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Igiene degli alimenti, un caso di studio: I MITILI Francesco Paolo Serpe.

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Presentazione sul tema: "Igiene degli alimenti, un caso di studio: I MITILI Francesco Paolo Serpe."— Transcript della presentazione:

1 Igiene degli alimenti, un caso di studio: I MITILI Francesco Paolo Serpe

2 - Contenuti - La cozza (Mytilus galloprovincialis); Mitilicoltura in Italia, in Campania e centri di referenza; Tipologie di allevamento; Gli inquinanti chimici nelle cozze; Metodi di analisi; La normativa vigente (CE 1881/2006, CE 333/2007); Gli inquinanti microbiologici nelle cozze; La normativa vigente (piano di monitoraggio regionale). Buone pratiche

3 Mytilus galloprovincialis (Lamarck, 1819) E un mollusco equivalve e lamellibranco, dotato di branchie che assorbono l'ossigeno e che trattengono i nutrienti, costituiti da plancton e particellato organico in sospensione. La valva (carbonato di calcio), è di colore nero o nero-viola, con cerchi d'accrescimento radiali e concentrici verso la parte appuntita; internamente si presenta di colore madreperla con una superficie liscia. Il mantello che contiene tutti gli organi interni (parte edibile). Arriva ad una lunghezza massima di 15 cm e vive fino a 4 anni.

4 Mytilus galloprovincialis

5 - Mitilicoltura in Italia - In Italia, la mitilicoltura è la principale attività di allevamento di specie acquatiche, per i quantitativi prodotti, la diffusione sul territorio nazionale ed il numero di insediamenti produttivi (fonte: sito web IZS Umbria e Marche). La specie allevata in Italia è il M. galloprovincialis - Specie dacqua dolce - Anodonta cygnea (Mollusca, Bivalvia, Unionidae) o cozza dacqua dolce (nessun significato tassonomico). Mistero sulla sua presenza in acque italiane. È comunque poco presente. È venduta come filtro per acquari.

6 - Mitilicoltura in Campania - Litorale Domitio Golfo di Pozzuoli Golfo di Napoli Golfo di Salerno

7 Litorale Domitio (Castelvolturno, Giugliano) Golfo di Pozzuoli (Bacoli, Pozzuoli) Golfo Napoli (Napoli, Ercolano, Torre del Greco, Torre Annunziata, Castellammare di Stabia) Golfo di Salerno (Pontecagnano, Battipaglia) ________________________ Aree di prelievo dei mitili (Mytilus galloprovincialis) Gli impianti sono suddivisi in classe A (consumo umano diretto), B e C (con obbligo di depurazione o stabulazione; D.Lgs 530/92, Regolamento CE 854/2004); Per ogni allevamento sono state prelevate 5 aliquote in 5 diversi punti ed a diversi livelli di profondità; I campionamenti sono effettuati dai Servizi Sanitari nellambito del monitoraggio Regionale degli specchi dacqua destinati alla molluschicoltura (D.G.R.C. 342/06, D.G.R.C. 2234/07 e P.R.I sez b)

8 - Tipologie di allevamento - Fondale, Pali fissi, Filari galleggianti o long line. Fondale: usata in aree lagunari (delta padano). Ci vengono portati prodotti sotto taglia raccolti in natura e lasciati crescere fino al raggiungimento della taglia commerciale 5-7 cm. Pali fissi: zone lagunari o costiere riparate. Disposizione di pali (legno, cemento o metallo) collegati tra loro da uno o più cavi a cui vengono appese delle calze in polipropilene, cui i mitili si aggrappano a formare le reste. Sono sostituiti progressivamente dai long line. Sistema long line (filari galleggianti): composto da due corpi morti di ancoraggio posti ad una distanza variabile da 100 a 200 m e tra loro collegati da uno o più cavi (cui vengono appese le reste) mantenuti in sospensione da una successione di galleggianti.

9 - Mitilicoltura in Campania - Impianti di allevamento di cozze su filari long-line (Foto scattata dal litorale di T.Annunziata. Sullo sfondo Vico Equense)

10 - Fattori di rischio per la salubrità delle cozze - Problemi connessi alla coltivazione in prossimità della superficie (2-5 m di profondità): Problemi connessi agli organismi filtratori: Esempio: molecole come tensioattivi (surfattanti) ed idrocarburi che si ritrovano in prossimità del pelo dellacqua Le cozze si nutrono trattenendo i nutrienti, incluso il particellato in sospensione, che reca con se inquinanti ambientali chimici e microbiologici. Per questi motivi, esse sono degli ottimi bioindicatori per la valutazione dellinquinamento marino.

11 - Contaminanti - Chimici (tensioattivi, idrocarburi, metalli, pesticidi, biotossine, etc) Microbiologici (virus, batteri, microalghe) La salubrità degli alimenti (prodotti carnei, prodotti ittici, latte e derivati, verdure, ortaggi, frutta, etc) è minacciata costantemente da una serie di sostanze nocive che si possono ritrovare in essi. Queste sostanze possono essere distinte in tre categorie: 1) Additivi alimentari (es. conservanti, coloranti) 2) Farmaci veterinari (es. anabolizzanti utilizzati per scopi fraudolenti) 3) Inquinanti ambientali Si ritrovano principalmente nei prodotti del mare:

12 Contaminanti chimici

13 POPs (Persistent Organic Pollutants) Definiti dalla Convenzione di Stoccolma sugli Inquinanti Organici Persistenti (maggio 2001, entrata in vigore nel 2004) Sono sostanze organiche ubiquitarie generalmente clorurate aventi particolari caratteristiche chimico-fisiche tali che, una volta rilasciate nellambiente, esse restano intatte per periodi di tempo eccezionalmente lunghi. Sono poco volatili, idrofobiche (liposolubli, motivo per cui sono resistenti alla degradazione e si bioaccumulano nei tessuti adiposi) e tossiche. Nel maggio 2009 la Convenzione ha introdotto altri 9 POPs. Aldrin Chlordane DDT Dieldrin Endrin Heptachlor Hexachlorobenzene Mirex Toxaphene Polychlorinated biphenyls (PCB) Polychlorinated dibenzo-p-dioxins (PCDD) Polychlorinated dibenzofurans (PCDF)

14 I POLICLORO BIFENILI

15 DL-PCB NDL-PCB PCB indicatori

16 POPs diossina-simili: i PCB I PCB diossina-simili (dioxin-like PCBs; dl-PCBs) sono 12 dei 209 possibili congeneri di PCB che mostrano effetti tossici simili a quelli causati dalle diossine. La principale differenza strutturale fra i PCB e le diossine è la libertà rotazionale attorno al legame C-C 1-1. La rotazione permette ai due anelli fenilici del PCB di giacere nello stesso piano (di assumere cioè una conformazione planare) come per le diossine oppure di giacere su due piani differenti. Nel bifenile non sostituito da atomi di cloro, la rotazione è libera e la molecola può assumere qualsiasi conformazione, inclusa quella planare. Ma cosa accade se sono presenti dei sostituenti?

17 PCB non orto: può essere planare PCB orto: non può essere planare POPs diossina-simili:i PCB Andando a considerare i raggi atomici di Van der Waals si nota che, nei PCB orto, la rotazione C-C è completamente impedita.

18 I PCB indicatori La ricerca dei PCB di maggiore interesse tossicologico (come i DL-PCB) parte molto spesso dalla ricerca dei PCB che maggiormente si ritrovano nellambiente e negli alimenti, i PCB indicatori (non necessariamente tossici, in genere confusi con i NDL-PCB). Dedalo normativo: PNR 2000: sette PCB indicatori (sei NDL ed uno DL) PNR 2004: diciotto PCB (comprendendo due DL-PCB) Proposta Comunitaria 2009 (DG SANCO 2009,); Monitoraggio EFSA 2010 (cfr.più avanti): sei NDL-PCB (28, 52, 101, 138, 153 e 180; ovvero i sette del 2000 meno il DL-PCB)

19 - PCB: fonti e tossicità - Lesposizione prolungata a queste sostanze può avere conseguenze rilevanti sulla salute a causa del processo di bioaccumulo. I PCB sono prodotti intenzionalmente (come tutti i POPs ad eccezione dei PCDD/F). I PCB sono stati prodotti per molti anni (tra 1930 e 1980 circa) per la bassa infiammabilità e le proprietà elettriche. Usati per scopi industriali, ad esempio come ritardanti di fiamma nei circuiti stampati, applicazioni ferroviarie, fotocopiatrici, come fluidi dielettrici, etc.. Oggi ne è vietata la produzione in molti paesi. In altri paesi invece sono ancora prodotti (Russia) nonostante siano stati inclusi fra i POPs. Oggi esistono dei piani di corretto smaltimento dei PCB.

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21 GLI IDROCARBURI POLICLICI AROMATICI

22 Strutturalmente il naftalene si può considerare derivante dalla fusione di due molecola di benzene; α e β indicano le diverse posizioni sulla molecola Un IPA è planare, formato da una sequenza di atomi di C ibridati sp 2, ciascuno con un orbitale P z semioccupato Possiede un totale di 10 elettroni p, rispettando la regola di Hückel che definisce i composti aromatici in base al numero di elettroni del sistema coniugato (4n+2) IPA: idrocarburi aromatici costituiti da due o più anelli benzenici fusi in ununica struttura piana, attraverso coppie di atomi di carbonio condivisi fra anelli adiacenti.

23 IPA Alaumentare del numero di anelli benzenici aumenta il numero dei possibili composti: n. anelli benzenici n. di idrocarburi possibili oOvviamente non tutti i congeneri sono presenti nellambiente in quantità rilevanti, o comunque tali da poter essere considerati degli inquinanti. oLe regole generali per la nomenclatura dei composti superiori sono definite univocamente dalla IUPAC (http://www.acdlabs.com/iupac/nomenclature/)

24 IPA : Idrocarburi Policiclici Aromatici Wenzl T., Simon R., Kleiner J. and Anklam E. (2006). Analytical methods for polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in food and the environment needed for new food legislation in the European Union. Trends in analytical chemistry, 25(7),

25 Tra gli 11 evidenziati, ci sono 3 probabili cancerogeni (IARC, gruppo 2A, futuro 1A): Benzo[a]pirene Dibenzo[a,h]antracene Benzo[a]antracene …e 5 possibili cancerogeni (IARC, gruppo 2B): 5-metilcrisene Benzo[b]fluorantene Benzo[k]fluorantene Dibenzo[a,i]pirene Indeno[1,2,3-cd]pirene IPA : Idrocarburi Policiclici Aromatici Tossicità: sono riconosciuti dal recettore AHR (cfr. diossine) e penetrano allinterno delle cellule: (…) benzo[a]pyrene was demonstrate to lead enzymes CYP1A1 (cytochrome P450, family 1, subfamily A, polypeptide 1, involved in metabolism of xenobiotics) and CYP1B1 (subfamily B) with formation of carcinogen-DNA adducts (Perera, Tang, Whyatt, Lederman and Jedrychowski, 2005; Keshava et al., 2005). Gli altri IPA sono considerati sinergisti

26 Alcuni parametri chimico-fisici Solubilità in acqua (mmol/L) Tensione di vapore (Pa, 25°C) Naftalene 2.4x Crisene 1.3x x10 -7 Benzo[a]antracene 1.3x x10 -6 Benzo[a]pirene 1.5x x10 -7 Dibenzo[a,h]antracene 1.8x x Benzo[g,h,i]perilene 2x x10 -8 Gli IPA sono solidi a temperatura ambiente ed hanno punti di ebollizione e di fusione elevati. La tensione di vapore di tali composti è generalmente bassa ed inversamente proporzionale al numero di anelli contenuti. Gli IPA sono poco solubili o del tutti insolubili in acqua. La solubilità diminuisce allaumentare del peso molecolare. Gli IPA sono altamente lipofili.

27 Gli IPA sono sottoprodotti della combustione di materia organica derivanti principalmente da fonti antropiche, ma anche naturali, inclusi tra i POPs dal 1998 (Danimarca) Le sorgenti antropiche sono principalmente rappresentate dalle attività industriali legate alla combustione di combustibili fossili, agli impianti di produzione dellenergia, allimpiego di asfalti, agli sversamenti accidentali (e non) in mare, agli effluenti domestici, alle deposizioni atmosferiche di aerosol da combustione. Le sorgenti naturali sono rappresentate dalla biosintesi effettuata dalle piante e dai batteri, dagli incendi dei boschi e dalle emissioni gassose durante le eruzioni vulcaniche.

28 Metalli tossici/non essenziali

29 Proprietà chimiche

30 Pb: Il piombo è un metallo bianco-azzurro molto tenero, denso, duttile e malleabile; possiede anche una relativamente bassa conducibilità elettrica. Può essere reso più duro per aggiunta di una piccola quantità di antimonio. È molto resistente alla corrosione; non viene intaccato dall'acido solforico, si scioglie però in acido nitrico.conducibilità elettrica antimonioacido solforicoacido nitrico Cd: Il cadmio è un metallo bivalente dall'aspetto argenteo con riflessi azzurrognoli; è malleabile, duttile e tenero al punto che può essere tagliato con un normale coltello. Sotto molti aspetti assomiglia allo zinco ma tende a formare composti più complessi di quest'ultimo. Nei suoi composti ha numero di ossidazione +2. Sono noti alcuni rari casi in cui ha numero di ossidazione +1.zinco numero di ossidazione Hg: Il mercurio e' l'unico metallo comune che e' liquido a temperature ordinaria. Esso e' qualche volta chiamato argento rapido. È un metallo liquido pesante e bianco-argenteo. È un conduttore di calore piuttosto povero se confrontato con altri metalli ma è un buon conduttore di elettricità. Si unisce facilmente in leghe con molti metalli, come oro, argento e stagno. Queste leghe sono denominate amalgami. Proprietà chimiche Pb, Cd, Hg

31 Pb : Non antropogeniche: Si presume che tutto il piombo esistente sia derivato dal decadimento dell'uranio(U) 238 che si trasforma in piombo (Pb) con un tempo di dimezzamento di circa anni.uranio Antropogeniche: Piombo tetraetile, conosciuto anche con la sigla TEL, è un composto tossico di formula (CH3CH2)4Pb, utilizzato in passato in petrolchimica come additivo nella benzina per aumentarne la resistenza all'auto-accensione (numero di ottano). Hg : Non antropogeniche: eruzioni vulcaniche, emissioni geotermiche. Antropogeniche: processi industriali quali produzione di cemento e plastiche, industria del ferro, combustione di carburante e di immondizia Cd : Antropogeniche: Circa tre quarti della quantità di cadmio prodotta vengono usati nelle pile al nichel-cadmio, mentre il quarto rimanente è principalmente usato per produrre pigmenti, rivestimenti e stabilizzanti per materie plastiche.pilepigmenti materie plastiche NB: i metalli sono considerati inquinanti quando suparano i livelli in cui essi sono normalmente presenti nellambiente Fonti

32 Il cromo è un metallo duro, lucido, color grigio acciaio; può essere facilmente lucidato, fonde con difficoltà ed è molto resistente alla corrosione. Gli stati di ossidazione più comuni del cromo sono +2, +3 e +6, di cui +3 è il più stabile; stati +4 e +5 sono relativamente rari. I composti del cromo +6 (cromo esavalente) sono potenti ossidanti.stati di ossidazionecromo esavalente Provenienza: Proprietà chimiche e fonti del Cr oIn metallurgia, per conferire resistenza alla corrosione ed una finitura lucida.metallurgia oUsato in smalti e vernici.smaltivernici oCome catalizzatore.catalizzatore oLa Cromite si usa per fare impasti per la cottura dei mattoni.Cromitemattoni oSali di cromo si usano nella conciatura del cuoio.conciaturacuoio

33 Ciclo biogeochimico dei metalli pesanti

34 Il CrIII ha la funzione biologica di potenziare lazione dellinsulina attraverso la sua attività tirosina chinasica Il CrVI dal 1998 è stato dichiarato dallUSEPA cancerogeno per via inalatoria (Gruppo A) Pb, Cd e Hg sono metalli senza alcuna funzione biologica e tossici. Il più tossico di essi è considerato il mercurio, in particolare nelle sue forme organiche di metilmercurio e dimetilmercurio. La pericolosità del mercurio in particolare è associata alla sua capacità di bioaccumulare (Gray, 2002) Tossicità

35 Piombo anemia sintomi nervosi nefropatie disturbi gastrointestinali Mercurio Lesioni degenerativo-necrotiche dei neuroni (atassia, debolezza muscolare, perdita della vista e delludito) Cadmio osteomalacia/osteoporosi nefropatie epatopatie cancro (via inalatoria, IARC 1993) Effetti sulla salute

36 Si scoprì che, in una industria che scaricava i reflui nella baia, veniva usato mercurio come catalizzatore nella produzione di acetaldeide, utilizzata a sua volta per la produzione della plastica. Gli alti livelli di contaminazione delle acque e dei prodotti ittici della baia di Minamata (Giappone, 1956) causarono gravi danni neurologici ed uccisero più di 900 persone. Circa 2 milioni di persone furono interessate da problemi di salute o subirono danni permanenti a causa del mercurio. I sintomi includono perdita di sensibilità alle quattro estremità, perdita di coordinazione (atassia), intorpidimento, cecità, problemi alludito ed allolfatto. Avvelenamento da mercurio: Il caso di Minamata

37 Tecniche analitiche

38 - Cromatografia liquida - Separazione dei componenti di una miscela multicomponente in base allaffinità di questi con una fase solida (fase stazionaria o colonna), con cui vengono a contatto mediante la fase mobile liquida (eluente). Campione: miscela di analiti Fase mobile (eluente) Fase stazionaria o colonna Nelle prime applicazioni della cromatografia liquida la fase solida era polare e poteva essere costituita da silice. La fase liquida era apolare (un solvente organico). Leluente scorreva in colonna per gravità. Questo schema prende oggi il nome di cromatografia a fase diretta. In seguito è stata sviluppata la cromatografia a fase inversa (fase solida apolare ed eluente polare).

39 Ponendo alluscita della colonna un rivelatore che misuri la concentrazione del soluto nelleluato (cioè la fase mobile che esce dalla colonna) e riportando il segnale in funzione del tempo si può ottenere un cromatogramma. Larea sottesa dai picchi è proporzionale alla quantità di ogni singolo componente e può essere utilizzata a scopo quantitativo. Rivelazione - Cromatografia liquida -

40 Tempo di ritenzione (di una sostanza) : tempo impiegato dall'eluente (ovvero la fase mobile) per trascinarla via dalla fase fissa. t r = t'(r)/t(0) t'(r) ed il tempo morto t(0) sono direttamente ricavabili dal cromatogramma. Fattore di capacità : parametro che mette in relazione il tempo di ritenzione di un analita col tempo morto. Selettività : distanza tra i picchi del cromatogramma. È possibile migliorare la selettività diminuendo la temperatura di lavoro (aumento dei tempi di ritenzione). La selettività è definita come il rapporto dei fattori di capacità di due diverse sostanze sullo stesso cromatogramma, quindi: α = t'(r2)/t'(r1) Quanto più la selettività è maggiore di 1, tanto migliore sarà la separazione cromatografica. Efficienza: anche se i picchi sono ben distanziati, è possibile che siano talmente larghi che si sovrappongano fra loro. La più comune teoria per lo studio dellefficienza cromatografica è la teoria dei piatti teorici. - Glossario -

41 Equazione di Van Deemter: H = A + B/u + Cu u = flusso fase mobile A = diffusione vorticosa (diversi percorsi possibili) B = diffusione longitudinale (moti termici) C = trasferimento di massa (cinetica ads/des) HETP = lunghezza colonna /N Piatto teorico: elemento della colonna in cui si realizza lequilibrio di distribuzione del soluto tra fase stazionaria e fase mobile: - Glossario - N = numero di piatti teorici HETP = altezza equivalente al piatto teorico

42 La stessa separazione si può effettuare in modo più efficiente con una colonna HPLC: ridotta dimensione delle particelle quindi maggiore superficie di scambio ma grandi pressioni di esercizio (centinaia di atm). Cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) Valvola di iniezione. Il campione non è più versato ma iniettato Pompa HPLC Colonna HPLC (a fase inversa)

43 - Analisi Chimica IPA - Metodo Estrazione dalla matrice (cozza) e clean-up. Parametri HPLC: gradiente H 2 O/acetonitrile 60%-100%. Colonna C x 50 mm, 1.8 μm (dimensione particelle limite tra HPLC e UPLC). Pompa HPLC classica. Detector: fluorimetro. Standardizzazione esterna. Il metodo deve essere validato ai sensi del Regolamento CE 333/2007 e, possibilmente, della Decisione CE 657/2002.

44 - Analisi Chimica IPA - 1) benzo[a]antracene 2) crisene 3) 5-metilcrisene 4) benzo[b]fluorantene 5) benzo[k]fluorantene 6) benzo[a]pirene 7) dibenzo[a,l]pirene 8) dibenzo[a,h]antracene 9) indeno[1,2,3-cd]pirene 10) dibenzo[a,i]pirene 11) dibenzo[a,h]pirene Campione di mitili IPA-free fortificato a 10 μg/kg minλeccλem , , , end Si sfruttano 3 cambi di lunghezza donda per utilizzare sempre la coppia λecc-λem ottimale per ogni IPA. Timetable detector.

45 L= 30 m Gas-cromatografia

46 Iniezione manuale Autocampionatore Iniezione del campione

47 Iniettore SSL

48 Rivelatore di massa Sample Flow

49 Quadrupolo

50 Gas-massa

51 Rivelatore a cattura di elettroni Sample Flow in genere integrato nel forno

52 Non esistono livelli massimi di legge per i ndl-PCB negli alimenti Metodo: estrazione dalla matrice, mineralizzazione e clean-up. Determinazione: analisi gas-cromatografica con rivelazione a cattura di elettroni (GC-ECD) e standardizzazione esterna. PCB ricercati: 28, 52, 95, 101, 99, 110, 151, 149, 118, 146, 153, 105, 138, 187, 183, 177, 180, 170. PCB : Poli Cloro Bifenili Tali analisi (IPA, PCB) prendono il nome di determinazioni multiresiduali

53 Assorbimento atomico

54 Assorbimento atomico – GF/AAS

55 Assorbimento atomico – CV/AAS Agente riducente (come SnCl 2 ). Il prodotto non è latomo ma idruri volatili che vanno decomposti con il calore della cella

56 Metalli pesanti ricercati: Piombo (tossico) (DGRC 2234/07) Cadmio (tossico) Mercurio (tossico) (DGRC 2234/07) Cromo totale (VI tossico + III potenzialmente tossico) Trattamento della matrice: È unico per tutti i metalli. La mineralizzazione del campione è effettuata in forno a microonde in presenza di HNO 3 e H 2 O 2. Determinazione: Analisi spettrofotometrica di assorbimento atomico con standardizzazione esterna. Atomizzazione: tecnica del fornetto di grafite (Pb, Cd e Cr) e della generazione di idruri (Hg). Analisi Chimica: Metalli Limiti massimi consentiti per i molluschi (Regolamento CE 1881/2006): Pb 1.5 mg/kg Cd 1.0 mg/kg Hg 0.5 mg/kg Cr assenza riferimento normativo per cromo totale. Metodi validati secondo i criteri previsti dal Regolamento CE 333/2007.

57 Normativa

58 Regolamento 333/2007 (non ha bisogno di recepimento)

59 Regolamento 333/2007

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62 Regolamento 1881/2006 (non ha bisogno di recepimento)

63 Regolamento 1881/2006

64 Proposta introduzione normativa NDL-PCB (DG SANCO 2009) È proposta lintroduzione del LM negli alimenti (es ng/g nei prodotti ittici) per la somma di 6 NDL-PCB indicatori, ovvero 28, 52, 101, 138, 153, 180. Si basa sulla recente pubblicazione di studi che ne documentano gli effetti carcinogenici ed in generale ne caratterizzano gli aspetti tossicologici.

65 Regolamento 1881/2006

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68 Altri contaminanti ambientali..

69 Biotossine algali (DGRC 2234/ /06) TOSSINE PSP Nome della malattia: Paralytic Shellfish Poisoning. Chimica delle tossine: Saxitossina e suoi derivati. Agenti responsabili: microalghe appartenenti a Dinoflagellate, Cianoficee e Batteri. Metodo di determinazione: biotossicologico (mouse test). Modalità di trasmissione: ingestione di molluschi filtratori, gasteropodi, cefalopodi, crostacei e pesci planctofagi. Natura della malattia: predominanti sintomi di tipo neurologico (formicolio, parestesia alla bocca, alle labbra, alla lingua ed allestremità degli arti, profonda astenia muscolare, impossibilità a mantenere la stazione eretta, andatura atassica, perdita dellequilibrio), rari o assenti sintomi di tipo gastrointestinale (nausea, vomito, diarrea, dolori addominali). TOSSINE PSP Nome della malattia: Paralytic Shellfish Poisoning. Chimica delle tossine: Saxitossina e suoi derivati. Agenti responsabili: microalghe appartenenti a Dinoflagellate, Cianoficee e Batteri. Metodo di determinazione: biotossicologico (mouse test). Modalità di trasmissione: ingestione di molluschi filtratori, gasteropodi, cefalopodi, crostacei e pesci planctofagi. Natura della malattia: predominanti sintomi di tipo neurologico (formicolio, parestesia alla bocca, alle labbra, alla lingua ed allestremità degli arti, profonda astenia muscolare, impossibilità a mantenere la stazione eretta, andatura atassica, perdita dellequilibrio), rari o assenti sintomi di tipo gastrointestinale (nausea, vomito, diarrea, dolori addominali).

70 TOSSINE ASP Nome della malattia: Amnesic Shellfish Poisoning. Chimica delle tossine: Acido domoico (aminoacido relativamente raro non presente nelle proteine). Agenti responsabili: microalghe appartenenti a Diatomee e alcune macroalghe. Metodo di determinazione: chimico (HPLC). Modalità di trasmissione: ingestione di molluschi filtratori nel caso di microalghe, ingestione di pesci nel caso di macroalghe. Natura della malattia: sintomi di tipo gastrointestinale (nausea, vomito, diarrea, dolori addominali) e di tipo neurologico (confusione, perdita della memoria, disorientamento e nei casi più gravi coma e morte). TOSSINE ASP Nome della malattia: Amnesic Shellfish Poisoning. Chimica delle tossine: Acido domoico (aminoacido relativamente raro non presente nelle proteine). Agenti responsabili: microalghe appartenenti a Diatomee e alcune macroalghe. Metodo di determinazione: chimico (HPLC). Modalità di trasmissione: ingestione di molluschi filtratori nel caso di microalghe, ingestione di pesci nel caso di macroalghe. Natura della malattia: sintomi di tipo gastrointestinale (nausea, vomito, diarrea, dolori addominali) e di tipo neurologico (confusione, perdita della memoria, disorientamento e nei casi più gravi coma e morte).

71 TOSSINE DSP Nome della malattia: Diarrhetic Shellfish Poisoning. Chimica delle tossine: Acido okadaico e suoi derivati, Pectenotossine, Yessotossine. Agenti responsabili: microalghe appartenenti a Dinoflagellate. Metodo di determinazione: biotossicologico (mouse test). Modalità di trasmissione: ingestione di molluschi filtratori. Natura della malattia: sintomi di tipo gastrointestinale (nausea, vomito, diarrea, dolori addominali, sensazione di freddo, cefalea, febbre). ___________________ TOSSINE DSP Nome della malattia: Diarrhetic Shellfish Poisoning. Chimica delle tossine: Acido okadaico e suoi derivati, Pectenotossine, Yessotossine. Agenti responsabili: microalghe appartenenti a Dinoflagellate. Metodo di determinazione: biotossicologico (mouse test). Modalità di trasmissione: ingestione di molluschi filtratori. Natura della malattia: sintomi di tipo gastrointestinale (nausea, vomito, diarrea, dolori addominali, sensazione di freddo, cefalea, febbre). ___________________ PSP, ASP e DSP si ritrovano nel Mar Mediterraneo e vengono bioaccumulate da ricci e mitili

72 SEGNI DI SOFFERENZA IN ORGANISMI MARINI Ricci e stelle di mare perdono, del tutto o solo in parte, aculei e braccia. SEGNI DI SOFFERENZA IN ORGANISMI MARINI Ricci e stelle di mare perdono, del tutto o solo in parte, aculei e braccia. Alghe potenzialmente tossiche e biotossine algali ASPETTO MACROSCOPICO IN ACQUA Pellicola bruna dallaspetto membranoso avvolgente gli scogli e tutto ciò che si trova sul fondo Fiocchi di materiale sospeso che in controluce presentano puntini rossastri ASPETTO MACROSCOPICO IN ACQUA Pellicola bruna dallaspetto membranoso avvolgente gli scogli e tutto ciò che si trova sul fondo Fiocchi di materiale sospeso che in controluce presentano puntini rossastri

73 Alghe potenzialmente tossiche e biotossine algali CAUSE NATURALI Leutrofizzazione naturale è un processo a lungo termine che rientra in una scala di tempo di anni. La loro diffusione è dovuta alleutrofizzazione (aumento del livello trofico) e alla tropicalizzazione (es. presenza di nuove specie) dellambiente marino dovute ad un apporto di sostanze nutrienti anomalo ed a cambiamenti climatici (aumento della temperatura e riduzione della salinità del mare). CAUSE ANTROPOGENICHE Leutrofizzazione antropogenica, che avviene più frequentemente nelle aree costiere per apporto di nutrienti ad opera delluomo, si manifesta in tempi brevi, in una scala temporale di circa 10 anni. La tropicalizzazione è dovuta cambiamenti climatici.

74 RICERCA DI NOROVIRUS: Estrazione e concentrazione del virus dai mitili (Jothikumar et al., 2005) Estrazione dellRNA: Kit QIAamp UltraSens Virus Kit (Qiagen) RT-BOOSTER PCR: (Boxman et al 2006) kit commerciale HOT START MASTER MIX (Qiagen) TAQ HOT START (Qiagen) PRIMERS: JV12Y E JV13I Controllo microbiologico: norovirus

75 RICERCA DI ROTAVIRUS: Estrazione e concentrazione del virus dai mitili (Jothikumar et al., 2005) Estrazione dellRNA: Kit QIAamp UltraSens Virus Kit (Qiagen) Retrotrascrizione: 5 µl di RNA totale (RNA bicatenario dei Rotavirus denaturato in DMSO 95°C 5 min) RT-Vilo (25°C 10min 42°C 1h 85°C 5 min) RT - PCR: (Logan et al 2006) kit commerciale HOT START MASTER MIX (Qiagen) TAQ HOT START (Qiagen) RICERCA DEL VIRUS DELLEPATITE A: Estrazione e concentrazione del virus dai mitili (Jothikumar et al., 2005) Estrazione dellRNA: Kit QIAamp UltraSens Virus Kit (Qiagen) RT-PCR: kit commerciale HOT START MASTER MIX (Qiagen) TAQ HOT START (Qiagen) PRIMERS: 1° PCR AV1 e AV2 SEMINESTED-PCR AV2 e AV3 Controllo microbiologico: epatite A e rotavirus

76 Controllo ufficiale effettuato dalle AASSLL competenti nellambito della classificazione degli specchi dacqua destinati alla produzione e stabulazione dei molluschi bivalvi (DGRC 2234/07 (342/06)) – BURC n. 3 del 21 gennaio 2008) Nelle AREE MARINE da CLASSIFICARE: campioni analizzati SOLO per il parametro E. COLI Prelievo QUINDICINALE per almeno 6 MESI Nelle AREE MARINE CLASSIFICATE MONITORAGGIO campioni analizzati per SALMONELLA spp. Prelievo con frequenza almeno MENSILE. NON SONO PREVISTE DAL DECRETO INDAGINI VIROLOGICHE Controllo microbiologico (ufficiale)

77 Riassumendo Chimici Idrocarburi: IPA, PCB Metalli pesanti: Pb, Cd, Cr, Hg Biotossine algali: DSP Microbiologici Virus: Norovirus, Rotavirus, Epatite A virus Batteri: E.coli, Salmonella spp

78 Sommario I PCB, gli IPA ed i metalli tossici sono xenobiotici pericolosi ed ubiquitari che minacciano costantemente la salubrità dei mitilli; La normativa è in continuo divenire, sia a livello comunitario che nazionale (omissis), con conseguenze importanti nel campo dellacquacoltura; Luomo viene a contatto con alcuni di essi per inalazione, ma tutti giungono alluomo attraverso lassunzione di alcuni allimenti a rischio come i mitili, motivo per cui il controllo alimentare è uno strumento essenziale per la tutela della salute pubblica.

79 Buone pratiche: gli strumenti di difesa del consumatore A)Non acquistare cozze sfuse ma confezionate ed etichettate. Solo le cozze confezionate subiscono i processi di controllo e classificazione descritti, la eventuale stabulazione (riduzione della concentrazione di tutti gli inquinanti presenti, sia chimici che microbiologici) e la corretta conservazione. Ciò rappresenta lunica garanzia di sicurezza allimentare per il consumatore. B)La cottura dellalimento è fondamentale per limitare il rischio microbiologico. La cottura in pentola a pressione (T H2O > 120°C) permette di scongiurarlo, anche se a discapito delle caratteristiche organolettiche...

80 Conclusioni Oltre che conoscere le pratiche analitiche di ricerca dei contaminanti alimentari, laddetto ai lavori ha anche il dovere di: 1)Mettere in pratica egli stesso, 2)Divulgare, le buone pratiche alimentari, in modo da contribuire ad attuare la cosiddetta Medicina preventiva che è il fine ultimo del controllo e delligiene alimentare. Grazie dellattenzione!!!


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