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Rapporto microorganismi e organismi pluricellulari.

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Presentazione sul tema: "Rapporto microorganismi e organismi pluricellulari."— Transcript della presentazione:

1 Rapporto microorganismi e organismi pluricellulari

2 S teps in successful infection

3 S ex comes before disease –acquire virulence genes S ense environment –and S witch virulence genes on and off S wim to site of infection S tick to site of infection S cavenge nutrients –especially iron S urvive stress S tealth –avoid immune system S trike-back –damage host tissues S ubvert –host cell cytoskeletal and signalling pathways S pread –through cells and organs S catter

4 Azione patogena dei batteri COLONIZZAZIONE e MOLTIPLICAZIONE nellOSPITE –Adesione –Moltiplicazione batterica –Colonizzazione –Invasione tessuti –Escapedifese DANNO OSPITE –Produzione di tossine –Produzione di mediatori flogosi - Reazioni autoimmunitarie

5 Bacterial Sex per acquisire geni di virulenza Batteri hanno 3 strategie per scambiare DNA –Trasformazione cells take up naked DNA –Trasduzione phages carry DNA –Coniugazione cells mate through specialised appendages

6 Bacterial Sex elementi genetici mobili Trasposoni –ST enterotoxin genes Plasmidi di Virulenza –e.g. TTSSs in Shigella, Yersinia; toxins in Salmonella, E. coli, anthrax Fattori di virulenza codificati da fagi –e.g. botulinum toxins, diphtheria toxin, shiga- like toxin (linked to lysis), staphylococcal toxins, TTSS substrates in Salmonella.

7 Bacterial Sex isole di patogenicità Concetto originato da studi su ceppi di E. coli uropatogenici Elementi caratterizzanti –Presenza di (molti) geni di virulenza –Presenza in ceppi patogeni ma non in ceppi apatogeni –Differente contenuto in G+C ripsetto al cromosoma dellospite –Occupano larghe regioni del cromosoma ( Kb) –Compatta unità genetica, spesso fiancheggiata da DRs, tRNAs, ISs –Presenza di geni coinvolti nella mobilità –Instabile, proni alla delezione –Spesso codificano sistemi di secrezione ( regione LEE in EPEC, Spi1, Spi2 in Salmonella, Cag in H. pylori) - Spesso codificano adesine, siderofori, tossine (Enteropathogenic E. coli (Pai I, II, IV, V), Yersinia spp. (HPI), V. cholerae (VPI or TCP-ACF element)

8 Sense environment Batteri possono avvertire cambiamenti nellmbiente –e.g. temperatura, disponibilità di nutrienti, osmolarità, densità cellulare (quorum sensing). Nei casi più semplici, cambiamenti nella concentrazione intracellulare di ioni sono direttamente legati allespressione genica –e.g. fall in intra-cellular iron levels triggers de-repression of diphtheria toxin gene Nei casi più complessi, sofisticate cascate di trasduzione del segnale consentono al batterio di regolare lespressione di geni in risposta a cambiamenti ambientali –the pathogen as an information processor

9 S witch virulence factors on and off A multi-layered hierarchy Modificazioni nella sequenza del DNA –Amplificazione genica –Riarrangiamento genico e.g. Hin flip-flop control of flagellar phase variation Regolazione Transcrizionale –Attivatori e Repressori (helix-turn-helix motif) –mRNA ripiegamento e stabilità Regolazione Translazionale Regolazione Post- translazionale –Stabilità delle proteine, proteolisi controllata –Modificazioni covalenti e.g. fosforilazioni in sistemi a due-componenti sensore- regolatore

10 S wim Molti batteri patogeni sono mobili –Enterics, Campylobacter, Helicobacter, spirochaetes Mobilità è cruciale per la virulenza in alcuni casi Tipico organello di motilità = flagello Varianti –Twitching motility –Swarming

11 Disseminazione Enzimi batterici degradano differenti matrici tessutali. Sono considerati INVASINE Ialuronidasi (streptococchi, staphylococchi, clostridi). Collagenasi (Clostridium histolyticum and Clostridium perfringens). Neuraminidasi (Vibrio cholerae, Shigella dysenteriae). Streptochinasi and Stafilochinasi (streptococchi and stafilococchi)

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13 S tick Conferisce al microrganismo capacità di resistere alla rimozione meccanica operata sulle mucose e tropismo tissutale Comuni meccanismi di aderenza –Capsula e slime –Biofilm Adesine Gram-positivi –MSCRAMMs (microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules), e.g. protein A –Fimbrie Adesine Gram-negativi (CHO and protein receptors) –Fimbrie, Afimbrial adhesins (FHA, Pertactin etc.) –Outer Membrane Proteins –Types III-IV secretion

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15 Colonizzazione La colonizzazione è la fase successiva alladesione e comporta la moltiplicazione batterica Espressione genica programmata: quorum-sensing Per moltiplicarsi, un batterio deve: –trovare un ambiente nutrizionale favorevole (temperatura, pH, scambi gassosi, osmolarità, nutrienti essenziali, tra cui ferro) –superare le difese dellospite

16 Biofilm Protezione in ambienti ostili (matrice eso-polisaccaridica) Organizzazione simil-tissutale: –canali di nutrizione interni –pattern di espressione genica diversi Alternanza di stati di vita comunitaria e vita planctonica Ruolo fondamentale dei flagelli e pili nelle prime fasi di adesione (monolayer e microcolonie) structured community of bacterial cells enclosed in a self-produced polymer matrix and adherent to an inert or living surface (Costerton et al., Science, 1999)

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18 Biofilm sulla superficie di un catetere Biofilm sulla mucosa ileale

19 Adesione batterica nel cavo orale e formazione della placca

20 Biofilm e infezioni Resistenti allazione di anticorpi e fagociti. Naturalmente resistenti ad antimicrobici Causa frequente di infezioni croniche e persistenti, soprattutto da parte di patogeni opportunisti: –P. aeruginosa e polmoniti in pazienti con CF –GAS e fascite necrotizzante –Streptococchi viridanti ed endocarditi –Streptococchi orali e carie –Batteri anaerobi orali e periodontopatie –Infezioni nocosomiali da S. epidermidis, S. aureus, Actinomyces, Streptococcus

21 Scavenge nutrients e.g. iron Livelli di Fe libero nei fluidi corporei è molto basso –Reazioni inf. acute causano una ulteriore riduzione –Sovraccarico di Fe aumenta suscettibilità alle infezioni I batteri possiedono vari meccanismi per ottenere Fe –Siderofori chelano Fe disponibile e lo trasportano interno batteri –Fe può essere ottenuto direttamente da proteine ospite in grado di legarlo e.g proteine leganti la lattoferrina –Alcuni patogeni evitano il problema riducendo la necessità di Fe, e.g. Treponema pallidum Fe è utilizzato per regolare lespressione di fattori di virulenza –Tossina difterica (DtxR repressore) –Shiga-like tossina –Pseudomonas aeruginosa esotossina A

22 Survive Stress Oltre allo stress derivante dalla mancanza di nutrienti, I patogeni devono affrontare molti altri stress –Acidità nello stomaco –Shock termico con la febbre –Stress ossidativo nei fagociti Proteine prodotte in risposta a Stress, come le chaperonine, appaiono degli antigeni immunodominanti Proteine con attività detossificante giocano un ruolo nella virulenza, e.g. Cu,Zn-superossido dismutasi nello spazio periplasmico Dose infettiva per patogeni enterici in pz con acloridria

23 Stealth evitare (escape) il sistema immune IgA proteasi –metalloproteasi attive contro IgA Proteine leganti le Immunoglobuline –e.g. proteina A dello S. aureus Resistere allazione del complemento, opsonizzazione –Capsula (generalmente polisaccaridica) –Lipopolisaccaride –Proteine di superficie Mimicrismo antigenico –e.g. capsula di acido sialico per il meningococco di gruppo B –Legame proteine ospite

24 Variazione di fase o antigenica –Coinvolge strutture di superficie come proteine, LPS, capsula –Varietà di meccanismi slip-strand mispairing flip-flop cassette Crescere in –fagociti –in biofilm GAAGTGCATTTAACTT**GGGGGGGGGGGTAAT GAAGTGCATTTAACTT*GGGGGGGGGGGGTAAT GAAGTGCATTTAACTTGGGGGGGGGGGGGTAAT GAAGTGCATTTAACTT***GGGGGGGGGGTAAT GAAGTGCATTTAACTT**GGGGGGGGGGGTAAT GAAGTGCATTTAACTT****GGGGGGGGGTAAT GAAGTGCATTTAACTT*GGGGGGGGGGGGTAAT GAAGTGCATTTAACTT**GGGGGGGGGGGTAAT GAAGTGCATTTAACTT***GGGGGGGGGGTAAT GAAGTGCATTTAACTT**GGGGGGGGGGGTAAT GAAGTGCATTTAACTT*GGGGGGGGGGGGTAAT Homopolymeric tract in Campylobacter jejuni

25 Strategie usate dai batteri intracellulari Blocco maturazione fagosoma (Legionella, Mycobacterium, Salmonella, Chlamydia) Adattamento e replicazione in compartimenti lisosomiali (Coxiella) Escape nel citosol (Listeria, Shigella)

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27 Patogeni extracellulari ed intracellulari

28 Shigella Salmonella

29 Azione patogena dei batteri COLONIZZAZIONE dellOSPITE –Adesione –Moltiplicazione batterica –Colonizzazione –Invasione –Escape/sovversione delle Difese Immunitarie DANNO DIRETTO allOSPITE –Produzione di tossine –Produzione di molecole infiammatorie –Reazioni autoimmunitarie

30 Opsonizzazione

31 Inibizione della fagocitosi

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33 Inibizione dellazione del complemento

34 Azione patogena dei batteri COLONIZZAZIONE e MOLTIPLICAZIONE nellOSPITE –Adesione –Moltiplicazione batterica –Colonizzazione –Invasione –Escape/sovversione delle Difese Immunitarie DANNO TESSUTI OSPITE –Produzione di tossine –Produzione di molecole che inducono una risposta infiammatoria –Reazioni autoimmunitarie

35 MECCANISMI di PATOGENICITA BATTERICA Bacteria-induced toxicityHost-mediated damage

36 MECCANISMI di PATOGENICITA BATTERICA

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38 Meccanismi di patogenicità indiretti attraverso i meccanismi immuni adattativi

39 Immunità specifica ed immunopatologia Infezioni acuteInfezioni acute Infezioni cronicheInfezioni croniche tuberculosituberculosi lebbralebbra sifilidesifilide Persistenza di detriti batterici nei tessutiPersistenza di detriti batterici nei tessuti AutoimmunitàAutoimmunità

40 Malattie autoimmuni legate a mimicrismo antigenico

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43 Tossine batteriche

44 Endotossine

45 Batteri Gram negativi: rilascio LPS

46 Antigen-O: antigenic properties, highly variable polysaccharide which is responsible for serologic diversity. Core: conserved polysaccharide, divided in two regions, outer-core and inner-core. Lipid A: allows LPS insertion into the outermembrane and shows a similar structure among different species. Porzione Polisaccaridica: Porzione lipidica: Struttura del Lipopolisaccaride

47 Endotossine: effetti Reazioni infiammatorie aspecificheReazioni infiammatorie aspecifiche Stimolano rilascio di citochineStimolano rilascio di citochine Inducono attivazione del complementoInducono attivazione del complemento Sono mitogeni / attivatori policlonali per i linfociti BSono mitogeni / attivatori policlonali per i linfociti B Agiscono come adiuvantiAgiscono come adiuvanti PirogeniPirogeni

48 Ipotensione (tissue pooling of fluids) Ipotensione (tissue pooling of fluids) coagulazione intravascolare disseminata coagulazione intravascolare disseminata febbre febbre insufficiente ossigenazione tessutale insufficiente ossigenazione tessutale generalizzata insufficienza di organi generalizzata insufficienza di organi Shock settico

49 Sistemi dellospite partecipano alla comparsa degli effetti tossici da endotossine LPS binding protein (LBP) CD14: LPS receptor on PMNs/M Receptor for other cell types? Signal transduction? C3H/HeJ mice lps gene is Toll-like receptor 4 MD2? Transcription factor: NF- LPS inducible proinflammatory factors: TNF, IL-1, IL-6/IL-8, NO, PAF, …

50 How does LPS signal cells? Macrophage: LBP CD14 LBP Endothelial cell: LBP Soluble CD14 LBP

51 CD14 is a GPI-linked protein and cannot transmit a signal across the plasma membrane. CD14 must require a co-receptor capable of signaling. How does LPS signal cells?

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53 LPS signal transduction pathway MyD88-dependent pathway MyD88-independent pathway

54 Bacteria LPS Macrophages Linphocytes PMN +IFN +IL2 +IL3 - IL4 IL 1 TNF IL 6 PAF Proteases Free Radicals Eicosanoids Endothelial cells Fibroblasts ICAM, ELAM 1 IL-1 Endothelial cells

55 Effect of cytokines release Primary mediators (IL1, IL6, TNF ) Secondary mediators (NO, PAF, PG, LT, IL) Vasodilatation, capillary leak, endothelial damage, Reduced cardiac output, Respiratory failure,… Endothelial/Leukocytes molecular activation LPS Macrophages/Endothelial cells direct response

56 Effect of cytokines release

57 Genetic polymorphism and variability in host response Allelic variants Receptors: TLR4: D299G & T399I, 8% increased susceptibility to bacterial infection (decreased risk atherosclerosis); TLR5: 392Stop, susceptibility to legionnaires disease; CD14: -159 C>T reduced expression of mCD14; NOD2: several mutations associated to reduced response to LPS; Allelic variants Effector molecules: TNF : 308 A>G, 3,7-fold increase in mortality by sepsis. IL1ra: two copies intron 2 associated to 2.1-fold increase in risk of severe sepsis.

58 Curr Opin Pulm Med, 2003

59 Endotoxins and Complement system

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61 In sepsis the extrinsic coagulant pathway is activated (TFexposed on damaged endothelial cells) > thrombin release >> fibrin deposition >>> Homeostatsis of Coagulation cascade is lost in Sepsis In sepsis the anticoagulant and profibrinolytic mechanisms are down regulated with a resultant procoagulant state.

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63 How to test for Endotoxins? Rabbit Pyrogen Test –FD approved in 1941 Cell based assays –In Vitro pyrogen assay LAL Test –gel clot LAL approved in 1973 –kinetic LAL in 1987

64 Rabbit Pyrogen Test Measure the change in temperature of 3 rabbits, after intravenous injection of the test solution.

65 Cell based assays Whole blood assay Measure by ELISA the release of inflammatory cytokines (IL-1, IL-6 and TNF ) in the culture supernatant of blood mononuclear cells exposed to test samples. LPS? Secretion of cytokines

66 LAL Limulus Limulus - genus of Horseshoe Crab Amoebocyte - blood cells Lysate - blood extract LAL is a FDA regulated biological that reacts chemically in the presence of gram negative cell debris. This reaction can be measured and quantified.

67 LAL Testing Gel Clot(Limit Test) Gel Clot(Semi-Quantitative) Endpoint Chromogenic Endpoint Turbidimetric Kinetic Chromogenic Kinetic Turbidimetric

68 Horseshoe Crab

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70 LAL Assay LAL is > 100 times more sensitive, specific and accurate Economy of LAL permits more testing Tolerance of rabbits to endotoxin is a concern for FDA LAL activity correlates with pyrogenicity

71 Clotting Reaction For Activated LAL Endotoxin Pro-Clotting Enzymes Clotting Enzyme Substrate CoagulogenCoagulin Gel M ++ pH=7.2

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73 Gel Clot LAL PlusMinus Lowest reagent cost Variability, subjectivity Simple reporting (+/-)Least sensitive Good stabilityTime consuming Simple technique Poor trending options

74 Sources of gel clot test problems Use of improper reaction or dilution tubes Incubating temperature too hot or too cold Improper dilutions Improper handling of lysate

75 Kinetic LAL Testing CLOTTING CASCADE CLOT coagulogen proclotting enzyme chromogenic substratepNA clotting enzyme coagulin Endotoxin

76 Kinetic LAL Advantages Quantitative results Higher throughput (96 wells) Lower sensitivity (to.001) Wider standard curve range Clear concise reporting Allows for data trending

77 Tossine batteriche

78 Domande 1.Cosa si intende per microrganismo saprofita e parassita? 2.Quali forme di rapporto si possono instaurare tra un parassita ed il suo ospite pluricellulare? 3.Quali sono i vantaggi che fornisce la flora microbica saprofitica del tratto GI al suo ospite? 4.Quali sono i fattori che influenzano levoluzione dellincontro tra un microrganismo ed un ospite pluricellulare? 5.Quali sono le principali vie di infezione? 6.Quali sono i meccanismi di difesa aspecifici di cui è dotato un organismo pluricellulare per controllare la popolazione microbica presente su cute e mucose? 7.Quali i meccanismi di difesa specifici di cui siamo dotati per neutralizzare i microrganismi? 8.Cosa si intende per carica infettante? 9.Cosa si intende per virulenza di un microrganismo e da cosa è determinata? 10.Descrivere le varie fasi nello sviluppo di una infezione 11.Adesione batterica: significato e strutture coinvolte 12.Colonizzazione: significato e modalità di colonizzazione per i vari distretti corporei 13. Biofilm: struttura, significato biologico ed importanza per processi infettivi

79 14. Meccanismi di disseminazione batterica 15. Meccanismi di escape dalla risposta immunitaria 16. Cosa si intende per Patogeni intracellulari e quali le strategie usate da questi batteri 17. Meccanismi di patogenicità batterica diretti ed indiretti 18. Endotossine batteriche: struttura, meccanismo dazione ed effetti nellospite 19. Caratteristiche generali delle esotossine 20. Tipi principali di esotossine 21. Tossine con target extracellulare 22. Esotossine tipo I: tossine che agiscono sulla superficie cellulare 23. Esotossine che danneggiano la membrana cellulare 24. Cosa sono e quale è la struttura/meccanismo dazione delle emolisine 25. Determinanti genetici delle esotossine batteriche con esempi 26. Esotossine con target intracellulare: descriverne il meccanismo dazione 27. Esotossine con target intracelulare: descriverne la organizzazione molecolare 28. Esotossine con target intracellulare: descrivere tipo di attività enzimatica catalizzata 29. Esotossine batteriche: tossina colerica (struttura e meccanismo dazione) 30. Esotossine batteriche: tossina antrace (struttura e meccanismo dazione) 31. Esotossine batteriche: tossina difterica (struttura e meccanismo dazione) 32. Esotossine batteriche: tossine botulinica e tetanica (struttura e meccanismo dazione) 33. Tossine di tipo IV: inoculate nella cellula bersaglio 34. Applicazioni biotecnologiche tossine batteriche 35. Cosa sono le infezioni opportunistiche e quale la loro rilevanza


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