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Cosè la terapia genica? Per terapia genica (Gene Therapy) si intende l'inserzione di materiale genetico (DNA) allinterno delle cellule al fine di poter.

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Presentazione sul tema: "Cosè la terapia genica? Per terapia genica (Gene Therapy) si intende l'inserzione di materiale genetico (DNA) allinterno delle cellule al fine di poter."— Transcript della presentazione:

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2 Cosè la terapia genica? Per terapia genica (Gene Therapy) si intende l'inserzione di materiale genetico (DNA) allinterno delle cellule al fine di poter curare delle patologie. Questa procedura di inserzione è nota come transfezione.

3 La storia 50-60: il trasferimento genico in cellule animali portava alla sintesi di proteine e di anticorpi contro di esse : nei primi test di terapia genica le proteine sintetizzate a partire dai geni transfettati venivano eliminate dal sistema immunitario. 80: progressi nel campo della biologia molecolare permettevano di modificare il DNA di batteri e microrganismi in modo tale da indurli a produrre determinate molecole. In seguito, gli scienziati decisero di provare ad utilizzare le mutazioni indotte per curare le malattie umane.

4 Caratteristiche perché sia efficace: Trasferimento effettuato con successo, Durata dellespressione, Assenza di reazioni immunitarie, Attenzione nella procedura.

5 Tipologie di terapia genica: Dalle cellule delle linea germinale Dalle cellule della linea somatica: IN VIVO EX VIVO

6 Si tratta della tipologia che venne messa in pratica per prima e consiste nel prelievo delle cellule somatiche della persona interessata. Esse, successivamente, vengono messe in cultura in laboratorio. Durante questo tempo vengono trasfettate con il gene dinteresse, inserito tramite un apposito vettore (spesso virale), e successivamente vengono reinfuse o reimpiantate nel corpo del soggetto. Tale procedura è sicuramente la più lunga e la più costosa delle due ma permette di selezionare ed amplificare le cellule dinteresse ed inoltre gode duna maggior efficienza.

7 IN VIVO Viene attuata in tutti quei casi in cui le cellule non possono essere messe in cultura o prelevate o reinfuse come quelle del cervello o del cuore e della maggior parte degli organi interni. In questo caso il gene dinteresse viene inserito, tramite un opportuno vettore, nellorganismo direttamente per via locale o sistemica.

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9 Come ottenere il gene da transfettare: Conoscendo la fisiopatologia della malattia da curare, si selezionano i geni alterati e si ricavano di conseguenza quelli terapeutici. Il gene viene isolato, amplificato e sequenziato. Grazie alla biologia molecolare, si costruiscono filamenti di DNA con il gene in questione.

10 Tipologie di trasferimento : 1.Il gene si integra nel genoma dellospite e si trasmette alle cellule figlie (si usa nelle malattie genetiche quando serve un gene che si replichi in maniera stabile). 2.Il gene rimane nella cellula sottoforma di particella episomiale, che quindi non viene trasmessa alle cellule figlie ma si manifesta codificando per proteine etc. particella episomiale 3.La particella episomiale viene associata ad unorigine di replicazione, una sequenza di DNA che permette laggancio delle polimerasi cellulare, per cui lepisoma viene trasmesso alle cellule figlie.

11 Trasferimento genico VIRALE NON VIRALE

12 Iniezione di DNA nudo; Inserimento tramite liposomi (polimeri cationici); liposomi cationici Bombardamento tramite particelle (gene gun). NON VIRALE

13 DNA NUDO Vantaggi:facilità a produrlo in elevate quantità ed a purificarlo; Svantaggi:è facilmente degradabile dalle endonucleasi dellospite, lefficienza di trasformazione del DNA è relativamente bassa.

14 LIPOSOMI Sono vescicole lipidiche artificiali, dotate di carica positiva, in grado di incorporare DNA a carica negativa (che viene rilasciato nel citoplasma della cellula ospite, la quale in seguito lo integra nel nucleo). Entrano nelle cellule per endocitosi. Vantaggi:sono molto più sicuri dei vettori virali, contengono molto materiale genetico, perché transfettino una cellula questa non deve essere per forza in divisione. Svantaggi: solo lo 0,1% del DNA viene espresso.

15 GENE GUN Consiste nellutilizzo di particolari strumenti elettrici o ad alta pressione, detti cannoni genici (gene gun), che permettono di inviare nella cellula particelle microscopiche doro o di tungsteno ricoperte da DNA. Al momento non esistono studi sulluomo di questa metodica ma solo su animali.

16 I vettori virali devono avere determinate caratteristiche: Le particelle virali ricombinanti devono essere difettive rispetto alla replicazione, Il virus non deve essere pericoloso, Deve esserci spazio a sufficienza per il gene terapeutico (vincolo di dimensione). I virus più studiati come possibili vettori da utilizzare nella terapia genica sono: Retrovirus, Adenovirus, Lentivirus, Virus adenoassociati, Herpesvirus. VIRALE

17 RETROVIRUS Sono formati da due filamenti di RNA con un capside di proteine ed un involucro lipidico. Grazie allenzima trascrittasi inversa, a partire dal RNA si ricava il DNA che poi si integra nel genoma dellospite grazie allintegrasi. Vantaggi: attitudine allinfezione di numerose linee cellulari, lelevata efficienza nellintegrazione del gene terapeutico nel genoma, che poi viene trasmesso anche alle cellule figlie. Svantaggi: è complessa la procedura di purificazione dal mezzo di coltura. Il genoma retrovirale, inoltre, si può integrare in quello cellulare solo quando la membrana nucleare è assente e di conseguenza solo le cellule replicanti possono esser infettate. Un altro problema deriva dal fatto che il gene virale si integra nel genoma in modo relativamente casuale, provocando inserzioni mutageniche con potenziale danno alle cellule. Il vincolo di dimensione è stretto e costa molto utilizzarli.

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19 I lentivirus appartengono alla famiglia dei retrovirus di cui condividono la morfologia ed il ciclo replicativo. Vantaggi: possono infettare anche cellule non replicanti (perché passano attraverso la membrana nucleare), il che li rende dei buoni candidati per modificare lespressione delle cellule a differenzizione terminale. Svantaggi: essendo facile che questi virus vadano incontro a ricombinazione genetica, permane il rischio di dare origine ad un virus infettante (è per questo che non ci sono studi di lentivirus applicati alluomo). LENTIVIRUS

20 ADENOVIRUS Gli adenovirus sono patogeni naturali delluomo, con DNA a doppio filamento, e che causano solamente il comune raffreddore. Vantaggi: infettano molti tipi di cellule con grande facilità, le infettano anche se non sono in divisione, il DNA virale esiste come episoma e non si inserisce quindi nel genoma delle cellule bersaglio (evitando così il rischio di cancro). Svantaggi: rapida inattivazione delle cellule infettate, inoltre avviene una perdita progressiva dellepisoma per cui la sua espressione risulta transitoria.

21 VIRUS ADENOASSOCIATI Appartengono alla classe dei parvovirus, cioè piccoli virus a DNA che necessitano della coinfezione con un adenovirus per potersi replicare. Gli AAV si replicano come virus a DNA a doppio filamento, ma si impacchettano come virus a DNA a filamento singolo. Si utilizzano, se non modificati, perchè si integrano nel genoma bersaglio in uno specifico locus del cromosoma 19, eliminando il rischio di inserzioni casuali. Vantaggi: non causano nessuna patologia nelluomo, per cui non ci sono reazioni immunitarie (e quindi i loro effetti durano a lungo). Svantaggi: trasportano solo 4kb di geni, cioè la metà4kb rispetto agli adenovirus.

22 HERPESVIRUS Non si integrano nel genoma dellospite, ma possono essere trattenuti allinterno dei neuroni, in forma più o meno innocua, per tutta la vita del paziente. Vantaggi: sono 5 volte più grandi degli adenovirus, di conseguenza contengono più geni; agiscono sulle cellule non in divisione ed hanno un ampio spettro dinfezione (quasi tutte le cellule dello organismo).

23 RIASSUMENDO

24 PROBLEMI CHE SI POSSONO PRESENTARE: Possono insorgere malattie immunitarie in pazienti con il sistema immunitario compromesso (anziani, persone sottoposte alla chemio etc); Alcune mutazioni possono riattivare la pericolosità del virus utilizzato (se si utilizza), come vettore; Reazioni allergiche.

25 LA CURA DELLA EPIDERMOLISI BOLLOSA EB:devastante malattia genetica della pelle che provoca il distacco dello strato superficiale, lepidermide, da quello più profondo, il derma. Ricercatori: Michele De Luca, Fulvio Mavilio Un adulto di 36 anni, colpito dalla forma non letale di epidermolisi bollosa, chiamata giunzionale (JEB), è stato arruolato per una sperimentazione clinica detta di fase I/II: uno studio pilota in cui per la prima volta un nuovo trattamento viene somministrato a un paziente per cercare di curare una malattia. Il risultato conseguito in questa fase consente di trarre indicazioni circa lefficacia del trattamento e, in caso positivo, fornisce elementi per le giuste dosi e per la stesura dei relativi protocolli di somministrazione. La malattia dipende da un difetto nel gene per la catena beta 3 della laminina 5, una proteina che permette che lepidermide si attacchi al derma e senza la quale la pelle si stacca con conseguenti infiammazione e infezione. Per la prima volta, cellule staminali provenienti dallepidermide del paziente, prelevate con una biopsia cutanea, sono state corrette geneticamente mediante linserimento di un vettore retrovirale della versione sana del gene malato (terapia genica), e fatte crescere in laboratorio. La crescita è stata seguita fino a ottenere nove lembi di epidermide, sufficientemente grandi da poter essere trapiantati su due zone delle gambe del malato. Il mantenimento della nuova epidermide dipende dalla presenza di cellule staminali geneticamente corrette che garantiscono il rinnovo del tessuto. È la prima volta che una malattia genetica della pelle viene curata grazie a un intervento che unisce la terapia genica alla terapia cellulare. Dopo aver concluso questo studio clinico, il prossimo passo sarà estendere questo trattamento ad altre malattie genetiche della pelle e a malattie di altri epiteli, come per esempio le distrofie corneali, malattie invalidanti che portano a cecità.

26 LA CURA DELLA SCID SCID=Sindrome da immunodeficienza grave combinata Legata ad un gene recessivo mutato per cui non vengono sintetizzate correttamente le proteine necessarie alla maturazione dei globuli bianchi. Gli individui affetti da SCID, nelle prime settimane di vita non presentano sintomi (si sviluppano dopo 3-6 mesi). Trapianto di midollo osseo da un donatore compatibile. Vista la mancanza di un sistema immunitario nell'ospite, non vi è il problema del rigetto. Graft-versus-host disease Difficile trovare donatori compatibili; Infusioni mensili di anticorpi; Ingegnerizzare le cellule del paziente stesso Lada-scid è stata sconfitta. Altri tipo no, forse a causa delluso di vettori virali si sono sviluppati casi di leucemia.

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28 PROGETTI FUTURI:CREAZIONE DI BIOREATTORI Le cellule che esprimono le proteine terapeutiche vengono fatte crescere in coltura in un dispositivo impiantabile nel corpo del paziente. Questo permette alle sostanze nutritive di entrare per garantire la crescita cellulare ed alla proteina ricombinante di diffondersi in circolo, mentre le cellule impiantate sono difese dal sistema immunitario degli ospiti.

29 GLOSSARIO Episoma: un elemento genetico che può integrarsi in un cromosoma mediante un processo di ricombinazione. Liposoma: particolare conformazione che una particella contenente grasso e fosforo assume in una soluzione acquosa. Cationico: caricato positivamente KB: unità di misura utilizzata in genetica corrispondente a 1000 nucleotidi


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