Il principio della ChIP: arricchimento selettivo della frazione di cromatina contenente una specifica proteina La ChIP può anche esser considerata.

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4 Il principio della ChIP: arricchimento selettivo della frazione di cromatina contenente una specifica proteina La ChIP può anche esser considerata una strategia di reverse-genetics su scala genomica

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11 -La qualità dell’anticorpo è fondamentale in questa fase - Deve riconoscere la proteina legata al DNA - Deve essere altamente specifico -Necessaria una pre-taratura per ridurre il legame aspecifico -Gli immunocomplessi sono poi precipitati con ProtG/A Sepharose (lega la regione Fc dell’anticorpo) - lavaggi stringenti riducono il background

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15 DNA-binding proteins are crosslinked to DNA with formaldehyde in vivo. Isolate the chromatin. Shear DNA along with bound proteins into small fragments. Bind antibodies specific to the DNA-binding protein to isolate the complex by precipitation. Reverse the cross-linking to release the DNA and digest the proteins. Use PCR to amplify specific DNA sequences to see if they were precipitated with the antibody.

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17 ChIP seq experiment In Nutshell Protein cross-linked to DNA in vivo by treating cells with formaldehyde Shear chromatin (sonication) IP with specific antibody Reverse cross-links, purify DNA PCR amplification * Identify sequences Genome-wide association map *-unless using a single molecule sequencer

18 History: From ChIP-chip to ChIP-seq ChIP-chip (c.2000) Resolution (30-100bp) Coverage limited by sequences on the array Cross-hybridization between probes and non-specific targets creates background noise

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