 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Separazioni multidimensionali Accoppiamento di due colonne LC basate su principi diversi Accoppiamento in tandem a b c+d a+b c d 1) Il risultato che si ottiene è un cromatogramma monodimensionale 2) La separazione ottenuta nella prima colonna può essere distrutta nella seconda. Non è una separazione bidimensionale

45 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Separazioni multidimensionali Per realizzare laccoppiamento bidimensionale fra due colonne cromatografiche (o altre tecniche separative a flusso) è necessario un dispositivo che isoli le frazioni ottenute in prima separazione, in modo che non possano mescolarsi durante la seconda separazione. Il risultato è una mappa cromatografica bidimensionale

46 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Separazioni multidimensionali Una separazione si definisce multidimensionale se soddisfa le seguenti due condizioni: 1)Il meccanismo di separazione di ciascun passaggio deve essere ortogonale agli altri. 2)La separazione ottenuta in ciascun passaggio non deve essere perduta nei passaggi successivi. Definizioni classiche (Giddings)

47 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Separazioni multidimensionali Il concetto di multidimensionalità è estendibile alla combinazione fra tecniche separative e tecniche di rivelazione. Convenzionalmente si definiscono: –Coupling (accoppiamento): combinazione tra più tecniche separative (es. LC-GC) –Hyphenation (ifenazione): combinazione tra una tecnica separativa e un rivelatore o tecnica di caratterizzazione (es. GC-MS, LC-UV) Multidimensionalità e tecniche accoppiate

48 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Separazioni multidimensionali NPs (525 nm) Void (463 nm) ex 325 nm Elution Time (min) em (nm) FFF-FL: tecniche ifenate ortogonali FFF e fluorescenza sono ortogonali perché la separazione avviene in base a proprietà dimensionali, non correlate alle proprietà spettroscopiche

49 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Separazioni multidimensionali FFF-MS: tecniche ifenate correlate Dai valori di t r in FFF Dai valori di m/z in MS Una deviazione dalla correlazione evidenzia una variazione confromazionale

50 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Separazioni multidimensionali Si definisce multidimensionale la combinazione di tecniche il cui risultato sia la dislocazione dellinformazione rispetto a più di una variabile. Il segnale analitico può essere rappresentato come una funzione di almeno due variabili di dislocazione. Definizione generale di multidimensionalità Dislocazione tempovolume λ distanza m/zpotenziale massa

51 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Doppia spettrometria di massa (MS/MS) Ionizzazione e frammentazione analisi di massa m/z decomposizione m1m1 analisi di massa m/z m1m1

52 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Applicazioni della MS/MS Maggior contenuto di informazioni Studio della struttura –Informazioni addizionali per determinare la struttura di uno ione Rivelazione selettiva di uno ione –Drastica riduzione delle interferenze Studio delle reazioni ione-molecola

53 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE MS/MS nello spazio e nel tempo MS/MS nello spazio MS/MS nel tempo Scansione dello ione prodotto Cella di collisione Tempo 1Tempo 2Tempo 3 Scansione Selezione m/z

54 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Combinazioni strumentali per MS/MS MS/MS nello spazio Settori elettrico-magnetico: EB/EB o BE/BE (max MS 4 ). Triplo quadrupolo: QqQ Tempo di volo lineare/reflectron: TOF/TOF. Analizzatori ibridi: Analizzatori ibridi: EBqQ QqTOF MS/MS nel tempo (MS n ) Trappola ionica a quadrupolo (max MS 8 ) Risonanza ciclotronica (ICR FTMS) Combinati: Combinati: Qq(trap) MS n nello spazio e/o nel tempo

55 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Modalità di scansione MS/MS Scansione dello ione prodotto Scansione Selezione m/z Scansione dello ione precursore Scansione Selezione m/z Scansione di perdita neutra Monitoraggio di reazione selezionata Scansione m/z = x Scansione m/z = x-a Selezione del precursore m/z = a Selezione del frammento m/z = b Analizzatore di massa fisso Spettrometro di massa a scansione Scansione dello ione prodotto Scansione dello ione precursore Scansione di perdita neutra Monitoraggio di reazione selezionata Simbolismo alternativo

56 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Modalità di scansione MS/MS 1.Scansione dello ione prodotto: consiste nel selezionare uno ione precursore, di m/z fissato, e nella determinazione di tutti gli ioni prodotti dalla frammentazione attivata per collisione (CID). Se nella cella di collisione si usa un gas reagente, si osservano i prodotti di reazione attivate per collisione (CAR). Quando vengono prodotti solo ioni frammento, questa modalità di scansione è detta anche scansione di ioni frammento. 2.Scansione dello ione precursore: consiste nello scegliere uno ione prodotto e nel determinare gli ioni precursori. Permette di identificare gli ioni precursori di un certo frammento. Questa modalità di scansione, che non si può realizzare con la in time MS/MS, richiede la focalizzazione del secondo analizzatore su di uno ione selezionato, e la scansione di massa sul primo analizzatore. Vengono rivelati gli ioni precursori che per reazione o frammentazione producono ioni figlio della massa selezionata.

57 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Modalità di scansione MS/MS 3.Scansione di perdita neutra (NLS): consiste nello scegliere un frammento neutro e nel rivelare tutte le frammentazioni che portano alla perdita di tale frammento. Come nel caso della scansione dello ione precursore, questa modalità non è realizzabile in MS/MS nel tempo. La scansione richiede che entrambi gli analizzatori scandiscano contemporaneamente, ma con una differenza di massa fissa a fra di loro. Quando uno ione di massa m attraversa il primo analizzatore, viene rivelato solo se produce un frammento di massa m – a. 4.Monitoraggio di reazioni selezionate (SRM): consiste nel selezionare una reazione di frammentazione. In questa modalità, entrambi gli analizzatori sono focalizzati su masse selezionate. Non si ha quindi scansione. È analogo al monitoraggio di ioni selezionati in spettrometria di massa singola, ma in questo caso gli ioni selezionati dal primo analizzatore danno un segnale solo se producono un certo frammento mediante una certa reazione. Lassenza di scansione permette di aumentare la sensibilità, oltre che la selettività.

58 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Combinazioni strumentali per MS/MS MS/MS con risoluzione nello spazio Settori elettrico-magnetico: EB/EB o BE/BE (max MS 4 ). Triplo quadrupolo: QqQ Tempo di volo lineare/reflectron: TOF/TOF. Combinati: Combinati: EBqQ QqTOF MS/MS con risoluzione nel tempo (MS n ) Trappola ionica a quadrupolo (max MS 8 ) Risonanza ciclotronica (ICR FTMS) Combinati: Combinati: Qq(trap) MS n nello spazio e/o nel tempo

59 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Scelta dellanalizzatore

60 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Massa monoisotopica e massa chimica Massa monoisotopica (picco 12 C): Massa media (picco 12 C): Per peptidi e proteine la differenza fra massa media (chimica) e massa mono- isotopica è circa 0.06%, distinguibile se lo spettrometro ha risoluzione pari a: R = 100/0.06 = 1667 (nellesempio sopra, R = 5000)

61 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Identificazione del picco 12 C Per piccoli peptidi il primo picco, relativo alla massa monoisotopica, è anche quello più intenso. Questo non è vero per proteine di massa maggiore, in cui il picco 12 C può essere poco intenso o addirittura non rivelabile. Oltre un certo valore di massa, il dato analitico utile è la massa media, che si ricava dal centroide del picco. InsulinaAlbumina bovina

62 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Risoluzione e sensibilità Quando non è possibile raggiungere risoluzione unitaria, ed identificare il picco di massa monoisotopica, è poco conveniente superare la risoluzione alla quale si può determinare la massa media con accuratezza. Questo è vero in particolare quando si deve raggiungere un compromesso fra risoluzione e sensibilità

63 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Strategie proteomiche basate sulla MS Proteina (sconosciuta) Miscela di peptidi Massa dei peptidi mediante LC/LC/ESIMS Ricerca dei pesi molecolari in banca dati Sequenziamento in MS n MS n per ulteriori Informazioni sulla sequenza Massa di proteine intere mediante (LC)ESI/MS Identificazione e caratterizzazione di proteine nota sconosciuta 2D SDS PAGE Top-down Ricerca dei pesi molecolari in banca dati bottom-up digestione shotgun

64 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Approccio proteomico top-down Si basa sulla determinazione della massa accurata (media) delle proteine in una matrice di complessità ridotta (ottenuta per purificazione con metodi biochimici o per separazione con tecniche non denaturanti) Permette di determinare la conformazione delle proteine nel loro stato nativo, e le interazioni proteina-proteina (complessi proteici fra biomarker e proteine di trasporto, oligomeri funzionali) Permette di determinare la composizione amminoacidica della proteina, ma non la loro sequenza Non identifica la proteina in modo univoco in un proteoma complesso Permette di studiare isoforme (mutazioni di singoli amminoacidi) e modificazioni post-traduzionali, ma non di localizzarle.

65 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Approccio proteomico top-down Spettro m/z in ESI/qTOF di perossidasi di rafano (HRP) allo stato nativo Il software dello spettrometro di massa identifica le famiglie di picchi negli spettri multicarica sovrapposti, ne determina il valore di m/z medio (il centroide del picco) e calcola lo spettro di massa ricostruito

66 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Approccio proteomico top-down A B C D E F Ca 2+ Glicosilazione Sullo spettro di massa ricostruito si possono identificare isoforme, complessi metallo-proteina e modificazioni post-traduzionali

67 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Masse degli aminoacidi AminoacidoCodice (3 lettere)Codice (1 lettera)Massa monoisotopicaMassa chimica GlicinaGlyG AlaninaAlaA SerinaSerS ProlinaProP ValinaValV TreoninaThrT CisteinaCysC IsoleucinaIleI LeucinaLeuL AsparaginaAsnN AspartatoAspD GlutamminaGlnQ LisinaLysK GluatammatoGluE MetioninaMetM IstidinaHisH FenilalaninaPheF ArgininaArgR TirosinaTyrY TriptofanoTryW

68 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Frammentazione dei peptidi H 2 N-CH R1R1 C NHCH R3R3 O x2x2 y2y2 z2z2 x1x1 y1y1 z1z1 C NHCH-COH R4R4 O O a2a2 b2b2 c2c2 a3a3 b3b3 c3c3 C NHCH R2R2 O x3x3 y3y3 z3z3 a1a1 b1b1 c1c1 H 2 N-CH R1R1 C O C NHCH R2R2 O + b2b2 NH 3 CH R3R3 C NHCH-COH R4R4 O O + y2y2

69 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE LC-MS/MS per lidentificazione de novo della sequenza peptidica Time [min ] MS trace MS/MS trace MS m/z y2 b3 y3 y4 y5 b7 y7 b8 y6 b9 y9 y10 b11 b12 MS/MS

70 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Interpretazione dello spettro di massa di peptidi

71 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Digestione enzimatica legame peptidico R-C-OH O H2OH2O Enzima * proteolitico H R-C N-R O N-R H H + proteina (frammenti proteolitici) * alcuni enzimi proteolitici specifici sono: tripsina tagli specifici solo a Lys-X o Arg-X Lys-C Lys-X Arg-C Arg-X Glu-C (V-8)Glu-X and Asp-X

72 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Identificazione di siti modificati Peso Molecolare Proteina Intatta Peptide/i modificato/i Identificazione Sito/i modificato/i No Sì Proteina sbagliata Mutazione Modifica post-traduz. Coincide con valore atteso? Peptide Mapping MS/MS

73 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Modifiche post-traduzionali Glicosilazione Variabile ( >3000 Da) Fosforilazione Da Acetilazione Da Formilazione Da Ossidazione Da Riduz. ponti disolfurici+2.02 Da Ancora glicolipidica Variabile

74 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Proteomica bottom-up Elettroforesi bidimensionale (2D PAGE) taglio degli spot; digestione con tripsina Mass (m/z) estrazione dei peptidi analisi MALDI/TOFMS identificazione della proteina Approccio 2D PAGE – MALDI TOFMS

75 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Identificazione di peptidi in banca dati È la più comune procedura per lidentificazione dei peptidi mediante spettrometria di massa La lista dei pesi molecolari ottenuta dallanalisi MALDI/TOFMS viene inserita in banca dati per lidentificazione della proteina incognita. Solitamente i segnali dei picchi a basso peso molecolare (< 500 Da) vengono esclusi dalla ricerca in quanto potrebbero essere segnali di matrice.

76 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Digestione automatizzata: MALDI prep MALDI/TOF MS elaborazione dei dati e ricerca in banca dati Risultati 2D GEL Spot Cutter Procedura di identificazione automatizzata

77 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Lelettroforesi bidimensionale è oggi la più potente tecnica separativa utilizzata per le proteine, tuttavia essa presenta una serie di svantaggi: E ristretta a proteine in un intervallo di masse molecolari tra 10 4 e 10 6 Da Non è possibile rivelare proteine poco espresse (bassa sensibilità) Bassa riproducibilità da gel a gel Lo spettrometro di massa non può essere interfacciato on-line con la tecnica separativa. Vantaggi e limiti dellelettroforesi

78 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Cromatografia bidimensionale Due (o più) tecniche ortogonali vengono combinate per migliorare la separazione fra i peptidi e facilitarne lidentificazione Mass (m/z) Analisi di massa (*) La digestione proteolitica può avvenire prima della separazione (approccio shotgun) o dopo la separazione delle proteine intere (approccio bottom-up gel-free) (*) Separazioni cromatografiche Una alternativa alla 2D PAGE Identificazione de novo o in banca dati

79 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE LC/LC MS n per lanalisi di miscele di peptidi frazione 1 frazione 2 minuti prima dimensione: cromatografia a scambio ionico diverse frazioni di peptidi vengono eluite effettuando un gradiente di tampone salino a valori crescenti di forza ionica.

80 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE LC/LC MS n per lanalisi di miscele di peptidi Seconda dimensione: cromatografia a fase inversa (C 4 – C 18 ) Ciascuna frazione contenente i peptidi eluiti dalla colonna a scambio ionico viene ulteriormente separata su una colonna cromatografica a fase inversa e i singoli peptidi sono rivelati e identificati utilizzando uno spettrometro di massa ESI-Q/TOF in modalità MS/MS

81 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE ESI-QqTOF MS/MS Ottica di trasferimento Quadrupolo Esapolo (cella di collisione) Cono di campionamento Nel quadrupolo vengono rilevate e selezionate le masse dei peptidi, che sono poi frammentati nellesapolo. La massa accurata dei frammenti è determinata nel tubo di volo.

82 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE LC/LC MSn per lanalisi di miscele di peptidi

83 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Proteomica differenziale quantitativa Si marcano le proteine nei due campioni da confrontare con reagenti pesanti o leggeri Gruppo chimicamente reattivo: si lega covalentemente a proteine e peptidi Isotope-labeled linker: pesante o leggero, a seconda dellisotopo usato Affinity tag: permette la separazione della proteina o del peptide marcato mediante cromatografia di affinità ISOTOPE-CODED AFFINITY TAG (ICAT)

84 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Esempio di un reagente ICAT Biotin Affinity tag: Si lega fortemente e selettivamente a una resina di agarosio- streptavidina Linker: La versione pesante è deuterata in * Gruppo reattivo: gruppo tiolico in grado di legarsi alle cisteine

85 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Come funziona lICAT? Proteolisi (eg tripsina) Lisi e marcatura MIX Isolamento per affinità su streptavidina Quantificazione MS Identificazione MS/MS 100 m/z m/z Leggero Pesante NH 2 -EACDPLR- COOH

86 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE ICAT: Pro e contro Stima le concentrazioni relative di proteine fra due campioni con un livello di accuratezza ragionevole (> 10%) Si può usare in miscele di proteine complesse La marcatura Cys- specifica reduce la complessità del campione È possibile sequenziare direttamente i peptidi in MS/MS Frammentazione del marcatore (problemi di resa e specificità) Leggere differenze cromatografiche fra gli isotopi Costoso Difficile interpretazione del risultato analitico Impossibile quantificare peptidi senza Cys o con Cys inaccessibili stericamente

87 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Imaging MALDI Immagine molecolare di una sezione di tessuto Abbondanza e distribuzione di proteine e altre specie

88 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Imaging MALDI Considerazioni metodologiche La dissezione deve preservare la localizzazione degli analiti La matrice deve essere applicata omogeneamente in senso geometrico (superficie piatta) e chimico. Si utilizzano metodi automatizzati. La sezione del raggio laser è il limite della risoluzione in modalità raster. Le informazioni quantitative sono essenzialmente relative (fra zone diverse di tessuto). Si possono usare standard interni per una quantificazione semi-assoluta. Limpiego di un MALDI TOF/TOF o di QqTOF in modalità MS/MS permette il sequenziamento delle proteine.

89 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Imaging MALDI Whole body MALDI imaging: tomografia distruttiva. Eticamente accettabile?


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