VETTORI NON VIRALI.

Presentazione sul tema: "VETTORI NON VIRALI."— Transcript della presentazione:

1 VETTORI NON VIRALI

2 Vettori: veicolo per l’introduzione e l’espressione di un gene

3 VETTORI PER TERAPIA GENICA
Vettori virali: Vettori non virali: Adenovirus Retrovirus Virus adeno-associati Lentivirus (derivati da HIV) Herpesvirus Plasmidi nudi Elettroporazione in vivo Liposomi Amine, proteine cariche positivamente

4 VETTORE IDEALE Tropismo di espressione: per garantire la localizzazione del transgene sia a livello trasduzionale (il vettore infetta cellule specifiche), che a livello trascrizionale (il gene viene espresso solo in alcune cellule). Durata di espressione: per far sì che la terapia duri nel tempo. Livello di espressione: possibilmente regolabile. Efficacia clinica: test funzionali su modelli animali. Scarsa tossicità.

5 Durata della Trasduzione
Stabile o Transiente Espressioni stabili sono preferibili per malattie metaboliche Espressioni transienti sono preferibili per vaccini e tumori L’espressione dipende anche dalla replicazione cellulare

6 Geni Reporter Strumento utile per valutare l’avvenuta trasfezione, stabile o transiente
●Il gene reporter deve codificare per una proteina che non abbia analoghi funzionali nella cellula trasfettata ●Rivelazione con un sistema semplice e sensibile ●La proteina non deve interferire con il normale metabolismo cellulare

7 Geni Reporter Luciferasi: il gene luc, clonato dalla lucciola,codifica per un enzima che può essere facilmente rivelato fornendo il substrato Luciferina e rivelando l’emissione luminosa B-galattosidasi: L’enzima prodotto da questo gene catalizza la digestione di substrati come l’X-Gal che genera un prodotto colorato Green fluorescent protein (GFP): proteina autofluorescente

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9 Trasfezione transiente
Utilizzando un vettore che contiene un gene reporter è possibile fare studi di espressione nelle 48 h successive alla trasfezione Trasfezione stabile Richiede che il gene sia integrato nel genoma della cellula ospite. In genere il gene reporter codifica per un enzima che conferisce la capacità alla cellula di crescere in un terreno selettivo

10 Fasi fondamentali per il trasferimento genico in
sistemi non virali ●Impacchettamento del DNA ●Ingresso nelle cellule ●Eventuale rilascio dalle vescicole lisosomiali ●Trasporto nel nucleo ●Espressione del gene

11 Barriere Cellulari ed Extracellulari
membrane citoplasmatiche e nucleari, lisosomi, endonucleasi. barriera ematoencefalica, il sistema immunitario e fluidi corporei

12 VETTORI NON VIRALI Plasmidi nudi Promotori forti virali (CMV)
Bassi livelli di transgene, somministrazione locale Durata di espressione limitata Tossicità molto bassa Efficacia clinica solo quando sono necessarie basse quantità di transgene o immunizzazione E’ facilmente degradate dalle nucleasi dell’ospite: bassa efficienza

13 VETTORI NON VIRALI Plasmidi nudi Applicazioni: Vaccini a DNA
Espressione di molecole ad alta bioattività (ormoni) Terapia locale (tumori)

14 Precipitazione con Fosfato di Calcio
1973: Graham e van der Eb misero a punto il protocollo di precipitazione con fosfato di calcio: Il DNA viene mescolato ad una soluzione di CaCl2 e poi aggiunto ad una soluzione fisiologica contenente tampone fosfato. Si forma un precipitato costituito da fosfato di calcio e DNA che viene posto in contatto con le cellule da trasfettare. I precipitati sono incorporati da alcune cellule per endocitosi.

15 Precipitazione con Fosfato di Calcio
Vantaggi: Economico Svantaggi: ●L’efficienza bassa ●Elevata citotossicità Tecnicamente delicato, sono determinanti: Taglia e dimensioni del precipitato Variazioni anche minime del pH Non funziona con alcuni tipi cellulari come i linfociti

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17 DEAE-destrano Primo metodo utilizzato per l’introduzione massiva di DNA in un cellula eucariotica Destrano: polisaccaride costituito da unità di D-glucosio che associato a gruppi carichi positivamente DEAE (dietilamminoetile) è in grado di legare il DNA e di mediarne l’ingresso attraverso le membrane. Le cellule vengono preparate mediante shock osmotico con glicerolo o DMSO Vantaggi: molto semplice Svantaggi: poco efficiente solo trasfezioni transienti

18 METODI NON VIRALI Metodi fisici Metodi biochimici Metodi chimici

19 Metodi Fisici Pressione idrodinamica Metodo balistico
Metodi Fisici Pressione idrodinamica Metodo balistico Trasferimento mediato attraverso un campo elettrico Iniezione diretta nei tessuti

20 Metodi Biochimici polilisine associate a ligandi
"transferrinfection" (infezione specifica mediata dal recettore per la transferrina) Il DNA è coniugato con proteine che possono entrare nelle cellule per endocitosi. Vantaggio: di essere specificatamente indirizzati a determinate cellule, e tale specificità non è possibile con i metodi chimici.

21 Metodi Chimici liposomi cationici
policationi come DEAE dextrano, polietilenimmina complessi di polilisina

22 Pressione Idrodinamica
●Uso di volumi di iniezione estremamente elevati (equivalente al totale volume del sangue) ● Iniezione rapida ● Sistema ampiamente utilizzato per il gene delivery epatico ● Alta efficienza di “delivery” anche nelle cellule muscolari e renali

23 Hydroporation as the mechanism of hydrodynamic delivery
G Zhang1, X Gao1, YK Song2, R Vollmer1, DB Stolz3, JZ Gasiorowski4, DA Dean4 and D Liu1 Gene Therapy (2004) 11, 675–682

24 L’iniezione idrodinamica comporta cambiamenti nella funzione cardiaca e della pressione venosa: il volume iniettato che consente un efficiente rilascio epatico è approssimativamente uguale al totale volume del sangue di topo

25 L’iniezione idrodinamica causa una transiente alterazione
cardiaca

26 Effetto della iniezione idrodinamica sulla pressione venosa

27 Un valore di pressione di circa 40 mm Hg si ottiene con un
volume di iniezione corrispondente al 10% del peso corporeo

28 Formazione di pori di membrana

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31 MICROINIEZIONE Il DNA viene inserito direttamente nel nucleo della cellula: viene automaticamente superato il limite della barriera citoplasmatica e della degradazione lisosomiale. Trasduzione di singole cellule: linee germinali per ottenere animali transgenici.

32 Metodi Balistici Gene Gun Sistema della camera a vuoto

33 Parametri Fondamentali
●Velocità con cui la particella colpisce il target: Proiettili Velocità di accelerazione/decelerazione Distanza del target ●Rivestimento dei proiettili: Influenza fortemente l’efficienza ●Numero di particelle che entrano nel tessuto: Equilibrio tra efficienza e vitalità cellulare

34 Sistema della camera a vuoto
Sistema che accelera microproiettili d’oro o di tungsteno rivestiti di DNA su un bersaglio posto in una camera sottovuoto

35 METODI BALISTICI GENE GUN:
Bombardamento con particelle d’oro su cui è stato adsorbito Il DNA Lo sparo è ottenuto con un’onda supersonica di elio, che passando all’interno della cartuccia, proietta fuori il contenuto

36 METODI BALISTICI: APPLICAZIONI
Vaccinazioni a DNA Terapia genica suicida Immunomodulazione

37 Elettroporazione in vivo
Plasmidi con cassette di espressione Campo elettrico permealizza le cellule Somministrazione locale Livelli di transgene più alti Durata di espressione prolungata Tossicità molto bassa (scarica elettrica) Efficacia clinica solo quando sono necessarie basse quantità di transgene o immunizzazione

38 Elettroporazione in vivo
Parametri: ●Intensità di voltaggio ● Pulsazione\s (ampiezza, numero, frequenza) ● Configurazione dell’elettrodo ● Sito di rilascio Tutti i parametri vanno valutati per ogni applicazione

39 ELETTROPORAZIONE IN VIVO
Principio

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41 ELETTROPORAZIONE IN VIVO
Strumentazione e Applicazioni A e B: strumenti per elettroporazione C: elettroporazione in pelle D: elettroporazione in muscolo

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44 Intensità di Voltaggio
Time Course

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47 Trials clinici indicano l’avanzamento dell’elettroporazione in vivo per gene transfer
•Il primo studio clinico è stato iniziato nel 2004 al H. Lee Moffitt Cancer Center and Research Institute: I phase in pazienti con melanoma con metastasi sottocutanee accessibili. L’obiettivo primario è quello di determinare la tossicità e la massima dose tollerabile del plasmide codificante per IL-12 umana. Altri trials clinici: •Rilascio intramuscolare di vaccini per il cancro alla prostata (University of Southampton, UK) •Tumori esprimenti HER-2 e\o antigeni carcino-embrionario

48 Elettroporazione in vivo
VETTORI NON VIRALI Elettroporazione in vivo Applicazioni: Vaccini a DNA Espressione di molecole ad alta bioattività (ormoni) Terapia locale (tumori) Terapia locale (muscolo)

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52 VETTORI NON VIRALI Lipidi cationici
Formano dei liposomi con una superficie carica positivamente che consente l’associazione, senza internalizzazione, con il DNA e media l’interazione con la membrana plasmatica

53 Liposomi

54 F DURANTE LA PREPARAZIONE E LA CONSERVAZIONE
STABILITA’ DEI LIPOSOMI I liposomi possono presentare problemi di stabilità: F        IN VIVO F        DURANTE LA PREPARAZIONE E LA CONSERVAZIONE I liposomi preparati con fosfolipidi naturali (fosfatidilcolina) sono: •Facilmente permeabili ai mezzi biologici •Facilmente riconosciuti e fagocitati dalle cellule del sistema reticolo-endoteliale

55 Per aumentare la stabilità in vivo dei liposomi è possibile aggiungere ai fosfolipidi naturali:
4            •colesterolo   •lipidi a catena alchilica lunga e satura che stabilizzano il doppio strato riducendo la possibilità di attacco da parte delle lipoproteine ad alta densità In questo modo c’è una minore possibilità di adsorbimento delle opsonine e quindi del riconoscimento delle cellule del SRE

56 4          l’assenza di carica superficiale diminuisce la capacità di interazione con le cellule del RES, la presenza di carica negativa (e a volte anche di quella positiva) facilita la cattura da parte dei macrofagi 4            liposomi di dimensioni superiori a 200 nm sono più facilmente riconosciuti e catturati dai macrofagi. Liposomi di dimensioni inferiori a 100 nm risultano stabili in vivo.

57 Quindi la stabilità in vivo dei liposomi dipende da:
•Composizione della fase lipidica •Carica superficiale •Dimensioni

58 Per aumentare la stabilità in circolo dei liposomi, recentemente, è stato proposto di rivestire la superficie con polimeri idrofili (es. PEG) che sono in grado di impedire la interazione dei liposomi con le opsonine responsabili del riconoscimento da parte delle cellule del RES. In questo modo i liposomi diventano invisibili e non vengono attaccati e rimossi dal circolo e per questo sono anche detti stealth o a lunga circolazione (LCL). Questa condizione è indispensabile per progettare sistemi a rilascio prolungato.

59 Liposomi Vantaggi: Si può usare in sistemi cellulari dove
il fosfato di calcio e il destrano non funzionano bene come nel caso di cellule in sospensione Bassa tossicità Svantaggi: La produzione non è semplice Efficienza bassa Passaggio critico: incapsulamento DNA

60 PREPARAZIONE DEI LIPOSOMI
Dissoluzione fosfolipidi e altri componenti liposolubili in un solvente organico molto volatile (es. cloroformio) Evaporazione del solvente in evaporatore rotante FILM LIPIDICO Idratazione con soluzione acquosa tamponata a T›Tm sotto agitazione Sonicazione ed evaporazione LIPOSOMI LUV LIPOSOMI MLV Sonicazione LIPOSOMI SUV

61 VETTORI NON VIRALI Lipidi cationici Dominio idrofobico Spacer
Dominio cationico

62 Vantaggi dei liposomi cationici
●Presentano un elevato profilo di sicurezza rispetto ai vettori virali ●Possono contenere DNA di grandi dimensioni ●La trasfezione non richiede la divisione cellulare

63 Limiti dei liposomi cationici
Il principale limite dei sitemi liposomiali consiste nella scarsa selettività

64 Lipidi cationici associati a DNA
VETTORI NON VIRALI Lipidi cationici associati a DNA

65 VETTORI NON VIRALI liposomi Applicazioni:
Vaccini (infezione di macrofagi) Vaccini antitumorali Terapia ex-vivo

66 VETTORI NON VIRALI Poliamine
Proteine cariche positivamente che legano il DNA Coniugate con un ligando che da la specificità di tropismo Durata di espressione discreta Livelli di espressione bassi Tossicità molto bassa Efficacia clinica solo quando sono necessarie basse quantità di transgene

67 VETTORI NON VIRALI Poliamine Ligando Spacer Dominio cationico

68 Poliamine associate a DNA
VETTORI NON VIRALI Poliamine associate a DNA

69 VETTORI NON VIRALI Poliamine Applicazioni: Vaccini a DNA
Vaccini antitumorali Terapia ex-vivo

70 Transferrinfection ●Metodo di trasfezione che utilizza il pathway fisiologico per l’endocitosi recettore transferrina (Tf)-mediato. ● Tf è legato chimicamente a policationi che condensano il DNA. ● Polylysine (Tf-pLys) e polyethylenimine (Tf-PEI).

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72 Policationi peptidici
Vantaggi: Riconoscimento specifico della cellula Svantaggi: Limite dovuto al tipo di impacchettamento del DNA che ne influenza la traslocazione in membrana Necessità di coadiuvanti che favoriscano il rilascio del complesso nel citoplasma

73 Trasfezione con PEI Macromolecola organica con elevata capacità di cariche positive: ogni tre atomi c’è un gruppo amminico che può essere protonato Il complesso PEI-DNA all’interno dell’endosoma si lega ai protoni stimolando l’ingresso degli ioni cloro, questo porta alla rottura dell’endosoma con conseguente rilascio del complesso nel citoplasma

74 Trasfezione con PEI Vantaggi: Svantaggi:
Favorisce il passaggio citoplasma-nucleo Non ostacola l’espressione genica Poco costoso Svantaggi: Efficienza non sempre elevata Può essere citotossico

75 VETTORI NON VIRALI Vantaggi Tossicità minima o assente
Facili da produrre Buona trasduzione di alcuni tipi cellulari Non ci sono limiti alla grandezza del transgene Utili per terapia locale

76 VETTORI NON VIRALI Svantaggi Livelli bassi di espressione
Espressione transiente