Metodologie Diagnostiche e Tecnologie Avanzate per la qualità e la sicurezza di prodotti alimentari del Mezzogiorno d’Italia Laboratorio di Genomica Vegetale.

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1 Metodologie Diagnostiche e Tecnologie Avanzate per la qualità e la sicurezza di prodotti alimentari del Mezzogiorno d’Italia Laboratorio di Genomica Vegetale UTTRI-BIOTEC ENEA C.R. TRISAIA Laboratorio Innovazione Agro-Industriale UTAGRI-INN ENEA C.R. CASACCIA Meeting finale Progetto Me.Di.T.A. - Modena, 26 ottobre 2010 OR 1: MBA - METODI ANALITICI SU BATTERI CON TECNICA CHIP ARRAY E LORO EVOLUZIONI TECNICA CHIP ARRAY E LORO EVOLUZIONI

2 RIA1.1 Analisi preliminari allo sviluppo di una metodica analitica multiscreening DNA Micro-MacroArray per OGM e/o ceppi batterici. A1.2 Messa a punto di sistema analitico multiscreening DNA Micro-MacroArray in grado di identificare la presenza di OGM e/o di batteri patogeni, desiderati o indesiderati dall’industria alimentare. SPB1.1 Validazione dei protocolli di produzione e dell’efficacia dei test DNA Chip Array nella diagnostica di routine. B1.2 Creazione di una banca dati informatica sulle principali sequenze di DNA di riferimento per la diagnostica in DNA Chip Array per batteri, desiderati e non, ed OGM. Meeting finale Progetto Me.Di.T.A. - Modena, 26 ottobre 2010 OR 1: MBA - METODI ANALITICI SU BATTERI CON TECNICA CHIP ARRAY E LORO EVOLUZIONI

3 Caratteristica Prodotto Tecnologia attualeNuova tecnologiaUnità di misura OR 1 - MBA BioChip DNA per la diagnosi di presenza di batteri e/o OGM in prodotti alimentari. Sistema modulabile contenente differenti combinazioni per diagnosticare la presenza di batteri e di OGM contemporaneame nte. Tecniche di coltura in terreni selettivi e di caratterizzazione microbiologiche. PCR quali- quantitativatativa per la determinazione in simultanea o in duplex degli OGM. DNA Chip Array Ogni informazione potrà essere misurata sul Chip osservando la presenza o l’assenza del segnale relativo Ogni Chip DNA sarà in grado di effettuare in simultanea un numero di prove superiore di 10 volte rispetto a quelle che possono essere condotte con le attuali tecniche di coltura batterica e di conta manuale. Ci sarà anche una riduzione dei tempi di esecuzione delle analisi di almeno il 30% rispetto alle tecniche tradizionali BERSAGLI Salmonella spp. Listeria Monocytogenes Coliformi E. Coli (O157 in particolare) Sporigeni: Gram negativi del tipo Pseudomonas, Aeromonas, Vibrio Enterococchi spp. Stafilococchi (aureo in particolare) Legionella Pneumofila Criptosporidium Campilobacter Lieviti e Muffe Soia Roundup Raedy GM Mais Bt 176 GM Mais MON 810 GM Mais Bt11 GM Mais T25 GM Grano GM Meeting finale Progetto Me.Di.T.A. - Modena, 26 ottobre 2010 La tecnica analitica fornirà risultati di tipo qualitativo. Sarà quindi possibile ottenere dati del tipo SI/NO o di Presenza/Assenza relativamente ai batteri e/o OGM considerati

4  Esistenza o la realizzabilità di substrati di supporto per i chip DNA;  Studio delle possibili chimiche di legame sui vari substrati di supporto per verificare la possibilità di indurre su di esse gruppi funzionali;  Disponibilità o realizzabilità di adeguati fluorofori per la marcatura del DNA;  Disponibilità di strumentazione per la realizzazione fisica dei Chip DNA e per la lettura dei dati da chip DNA; Meeting finale Progetto Me.Di.T.A. - Modena, 26 ottobre 2010

5 Campione in esame Selezione e preparazione del DNA target DNA target Preparazione del DNA probe e costruzione del CHIP ARRAY Saggio di Detection 1 2 3 Meeting finale Progetto Me.Di.T.A. - Modena, 26 ottobre 2010

6 ENTEROBACTER sakazakii; SALMONELLA spp.; LACTOBACILLUS acidophilus, bulgaricus delbruekii, fermentum; ENTEROCOCCUS faecium; STAPHYLOCOCCUS aureus; BIFIDOBACTERIUM Bifidum, longum; ESCHERICHIA coli O157:H7; VIBRIO parahaemoliticus; AEROMONAS hydrophila; LISTERIA monocytogenes; PSEUDOMONAS aeruginosa; CAMPYLOBACTER coli; SHIGELLA spp.; YERSINIA enterocolitica; BACILLUS cereus; CRYPTOSPORIDIUM spp. ► Batteri ► Funghi ► OGM ► Allergeni Lieviti SPP Soia GTS 40-3-2; Mais BT 176; Mais MON 810; Mais T25; Mais Bt11 Cor A1 di NOCCIOLA (gene Cor A1 #Z72440 ), Conglutina di ARACHIDE (gene Ara h 2 #EU183228) Lectina di SOIA (gene Lectina 1 #K00821 ) ASPERGILLUS parasiticus, ASPERGILLUS flavus ; PENICILLIUM expansum; ASPERGILLUS carbonarius, ASPERGILLUS niger Meeting finale Progetto Me.Di.T.A. - Modena, 26 ottobre 2010

7 PRODUZIONE CHIP ARRAY  DISEGNO TARGET/PROBE  COSTRUZIONE CHIP ARRAY SAGGIO DETECTION  PREPARAZIONE TARGET  MARCATURA E IBRIDAZIONE TARGET/PROBE  INTERPRETAZIONE RISULTATO Meeting finale Progetto Me.Di.T.A. - Modena, 26 ottobre 2010

8  DISEGNO TARGET/PROBE Sequenza sonda - PROBE REGIONE SPECIFICA DEL GENOMA DEI BERSAGLI MEDITA -TARGET CONTROLLO:  CARATTERISTICHE TERMODINAMICHE  LUNGHEZZA  SPECIFICITA’ Meeting finale Progetto Me.Di.T.A. - Modena, 26 ottobre 2010

9  DNA CHIP ARRAY  PRODUZIONE DI UN MICROARRAY PER MICRO-DEPOSIZIONE DI PROBES S. aureus 16S B. cereus 16S C+ 16S E. coli O157:H7 23S C+ 23S C- Igj, Mus muscul us Meeting finale Progetto Me.Di.T.A. - Modena, 26 ottobre 2010

10  DNA CHIP ARRAY  PRODUZIONE DI UN MICROARRAY PER SINTESI IN SITU DI PROBES  Elevata qualità  Riduzione dei costi  Chip Array (24 ore)  Densità Alta (90K)  Densità Media (12K)  Densità Bassa (4X2K) Meeting finale Progetto Me.Di.T.A. - Modena, 26 ottobre 2010

11  SAGGIO DI DETECTION  PREPARAZIONE DEL TARGET DNA ribosomale (16S e 23S) FWBW SONDA TARGET DNA GENOMICO PCR MULTIPLEX FWBW SONDA TARGET DNA GENOMICO PCR Meeting finale Progetto Me.Di.T.A. - Modena, 26 ottobre 2010

12  SAGGIO DI DETECTION  IBRIDAZIONE  INTERPRETAZIONE DELRISULTATO ANALISI DEI DATI Scanning DNA microarray Acquisizione immagine RISPOSTA SI/NO Eccitazione Laser 1 Meeting finale Progetto Me.Di.T.A. - Modena, 26 ottobre 2010

13  Disegno e sintesi PROBES  Disegno e sintesi PRIMERS per la produzione del TARGET  Produzione del DNA CHIP ARRAY  Test preliminari sul DNA CHIP ARRAY Meeting finale Progetto Me.Di.T.A. - Modena, 26 ottobre 2010 ATTIVITA’ 1.2: MESSA A PUNTO DI SISTEMA ANALITICO MULTISCREENING DNA MICRO-MACROARRAY IN GRADO DI IDENTIFICARE LA PRESENZA DI OGM E/O DI BATTERI PATOGENI, DESIDERATI O INDESIDERATI DALL’INDUSTRIA ALIMENTARE.

14  PRIMERS universali 16S/23S (per BATTERI)  PRIMERS specifici (per BATTERI ed ALTRO) Meeting finale Progetto Me.Di.T.A. - Modena, 26 ottobre 2010

15  IDENTIFICAZIONE SEQUENZE 16S E 23S IN GENEBANK PER BATTERI BERSAGLI Me.Di.T.A. Meeting finale Progetto Me.Di.T.A. - Modena, 26 ottobre 2010

16  ALLINEAMENTO SEQUENZE BATTERICHE IDENTIFICATE Meeting finale Progetto Me.Di.T.A. - Modena, 26 ottobre 2010

17  IDENTIFICAZIONE REGIONI VARIABILI ALL’INTERNO DEGLI AMPLICONI SCELTI  DISEGNO PROBES SU REGIONI COMPLEMENTARI SEQUENZE SELEZIONATE (MACVECTOR, TM= 70 °C, 30-35bp, >% GC) Meeting finale Progetto Me.Di.T.A. - Modena, 26 ottobre 2010

18  VERIFICA PRELIMINARE SPECIFICITA’ PROBES ATTRAVERSO IBRIDAZIONE SIMULATA (AMPLIFY) Meeting finale Progetto Me.Di.T.A. - Modena, 26 ottobre 2010

19  ALLINEAMENTO CON IL DATABASE NUCLEOTIDICO COMPLETO MEDIANTE BLAST  SELEZIONE DEFINITIVA DI 32 PROBES Meeting finale Progetto Me.Di.T.A. - Modena, 26 ottobre 2010

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21 BATTERI OGM ALLERGENI MUFFE LIEVITI FUNGHI TOSSIGENI Meeting finale Progetto Me.Di.T.A. - Modena, 26 ottobre 2010

22  IDENTIFICAZIONE SEQUENZE SPECIFICHE MEDIANTE ALLINEAMENTO CON IL DATABASE NUCLEOTIDICO IN GENEBANK (BLAST)  IDENTIFICAZIONE REGIONI FIANCHEGGIANTI SEQUENZE SELEZIONATE  SELEZIONE DEFINITIVA DI 56 PROBES PROBE ARRAY Meeting finale Progetto Me.Di.T.A. - Modena, 26 ottobre 2010

23 BATTERI (19 PR0BES) Meeting finale Progetto Me.Di.T.A. - Modena, 26 ottobre 2010

24 OGM (17 PROBES) Meeting finale Progetto Me.Di.T.A. - Modena, 26 ottobre 2010

25 OGM  Soia GTS 40-3-2 (3)  Mais BT176 (1)  Mais MON810 (3) Meeting finale Progetto Me.Di.T.A. - Modena, 26 ottobre 2010

26 OGM  Mais T25 (5)  Mais BT11 (2)  CaMV 35S Promotore (1)  Terminatore NOS (2) Meeting finale Progetto Me.Di.T.A. - Modena, 26 ottobre 2010

27 ALLERGENI (12 PROBES) EU183228 gene che codifica la Ara h 2 (conglutina) Z72440 gene che codifica l’allergene Cor a 1 K00821 gene che codifica la lectina 1 Meeting finale Progetto Me.Di.T.A. - Modena, 26 ottobre 2010

28 LIEVITI (4 PROBES) MUFFE (4 PROBES) AB462339 gene che codifica l’RNA 26S ribosomale di Pichia spp. FJ458446 gene che codifica l’RNA 18S ribosomale di Penicillium decumbens strain ML-017. Meeting finale Progetto Me.Di.T.A. - Modena, 26 ottobre 2010

29 FUNGHI TOSSIGENI (10 PROBES) Meeting finale Progetto Me.Di.T.A. - Modena, 26 ottobre 2010 AY885568 gene che codifica una isoepossidone-deidrogenasi AF047713 AF047713 gene che codifica una poligalatturonasi AY540952 gene che codifica una polichetidesintasi AY371490 gene che codifica la O-metiltransferasi XM002379900 gene che codifica la Versicolorina deidrogenasi GENI DELLA VIA BIOSINTETICA DELLE TOSSINE GENE CORRELATO ALLA MARCESCENZA CORRELATO ALLA MARCESCENZA

30 TUTTI I PRIMERS SONO STATI DISEGNATI NELLE REGIONI FIANCHEGGIANTI QUELLE SCELTE PER IL DISEGNO DELLE PROBES  PRIMERS universali 16S/23S (per BATTERI)  PRIMERS specifici (per BATTERI ed ALTRO) Meeting finale Progetto Me.Di.T.A. - Modena, 26 ottobre 2010

31 Attività 1.2 SVILUPPO DI 5 PCR MULTIPLEX PER LA GENERAZIONE DI MULTI- TARGETS SPECIFICI PER LA DETECTION DI BATTERI, OGM, ALLERGENI, FUNGHI TOSSIGENI E LIEVITI BATTERIOGMALLERGENI FUNGHI LIEVITI DNA estratti da batteri e lieviti in coltura pura e da campioni vegetali (Sorgente: NEOTRON) Meeting finale Progetto Me.Di.T.A. - Modena, 26 ottobre 2010 DNA da funghi in coltura pura e da campioni vegetali (Sorgente: ENEA) (Sorgente: ENEA)

32 Attività 1.2 SVILUPPO DI 5 PCR MULTIPLEX PER LA GENERAZIONE DI MULTI-TARGETS SPECIFICI PER LA DETECTION DI BATTERI, OGM, ALLERGENI, FUNGHI TOSSIGENI E LIEVITI BATTERIOGMALLERGENI FUNGHI LIEVITI 17 differenti specie batteriche 5 differenti OGM 3 allergeni Lieviti spp. Marcatore di DNA (100bp) 5 specie fungineTOSSIGENE Meeting finale Progetto Me.Di.T.A. - Modena, 26 ottobre 2010

33 CHIP PER DEPOSIZIONE PIATTAFORMA COMBIMATRIX Meeting finale Progetto Me.Di.T.A. - Modena, 26 ottobre 2010

34 5 PROBES + CN Probes pre-sintetizzate ed amino lincate in 5’ disegnate all’interno degli ampliconi generati dai PRIMERS universali 16S/23S (BATTERI) 17 PROBES + CN Meeting finale Progetto Me.Di.T.A. - Modena, 26 ottobre 2010

35 Totale delle PROBES disegnate (102) Meeting finale Progetto Me.Di.T.A. - Modena, 26 ottobre 2010

36 12544 SPOT 1632 SPOT Me.Di.T.A. 102 PROBES X 16 repliche 1164 Controlli di qualità Combimatrix + 27 PROBES X 10 repliche 270 SPOT p. Lambda Meeting finale Progetto Me.Di.T.A. - Modena, 26 ottobre 2010

37 PCR Marcatura mediante random PRIMERS e dNTPs marcati Ibridazione TARGET sul chip Incubazione per 3-4h Acquisizione immagini Normalizzazione dei dati Analisi dei dati Detection DNA contaminante Cy5 dCTP Cy5 dCTP Cy5 dCTP Cy5 dCTP Cy5 dCTP Cy5 Meeting finale Progetto Me.Di.T.A. - Modena, 26 ottobre 2010 MARCATURA TARGET ED IBRIDAZIONE SUL CHIP

38 PCR (35 cicli a 56 °C di annealing) DNA genomico Marcatura 37 °C per 2h Ibridazione Purificazione Scanning Cy5 Meeting finale Progetto Me.Di.T.A. - Modena, 26 ottobre 2010

39 PCR (35 cicli a 56 °C di annealing) DNA genomico Marcatura 37 °C per 2h Ibridazione Purificazione Scanning Cy5 Meeting finale Progetto Me.Di.T.A. - Modena, 26 ottobre 2010

40 PCR (35 cicli a 56 °C di annealing) DNA genomico Marcatura 37 °C per 2h Ibridazione Purificazione Scanning Cy5 S. aureus primers 16S B. cereus primers 16S C. jejuni primers 16S E. coli primers 23S Meeting finale Progetto Me.Di.T.A. - Modena, 26 ottobre 2010

41 SONDE OGM TESTATE SONDE OGM TESTATE Soia GTS 40-3-2 Soia GTS 40-3-2 Mais MON810 Mais MON810 Mais T25 Mais T25 Mais BT176 Mais BT176 Mais BT11 Mais BT11 Meeting finale Progetto Me.Di.T.A. - Modena, 26 ottobre 2010

42 OGM Mais MON810 + Mais T25 + Mais BT176 Soia GTS 40-3-2 + Mais T25 + Mais BT176 Mais MON810 Mais MON810 Mais T25 Mais T25 Mais BT176 Mais BT176 Soia GTS 40-3-2 Soia GTS 40-3-2 Mais T25 Mais T25 Mais BT176 Mais BT176 DNA AGGIUNTI NELLA PCR MULTIPLEX SONDE ATTIVATE CUTOFF DI DETECTION Intensità media Controllo negativo (Mus musculus immunoglobulin joining chain (Igj) #NM152839) + 5 volte deviazione standard della media Meeting finale Progetto Me.Di.T.A. - Modena, 26 ottobre 2010

43 OGM Soia GTS 40-3-2 + Mais T25 + Mais MON810 SoiaGTS 40-3-2 + Mais BT176 + Mais MON810 DNA AGGIUNTI NELLA PCR MULTIPLEX SONDE ATTIVATE Soia GTS 40-3-2 Soia GTS 40-3-2 Mais T25 Mais T25 Mais MON810 Mais MON810 SoiaGTS 40-3-2 SoiaGTS 40-3-2 Mais BT176 Mais BT176 Mais MON810 Mais MON810 CUTOFF DI DETECTION Intensità media Controllo negativo (Mus musculus immunoglobulin joining chain (Igj) #NM152839) + 5 volte deviazione standard della media Meeting finale Progetto Me.Di.T.A. - Modena, 26 ottobre 2010

44 Cor A1 di NOCCIOLA Cor A1 di NOCCIOLA ( ( gene Cor A1 #Z72440 ) Conglutina di ARACHIDE Conglutina di ARACHIDE (gene Ara h 2 #EU183228) Lectina di SOIA Lectina di SOIA (gene Lectina 1 #K00821 ) SONDE ALLERGENI TESTATE Meeting finale Progetto Me.Di.T.A. - Modena, 26 ottobre 2010

45 ALLERGENI Soia + Arachide Soia+ Nocciola Arachide + Nocciola DNA AGGIUNTI NELLA PCR MULTIPLEX SONDE ATTIVATE Cor A1 di NOCCIOLA Cor A1 di NOCCIOLA (gene Cor A1 #Z72440 ) Lectina di SOIA Lectina di SOIA (gene Lectina 1 #K00821 ) Conglutina di ARACHIDE Conglutina di ARACHIDE (gene Ara h 2 #EU183228) Lectina di SOIA Lectina di SOIA (gene Lectina 1 #K00821 ) Conglutina di ARACHIDE Conglutina di ARACHIDE (gene Ara h 2 #EU183228) Cor A1 di NOCCIOLA Cor A1 di NOCCIOLA (gene Cor A1 #Z72440 ) CUTOFF DI DETECTION Intensità media Controllo negativo (Mus musculus immunoglobulin joining chain (Igj) #NM152839) + 5 volte deviazione standard della media Meeting finale Progetto Me.Di.T.A. - Modena, 26 ottobre 2010

46 L. monocytogenes L. monocytogenes S. aureus S. aureus Salmonella spp. Salmonella spp. E.faecium E.faecium E.coli O157:H7 E.coli O157:H7 V.paraemoliticus V.paraemoliticus A.hydrophila A.hydrophila C.jejuni C.jejuni Shigella spp. Shigella spp. Y.enterocolitica Y.enterocolitica B.cereus B.cereus P.aeroginosa P.aeroginosa SONDE BATTERICHE TESTATE L.bulgaricus L.bulgaricus L.acidophilus L.acidophilus L.fermentum L.fermentum B.bifidum B.bifidum B.longum B.longum CEPPI PATOGENI CEPPI BATTERICI NON PATOGENI Meeting finale Progetto Me.Di.T.A. - Modena, 26 ottobre 2010

47 BATTERI L. monocytogenes S. aureus L. monocytogenes_16S L. monocytogenes_16S L. monocytogenes_23S L. monocytogenes_23S Controllo positivo_16S Controllo positivo_16S Controllo positivo_23S Controllo positivo_23S L. monocytogenes L. monocytogenes (Gene prfA #FJ041141) S.aureus_16S S.aureus_16S Controllo positivo_16S Controllo positivo_16S DNA AGGIUNTI NELLA PCR MULTIPLEX SONDE ATTIVATE CUTOFF DI DETECTION Intensità media Controllo negativo (Mus musculus immunoglobulin joining chain (Igj) #NM152839) + 5 volte deviazione standard della media Meeting finale Progetto Me.Di.T.A. - Modena, 26 ottobre 2010

48 BATTERI L.bulgaricus, L.acidophilus, L.fermentum, L.monocitogenes L.fermentum L. fermentum_16S L. fermentum_16S Controllo positivo_16S Controllo positivo_16S Controllo positivo_23S Controllo positivo_23S L.bulgaricus L.bulgaricus (Gene 23S #AB035485) L.acidophilus L.acidophilus (Gene 16S #AF182726) L.fermentum L.fermentum (Gene 16S #EU825662) L.monocitogenes L.monocitogenes (Gene prfA #FJ041141) DNA AGGIUNTI NELLA PCR MULTIPLEX SONDE ATTIVATE CUTOFF DI DETECTION Intensità media Controllo negativo (Mus musculus immunoglobulin joining chain (Igj) #NM152839) + 5 volte deviazione standard della media Meeting finale Progetto Me.Di.T.A. - Modena, 26 ottobre 2010

49 BATTERI Salmonella, E.faecium, E.coli O157:H7 V.paraemoliticus, A.hydrophila, Shigella spp Salmonella_spp_16S Salmonella_spp_16S E.faecium_16S E.faecium_16S E.coli O157:H7_23S E.coli O157:H7_23S Controllo positivo_16S Controllo positivo_16S Controllo positivo_23S Controllo positivo_23S V.paraemoliticus_16S V.paraemoliticus_16S V.paraemoliticus_23S V.paraemoliticus_23S A.hydrophila_16S A.hydrophila_16S Controllo positivo_16S Controllo positivo_16S Controllo positivo_23S Controllo positivo_23S DNA AGGIUNTI NELLA PCR MULTIPLEX SONDE ATTIVATE CUTOFF DI DETECTION Intensità media Controllo negativo (Mus musculus immunoglobulin joining chain (Igj) #NM152839) + 5 volte deviazione standard della media Meeting finale Progetto Me.Di.T.A. - Modena, 26 ottobre 2010

50 BATTERI E.faecium, A.hydrophila, L.acidophilus L.bulgaricus, L.acidophilus, Y.enterocolitica L.bulgaricus_16S L.bulgaricus_16S L.bulgaricus_23S L.bulgaricus_23S L.acidophilus_23S L.acidophilus_23S L.acidophilus L.acidophilus (Gene 16S #AF182726) A.hydrophila_16S A.hydrophila_16S Controllo positivo_16S Controllo positivo_16S Controllo positivo_23S Controllo positivo_23S L.acidophilus_23S L.acidophilus_23S L.acidophilus L.acidophilus (Gene 16S #AF182726) A.hydrophila_16S A.hydrophila_16S Controllo positivo_16S Controllo positivo_16S Controllo positivo_23S Controllo positivo_23S DNA AGGIUNTI NELLA PCR MULTIPLEX SONDE ATTIVATE CUTOFF DI DETECTION Intensità media Controllo negativo (Mus musculus immunoglobulin joining chain (Igj) #NM152839) + 5 volte deviazione standard della media Meeting finale Progetto Me.Di.T.A. - Modena, 26 ottobre 2010

51 BATTERI V.paraemoliticus, Y.enterocolitica, Salmonella Spp. C.jejuni, E.coli O157:H7, L.fermentum DNA AGGIUNTI NELLA PCR MULTIPLEX SONDE ATTIVATE V.paraemoliticus_16S V.paraemoliticus_16S V.paraemoliticus_23S V.paraemoliticus_23S A.hydrophila_16S A.hydrophila_16S Controllo positivo_16S Controllo positivo_16S Controllo positivo_23S Controllo positivo_23S C.coli_16S C.coli_16S C_jejuni_23S C_jejuni_23S Controllo positivo_16S Controllo positivo_16S Controllo positivo_23S Controllo positivo_23S CUTOFF DI DETECTION Intensità media Controllo negativo (Mus musculus immunoglobulin joining chain (Igj) #NM152839) + 5 volte deviazione standard della media Meeting finale Progetto Me.Di.T.A. - Modena, 26 ottobre 2010

52 A. carbonarius/niger A. carbonarius/niger A. parasiticus/A. flavus A. parasiticus/A. flavus P. expansum P. expansum SONDE FUNGHI TOSSIGENI TESTATE Meeting finale Progetto Me.Di.T.A. - Modena, 26 ottobre 2010

53 FUNGHI TOSSIGENI Meeting finale Progetto Me.Di.T.A. - Modena, 26 ottobre 2010 CUTOFF DI DETECTION Intensità media Controllo negativo (Mus musculus immunoglobulin joining chain (Igj) #NM152839) + 5 volte deviazione standard della media

54 VALIDAZIONE DEI PROTOCOLLI DI PRODUZIONE E DELL’EFFICACIA DEI TEST DNA CHIP ARRAY NELLA DIAGNOSTICA DI ROUTINE. Il DNA Chip Array è stato validato in via definitiva mediante l’uso di DNA estratto da matrici contaminate opportunamente trattate e ceppi batterici e fungini accresciuti in coltura pura SOIA GTS 40-3-2 MAIS BT176 MAIS MON810 MAIS T25 MAIS BT11 MATRICI FARINA MU020.3%0.4%0.7%/0.3% PRODOTTO DA FORNO C110.1%0.6%0.9%/0.2% MANGIME4.0%2.2%2.8%/0.6% MAIS GM T25///100.0%/ ARACHIDESOIANOCCIOLA MAIS1.0%// MAIS/1.0%/ MAIS//1.0% P. expansumA. parasiticus P. expansumA. flavusA. carbonarium I miscela+//// II miscela/++// III miscela//++/ IV miscela//+++ OGM FUNGHI TOSSIGENI ALLERGENI Risultato test Meeting finale Progetto Me.Di.T.A. - Modena, 26 ottobre 2010

55  Il capitolato tecnico prevedeva di produrre un DNA MicroArray in grado di identificare simultaneamente i seguenti bersagli: Salmonella spp., Listeria monocytogenes, Coliformi, E. Coli (O157 in particolare), Pseudomonas, Aeromonas, Vibrio, Enterococchi spp., Stafilococchi (aureus in particolare), Criptosporidium, Campilobacter, Lieviti e Muffe, Soia Roundup Ready GM, Mais Bt176 GM, Mais MON810 GM, Mais Bt11 GM, Mais T25 GM  Le 102 sonde presenti sul DNA MicroArray, sono in grado di interrogare simultaneamente 17 specie batteriche (L. monocytogenes, S. aureus, L.bulgaricus, L.acidophilus, L.fermentum, Salmonella spp., E.faecium, E.coli O157:H7, V.paraemoliticus, A.hydrophila, C.jejuni, B.bifidum, B.longum, Shigella spp., Y.enterocolitica, B.cereus, P.aeroginosa), 5 OGM (Soia Roundup Ready, Mais MON810, Mais T25, Mais Bt176, Mais Bt11), 3 Target per allergeni (Cor A1 di Nocciola, Conglutina di Arachide, Lectina di Soia) e 5 Target per funghi tossigeni (A. parasiticus, A. flavus, A. carbonarius, A. niger, P. expansum)  Riduzione complessità: sviluppo di 5 saggi (PCR multiplex) che interrogano tutti i bersagli. Il saggio di detection messo a punto può essere eseguito in un intervallo di tempo di 6-8 ore, consente la detection simultanea di trenta differenti bersagli con una netta riduzione dei tempi di analisi rispetto alle tecniche tradizionali. Meeting finale Progetto Me.Di.T.A. - Modena, 26 ottobre 2010

56 102 SONDE SVILUPPATO UN DNA MICROARRAY CONTENENTE 102 SONDE IN GRADO DI IDENTIFICARE SIMULTANEAMENTE 17 specie batteriche, 5 ogm, 3 target per allergeni, 5 target per funghi tossigeni CONCLUSIONI 5 SAGGI (PCR MULTIPLEX) 5 SAGGI (PCR MULTIPLEX) HANNO PERMESSO LA RILEVAZIONE DI TUTTI I BERSAGLI Me.Di.T.A. 30 BERSAGLI IL SISTEMA HA PERMESSO DI RILEVARE FINO A 30 BERSAGLI TEMPO DI ESECUZIONE DEL SAGGIO DI DETECTION SVILUPPATO: 6-8 ORE NETTA RIDUZIONE DEI TEMPI DI ANALISI RISPETTO ALLE TECNICHE TRADIZIONALI Meeting finale Progetto Me.Di.T.A. - Modena, 26 ottobre 2010 RIDUZIONE DELLA COMPLESSITA’

57 Meeting finale Progetto Me.Di.T.A. - Modena, 26 ottobre 2010 OR 1: MBA - METODI ANALITICI SU BATTERI CON TECNICA CHIP ARRAY E LORO EVOLUZIONI PUBBLICAZIONI MICROARRAY 2007-2010 1.Pubblicazione sottomessa su rivista internazionale, Impact Factor: 3,455. Guidarelli M., Carbone F., Mourgues F., Perrotta G., Rosati C., Bertolini P., Baraldi E., 2010. Transcriptional profiling of unripe and ripe strawberry (Fragaria × ananassa) fruits interacting with Colletotrichum acutatum provides new insights on fungal quiescence induction. Sottomesso su Molecular Plant Pathology ed in corso di revisione; 2.Pubblicazione su rivista internazionale con referee, Impact Factor: 4,351. Facella P.*, Lopez L.*, Carbone F.*, Galbraith D.W., Giuliano G., Perrotta G., 2008. Diurnal and circadian rhythms in the tomato transcriptome and their modulation by cryptochrome photoreceptors. PLoS ONE 3 (7), e2798 *Questi autori hanno contribuito egualmente al lavoro; 3.Estratto di partecipazione a congresso: Carbone F., Facella P., Lopez L., Bianco L., Perrotta G., 2009 Transcriptome analysis of diurnal responses in CRY2-OX and Wild-Type tomato plants. Proc. 53° Congresso SIGA (Società Italiana di Genetica Agraria), Torino, Italia, 16- 19 Settembre, poster 6.12; 4.Estratto di partecipazione a congresso: Lopez L., Carbone F., Bianco L., Facella P., Giuliano G., Perrotta G., 2009 Comparative proteomics analysis of diurnal responses in CRY2-OX and Wild-Type tomato plants. Proc. WG1 MEETING: Technical aspects inherent to Plant Proteomics "Classical and novel approaches in Plant Proteomics" COST FA0603, Viterbo, Italia, 5-8 maggio; 5.Estratto di partecipazione a congresso: Lopez L., Carbone F., Bianco L., Facella P., Giuliano G., Perrotta G., 2009 Comparative proteomics analysis of diurnal responses in CRY2-OX and Wild-Type tomato plants. Proc. IV Congresso nazionale annuale ItPA (The Italian Proteomic Association), Milano, Italia, 22-25 giugno, poster 088; 6.Estratto di partecipazione a congresso: Lopez L., Carbone F., Bianco L., Facella P., Giuliano G., Perrotta G., 2008 A combined proteome and transcriptome analysis of diurnal responses in CRY2-OX and Wild-Type tomato plants. Proc. 52° Congresso SIGA (Società Italiana di Genetica Agraria), Padova, Italia, 14-17 Settembre, poster C.29; 7.Estratto di partecipazione a congresso: Facella P., Lopez L., Carbone F., Giuliano G., Perrotta G., 2007. Cryptochromes can alterarate transcription fluctuations of photoreceptor and circadian regulated genes. Proc. 51° Congresso SIGA (Società Italiana di Genetica Agraria), Riva del Garda, Italia, 23-26 Settembre, comunicazione orale 5.03;

58 Meeting finale Progetto Me.Di.T.A. - Modena, 26 ottobre 2010 OR 1: MBA - METODI ANALITICI SU BATTERI CON TECNICA CHIP ARRAY E LORO EVOLUZIONI PUBBLICAZIONI 2007-2010 Del Fiore A., Reverberi, M., De Rossi, P., Tolaini, V., Fabbri A.A. and Fanelli, C. (2010) “PCR-Based Assay For The Early Detection Of Aflatoxigenic Fungi On Maize Kernels” Quality assurance and Safety of crops and foods. Vol. 2, Issue 1: 22-27. Tolaini V., Zjalic S., Reverberi M., Fanelli C., Fabbri A.A., Del Fiore A., De Rossi P. and Ricelli A. (2010) “Lentinula edodes enhances the biocontrol activity of Cryptococcus laurentii against Penicillium expansum contamination and patulin production in apple fruits”. International Journal of Food Microbiology. 138: 243–249. Del Fiore A., Reverberi M., Ricelli A., Pinzari F., Bonifazi G., Serranti S., Fabbri A.A. and Fanelli C. (2010) “Early Detection of Toxigenic Fungi on Maize by Hyperspectral Imaging Analysis” International Journal of Food Microbiology (accepted, in press) De Rossi P., Reverberi, M., Del Fiore A., Tolaini V., Ricelli A., Fabbri A.A. and Fanelli C. (2010)“Early identification of Aspergillus carbonarius in artificially and naturally contaminated grape berries by Real Time PCR” Quality assurance and Safety of crops and foods (in press). De Rossi P., Reverberi M, Del Fiore A., Tolaini V., Fabbri A.A. e Fanelli C. (2010) “Metodologie diagnostiche molecolari ai fini del rapido rilevamento in bacca d’uva del fungo tossigeno A. carbonarius” –Rapporto ISTISAN 2009- Le micotossine nella filiera agro-alimentare e zootecnica (in stampa). Del Fiore, A., Reverberi, M., De Rossi P, Tolaini V. and Fanelli, C. “Real time qPCR-Based Assay For The Early Detection Of Aflatoxigenic Fungi On Maize Kernels” (Book abstracts of 10th European Conference on Fungal Genetics (ECFG), Leeuwenhorst (Olanda) 29 marzo-1 aprile 2010). Del Fiore A., Reverberi M., Ricelli A, De Rossi P., Tolaini V., Fabbri A.A., Fanelli C. “Rapido rilevamento di funghi tossigeni in cariossidi di zea mays attraverso la spettroscopia di immagine”. (Atti del 3° Congresso nazionale: Le micotossine nella filiera agro-alimentare e zootecnica. Istituto Superiore di Sanità. Roma, 28-30 settembre 2009). Tolaini V., De Rossi P., Del Fiore A., Reverberi M., Fabbri A.A. and Fanelli, C. “Precoce rilevamento di Penicillium expansum, produttore di patulina, su pomacee mediante PCR Real Time”. Poster (Atti del 3°Congresso nazionale: Le micotossine nella filiera agro-alimentare e zootecnica. Istituto Superiore di Sanità. Roma, 28-30 settembre 2009). De Rossi P., Reverberi M., Ricelli A, Del Fiore A., Tolaini V., Fabbri A.A., Fanelli C. “Metodologie diagnostiche molecolari in bacca d'uva”. (Atti del 3°Congresso nazionale: Le micotossine nella filiera agro-alimentare e zootecnica. Istituto Superiore di Sanità., Roma, 28-30 settembre 2009). Del Fiore, A., Serranti, S., Ricelli, A., Reverberi, M., Fabbri A.A., Bonifazi, A. and Fanelli, C. “PCR And Spectral Imaging Based Assays For The Early Detection Of Aflatoxigenic Fungi On Maize Kernels”. (Book abstracts of 9th European Conference on Fungal Genetics (ECFG), Edimburgo 5-8 aprile 2008). Del Fiore A., Serranti S., Ricelli A., Reverberi M., Fabbri A.A., Bonifazi A. and Fanelli C. “Early Detection Of Aflatoxigenic Fungi On Maize Seeds.” (Atti del XIV Convegno SIPaV 18-21 Settembre 2007, Perugia, Italy).