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Agonista Superagonista Agonista parziale Antagonista competitivo Antagonista non competitivo Antagonista irreversibile Potenza Efficacia Affinita.

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Presentazione sul tema: "Agonista Superagonista Agonista parziale Antagonista competitivo Antagonista non competitivo Antagonista irreversibile Potenza Efficacia Affinita."— Transcript della presentazione:

1 Agonista Superagonista Agonista parziale Antagonista competitivo Antagonista non competitivo Antagonista irreversibile Potenza Efficacia Affinita

2 Risposta EC 50 Potenza Efficacia ~ sigmoidale ?

3 D + RDR Risposta

4 Binding R R R R SeparazioneFiltrazione, centrifugazione ligando radioattivo tessuto, membrane R Quantificazione

5 R R R R R R R R R R R R Totale (come prima) Non-specifico (in presenza di un eccesso di Farmaco non radioattivo) R R R R Legame specifico = legame totale - legame non specifico

6 Protocollo di binding (tipo 1) ([crescenti] di radioattivo R [R] R [3R] R R [10R] R R R [30R] R R R R R + tutti i non-specifici rispettivi

7 Siti saturabili (Specifico) Siti infiniti e non saturabili (non specifico) totale

8 musc nic R R R R Acetilcolina radioattiva totale Non-specifico musc nic R R Acetilcolina Radioattiva + Eccesso di muscarina Recettori muscarinici = totale legato da R - non-specifico in presenza di musc

9 Autoradiografia per scoprire la distribuzione di proteine di membrana o intracellulari

10 La PET come limite estremo di binding

11 D + RDR [DR] [D] [R] K a = 1Ka1Ka Kd = Quando [DR] = [R] allora K d = [D] [D][R] [DR] K d = k1 k2 Affinita

12 D + RDR ( ) (1 - ) R + DR e un numero costante. Quindi vi sara una concentrazione di D con la quale tutti i recettori saranno occupati. Questo proprieta viene definita saturazione [D] - [D] K A = K A D - K A D = K A D = + K A D

13 Lo Scatchard plot = K A [D] 1 +K A [D] [DR] [R T ] K A [D] 1 +K A [D] = [DR] + K A [D][DR] = [RT]K A [D] =[R T ]K A - K A [DR] [DR] [D] =-K A ([DR] - [R T ]) [DR] [D] Proporzione dei recettori legati

14 [DR] [D] [DR] Pendenza = - K A RTRT =-K A ([DR] - [R T ]) [DR] [D]

15 Scatchard Plot LEGATO LEGATO/ LIBERO B max Ka (-pendenza)

16 A C B Legato/Libero (dpm/nM) Legato (dpm)

17 Avete appena scoperto un nuovo metodo per ottenere cellule dissociate da un organo ma dovete caratterizzare il sistema per confermare che queste cellule si comportano in maniera uguale al tessuto originale. Per fare questo, utilizzate N- metil-scopolamina ( 3 H-NMS) ed una sospensione di cellule intatte (100,000 cellule per tubo). Affinita ed il numero di recettori per cellula. [3H-NMS] pMlegame specifico (fmol/tubo)

18 I due tipi di binding: tipo I e tipo II SaturazioneCompetizione [X*] [3X*] [X*]

19 Protocollo di binding (tipo 2) Radioattivo fisso e [crescenti] di spiazzante non radioattivo R [R] R R R R R [R] + F R R R R [R] + 10F [R] +1000F R R R R Non specifico Perche utilizzare questo protocollo???

20 Binding R R R SeparazioneFiltrazione, centrifugazione ligando radioattivo tessuto, membrane R Quantificazione

21

22 Esempio di binding (II) CONCENTRAZIONE DI RADIOATTIVO COSTANTE; INCREMENTO DI SPIAZZANTE Curva di inibizione

23 A* + R ARB + R BR K A = [AR] [A][R] K B = [BR] [B][R] [AR] = K A [A][R][BR] = K B [B][R] R T = [R] + [AR] + [BR] = [R] + K A [A][R] + K B [B][R] = [R](1+ K A [A] + K B [B]) [R] = (1+ K A [A] + K B [B]) RTRT [AR] = K A [A]R T (1+ K A [A] + K B [B]) [AR] R T K A [A]R T (1+ K A [A] + K B [B]) =

24 [AR] RT K A [A]R T (1+ K A [A] + K B [B]) = 0.5 IC 50 Se K A e K B sono uguali: K A = 1 + K B [B]* IC 50 K A = 1 IC 50 - D*

25 Esempio di binding (II) Legame specifico: = 3000 N.S. Legame a 0.1 nM di radioattivo D* = 0. 1 nM IC 50 = 0.2 nM K A = 1 IC 50 - D* DR RT [D*]K A [*D]K A + 1 = Una delle prime formule che abbiamo visto

26 Proviamo LNAADP e un possibile secondo messaggero. Per dimostrare che possiede recettori specifici intracellulari, e stato sintetizzato [ 32 P]NAADP ad una attivita specifica di 800 Ci/mmol. Il binding e stato fatto con concentrazione fissa di [ 32 P]NAADP (50 pM),100 µg di proteina e concentrazioni crescenti di NAADP. [NAADP] pM DPM


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