Electronic spectroscopy: various techniques Prof. C. Altucci.

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1 Electronic spectroscopy: various techniques Prof. C. Altucci

2 La fluorescenza La spettroscopia di fluorescenza è un potente strumento per lo studio delle strutture e delle dinamiche molecolari, in fisica, chimica e biologia. Sebbene la normale spettroscopia di fluorescenza a stato stazionario sia caratterizzata da un’elevata sensibilità, informazioni più dettagliate sul microambiente molecolare possono essere ottenute sfruttando la dipendenza temporale del segnale di fluorescenza.

3 La fotoluminescenza è l’emissione di luce da stati elettronici eccitati di una qualsiasi sostanza. La fotoluminescenza si distingue in fluorescenza o fosforescenza: Nella fluorescenza, l’emissione avviene dallo stato di singoletto, nel quale l’elettrone eccitato è accoppiato con spin opposto all’elettrone dello stato fondamentale. Il ritorno allo stato fondamentale è una transizione permessa per spin ed avviene rapidamente con l’emissione di un fotone. Il rate di emissione della fluorescenza è tipicamente di 10 8 s -1. Nella fosforescenza invece l’emissione avviene dallo stato di tripletto, nel quale l’elettrone ha la stessa orientazione di spin dello stato fondamentale. Le transizioni allo stato fondamentale sono proibite; pertanto il rate di emissione di fosforescenza è piuttosto lento (10 3 s -1 ).

4 I fluorofori sono le sostanze che emettono la radiazione di fluorescenza e possono essere classificati come intrinseci ed estrinseci: i fluorofori intrinseci (feninlananina, tyrosina, triptofano, fad) sono ampiamente diffusi nei tessuti biologici ed emettono fluorescenza in modo naturale. Quando la fluorescenza intrinseca non è sufficientemente intensa per la realizzazione di certi esperimenti, come ad esempio nel caso del DNA e dei lipidi, l’emissione di fluorescenza viene ottenuta per mezzo dei fluorofori estrinseci (fluoresceina, rodamina etc.). Questi si accumulano prevalentemente in cellule e tessuti affetti da patologie; pertanto, in seguito all’esposizione a luce di opportuna lunghezza d’onda, la patologia risulterà evidenziata dalla comparsa di un segnale di fluorescenza maggiore rispetto a quello emesso dal tessuto circostante.

5 Diagramma di Jablonski La relazione tra l’assorbimento di luce e l’emissione di fluorescenza viene generalmente illustrata per mezzo del cosiddetto diagramma di Jablonski ABS Internal conversion k i ~ 10 12 s -1 Inter-system crossing k x ~ 10 4 – 10 12 s -1 Fluorescence k f ~ 10 7 – 10 9 s -1 FL Phosphorescence k ph < 10 6 s -1 PH ABS = assorbimento IC = conversione interna CQ= quenching collisional ISC = inter-system crossing FL = fluorescenza PH = fosforescenza La fluorescenza è osservata se k f ~> k i + k x Il tempo speso da una molecola in uno suo stato eccitato è determinato dalla somma delle costanti cinetiche di tutti i processi di diseccitazione IC

6 Cosa si intende per “vita media” di un fluoroforo? I processi di assorbimento e di emissione sono quasi sempre studiati su popolazioni di molecole e le proprietà di un singolo membro della popolazione sono dedotte dalle proprietà mascroscopiche del processo. In generale il comportamento di una popolazione di fluorofori eccitati è descritto dalla familiare rate equation: Che descrive la variazione per unità di tempo delle molecole eccitate all’istante t

7 Integrando si ottiene: La vita media  è uguale a k -1 Se una popolazione di fluorofori è eccitata, la vita media  è il tempo richiesto perchè il numero di molecole eccitate decada a 1/e o del 36.8% dal valore iniziale, essendo:

8 La costante di diseccitazione k è la somma delle costanti di tutti i possibili canali di diseccitazione: k = k f + k i + k x + k ET + …= k f + k nr k f è la costante di decadimento di fluorescenza, k i di decadimanto per conversione interna, k x la costante di decadimento per inter-system crossing, k ET la costante di trasferimento di energia inter-molecolare e k nr è la somma delle costanti dei decadimenti non radioativi

9 Processi non radioativi: Molecole isolate in “fase gassosa” subiscono solo conversione interna e inter-system crossing Nella fase condensata si aggiungono ulteriori meccanismi dovuti all’interazione con il microambiente: reazioni chimiche allo stato eccitato, trasferimento di energia,… La vita media del triptofano nelle proteine varia da ~0.1 ns a ~8 ns Coumarine in etanolo ha una vita media di 4 ns Isoalloxazina in acqua ha una vita media di 4.5 ns

10 La vita media radioativa  r = k f -1 è praticamente costante per una data molecola La vita media di fluorescenza  = k -1 = (k f + k nr ) -1 dipende dal microambiente attraverso k nr. Quantum yield di fluorescenza: È proporzionale alla vita media di fluorescenza L’aggiunta di un ulteriore percorso di decadimento non radioativo aumenta k nr diminuisce  e quindi QY. L’intensità di fluorescenza I (t) = k f n*(t) è proporzionale a n*(t) e vice versa

11 Lo Stokes shift consiste nel fatto che la fluorescenza avviene per energia del fotone minore (lunghezza d’onda maggiore) di quella della radiazione di eccitazione Gli spettri di emissione sono indipendenti dalla lunghezza d’onda di eccitazione. L’energia in eccesso viene rapidamente dissipata (10 -12 s). La regola dello specchio.

12 Tempi di diffusione in soluzione. L’energia in eccesso viene rapidamente dissipata (10 -12 s): x 2 =2D. Ad esempio: per l’ossigeno in acqua D  2.510 -5 cm 2 /s, se la vita media del fluoroforo è 10 ns otteniamo x  70 Å che è paragonabile allo spessore di una membrana biologica o alla dimensione lineare di una proteina. La spettroscopia in assorbimento rende informazioni sulla struttura dello stato fondamentale. La spettroscopia in fluorescenza/emissione rende informazioni sulla struttura dello stato eccitato.

13 UV-VIS transient absorption experiment: The output of one OPA is used as a pump, exciting the sample. The second OPA provides the probe and reference beams. The probe is focused and overlapped with the excitation beam at the sample position. The ratio I probe/ I ref as a function of time is the signature of the recovery time of the ground state population in the excited sample.

14 Up-conversion experiment: A pump beam (blue) excites the molecule and the fluorescence is collected by two off-axis parabolic mirrors. The fluorescence (green) corresponding to excitation volume is imaged and overlapped with a gate pulse (red) in a b-BBO crystal. For the duration of the gate beam, a sum-frequency signal is generated at the crystal, collected, and dispersed by a monochromator, and detected by a PMT. By varying the delay between excitation and gate pulses we can map the temporal behavior of the photoluminescence.

15 Fluorescence anisotropy Several phenomena can decrease the measured anisotropy to values lower than the maximum theoretical ). values. The most common cause is rotational diffusion (Figure 1.15). Such diffusion occurs during the lifetime of the excited state and displaces the emission dipole of the fluorophore. Measurement of this parameter provides information about the relative angular displacement of the fluorophore between the times of absorption and emission. In fluid solution most fluorophores rotate extensively in 50 to 100 ps. Hence, the molecules can rotate many times during the 1–10 ns excited-state lifetime, and the orientation of the polarized emission is randomized. For this reason fluorophores in non-viscous solution typically display anisotropies near zero. Transfer of excitation between fluorophores also results in decreased anisotropies.

16 Perrin equation The effects of rotational diffusion can be decreased if the fluorophore is bound to a macromolecule. For instance, it is known that the rotational correlation time for the protein human serum albumin (HSA) is near 50 ns. Suppose HSA is covalently labeled with a fluorophore whose lifetime is 50 ns. Assuming no other processes result in loss of anisotropy, the expected anisotropy is given by the Perrin equation: where r 0 is the anisotropy that would be measured in the absence of rotational diffusion, and θ is the rotational correlation time for the diffusion process. In this case binding of the fluorophore to the protein has slowed the probe's rate of rotational motion. Assuming r 0 = 0.4, the anisotropy is expected to be 0.20.

17 Resonance Energy Transfer Another important process that occurs in the excited state is resonance energy transfer (RET). This process occurs whenever the emission spectrum of a fluorophore, called the donor, overlaps with the absorption spectrum of another molecule, called the acceptor. Such overlap is illustrated in Figure 1.16. The acceptor does not need to be fluorescent. It is important to understand that RET does not involve emission of light by the donor. RET is not the result of emission from the donor being absorbed by the acceptor. Such reabsorption processes are dependent on the overall concentration of the acceptor, and on non-molecular factors such as sample size, and thus are of less interest. There is no intermediate photon in RET. The donor and acceptor are coupled by a dipole–dipole interaction. For these reasons the term RET is preferred over the term fluorescence resonance energy transfer (FRET), which is also in common use. The extent of energy transfer is determined by the distance between the donor and acceptor, and the extent of spectral overlap. For convenience the spectral overlap (Figure 1.16) is described in terms of the Förster distance (R 0 ). The rate of energy transfer is kT(r) r is the distance between the donor (D) and acceptor (A),  D is the lifetime of the donor in the absence of energy transfer. The efficiency of energy transfer for a single donor– acceptor pair at a fixed distance is

18 The Förster distances are comparable in size to biological macromolecules: 30 to 60 Å. For this reason energy transfer has been used as a "spectroscopic ruler" for measurements of distance between sites on proteins. Resonance Energy Transfer (2) = the fluorescence quantum yield of the donor in absence of the acceptor  2 = the dipole orientation factor n = the refractive index of the medium J = the overlapping integral f D = the normalized donor emission spectrum  A = the acceptor molar extinction coefficient, being the absorbance A=  A cl, c being the concentration and l the pathlength κ 2 =2/3 is often assumed. This value is obtained when both donors and acceptors are freely rotating and can be considered to be isotropically oriented during the excited state lifetime. If either species are fixed or not free to rotate, then κ 2 =2/3 will not be a valid assumption. In most cases, however, even modest reorientation of the fluorophore results in enough orientational averaging that κ 2 = 2/3 does not result in a large error in the estimated energy transfer distance due to the sixth power dependence of R 0 on κ 2. Even when κ 2 is quite different from 2/3 the error can be associated with a shift in R 0 and thus determinations of changes in relative distance for a particular system are still valid. Fluorescent proteins do not reorient on a timescale that is faster than their fluorescence lifetime. In this case 0 ≤ κ 2 ≤ 4.

19 Let’s focus on TCSPC. How to measure the fluorescence lifetime? Le molecole sono eccitate da un impulso molto breve(prossimo ad una  ) all’istante t = 0. Si misura l’intensità del decadimento di fluorescenza solitamente tramite un sistema Time Correlated Single Photon Counting (TCSPC) Dominio del tempo Il decadimento di fluorescenza reale è una convoluzione con il profilo dell’impulso di eccitazione La funzione di risposta dello strumento i REF è tipicamente misurata come la risposta dello strumento all’impulso di eccitazione. Il decadimento di fluorescenza misurato è la convoluzione del decadimento reale con la risposta del rivelatore

20 Steady-state and time-resolved regimes While steady-state fluorescence measurements are simple, nanosecond time-resolved measurements typically require complex and expensive instrumentation. Given the relationship between steady-state and time-resolved measurements, what is the value of these more complex measurements? It turns out that much of the molecular information available from fluorescence is lost during the time averaging process.

21 Dominio del tempo La funzione di risposta dello strumento i REF iè tipicamente misurata come la risposta dello strumento all’impulso di eccitazione. I parametri di I(t) sono usualmente ottenuti da un fitting non lineare combinato con una procedura di deconvolution. La deconvoluzione non è necessaria quando l’impulso di eccitazione è molto breve rispetto alla vita media e/o la precisione delle determinazione della vita media non è richiesta.

22 Decadimento mono-esponenziale Decadimento multi-esponenziale (almeno due vite medie distinte) Un’analisi analoga è effettuata nel caso di decadimento multi-esponenziale per estrarre le vite medie τ i e le frazioni α i. Un aumento del numero dei parametri nel fitting costituisce un aumento del rischio di artefatti (più di 3 vite medie non sono raccomandate). In alternativa il metodo della massima entropia può essere usato per analizzare distribuzioni continue di vite medie. Esposito R., Altucci C., Velotta R., Analysis of Simulated Fluorescence Intensities Decays by a New Maximum Entropy Method Algorithm, Journal of Fluorescence, 23, 203-211, 2012 Mean lifetime – il tempo che mediamente una molecola spende nel suo stato eccitato

23 La fluorescenza del FAD Il FAD, Flavina Adenina Dinucleotide, è un importante coenzima ossido riduttivo che funge da accettore di elettroni e protoni. Le due basi azotate che lo compongono sono la flavina (o gruppo isoalloxazinico) e l’adenina, legati a due zuccheri, rispettivamente il ribitolo e il ribosio, formando così i due nucleosidi, la riboflavina e l’adenosina, tenuti insieme da un pirofosfato mediante due legami fosfoesterici.

24 L'anello di isoalloxazina è responsabile dell'emissione di fluorescenza del FAD nello spettro del visibile secondo tempi di decadimento che sono influenzati dalla sua interazione con l'anello aromatico di adenina. Schematicamente la FAD esiste in due distinte conformazioni: una conformazione aperta in cui la molecola è ben distesa una conformazione chiusa in cui l'isoalloxazina e l'adenina sono impilate l'una sull'altra. exc = 405 nm

25 La fluorescenza del FAD dipende dal pH della soluzione acquosa. In soluzione acquosa a pH neutro, il decadimento di fluorescenza è bi-esponenziale  1 = 80 %  1 = 300 ps per la “forma chiusa”  2 = 20 %  2 = 2800 ps per la “forma aperta” Per pH 8, l’equilibrio si sposta verso la “forma aperta” (minore attrazione dipolare tra isoalloxazina e adenina) 22 22 pH Esposito R., Ventura B.D., de Nicola S., Altucci C., Velotta R., Mita D.G., Lepore M., Glucose sensing by time- resolved fluorescence of sol-gel immobilized glucose oxidase, Sensors, 11, 3483-3497, 2011

26 Apparato strumentale. La strumentazione usata nell'esperienza è principalmente costituita da : un laser impulsato con frequenza di ripetizione di 40 Mhz, potenza media 2 mW, larghezza nominale dell'impulso 80 ps, lunghezza d'onda λ = 405 nm. Un rivelatore veloce basato sulla tecnica time-correlated single photon counting (TCSPC) in grado di seguire l'evoluzione temporale dei fenomeni di fluorescenza con tempi di vita media da 50 ps a 50 ns circa.