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Elettrofisiologia e Biofisica di Membrana Laurea Magistrale in Neurobiologia Docente: Prof. Mauro Toselli Potrete scaricare gli argomenti.

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2 Elettrofisiologia e Biofisica di Membrana Laurea Magistrale in Neurobiologia Docente: Prof. Mauro Toselli Potrete scaricare gli argomenti trattati a lezione al seguente indirizzo web: Durante il corso: una esercitazione obbligatoria Occorre fornire il proprio indirizzo di posta elettronica Vol II-III

3 Di cosa si occupa la Biofisica In questo corso ci occuperemo di biofisica della cellula con particolare riguardo alle cellule elettricamente eccitabili e a quei fenomeni in cui è coinvolta la membrana cellulare

4 Diffusione e flussi Trasporti mediati Equazione di Nernst Legge di Ohm Potenziale di Membrana

5 E una proprietà fisica fondamentale di tutti i processi biologici Perché parlare del concetto di diffusione? e costituisce il motore tramite il quale le cellule possono generare segnali

6 Qualche esempio È attraverso flussi diffusionali che molecole nutritizie e O 2 passano dal sangue alle cellule dei vari tessuti. Un evento fondamentale che sta alla base del funzionamento dei neuroni, la genesi del potenziale dazione, è prodotto dalla diffusione di ioni Na + dentro la cellula nervosa. La trasmissione sinaptica, un evento fondamentale per la comunicazione neuronale, avviene per diffusione del neurotrasmettitore dal teminale pre-sinaptico di un neurone al terminale post-sinaptico di un altro neurone. La conoscenza della velocità di diffusione di un farmaco nellorganismo (farmacocinetica) fino al raggiungimento delle cellule bersaglio è fondamentale per la prescrizione del dosaggio.

7 Che cosa spinge le particelle a diffondere? La diffusione è il movimento molecolare generato dallenergia termica: moti browniani (A. Einstein) Che cosè lEnergia Termica? Energia Termica = kT (u.d.m. joules) costante di Boltzmann 1.38x joules/ o K temperatura assoluta 300 o K a temperatura ambiente Nota: k · N (Numero di Avogadro) = R (costante dei gas) = P·V/T

8 Diffusione di Soluti 1 2 Dove: n=n o particelle N= numero di Avogadro A=area T=tempo Flusso Molare Unidirezionale: Quantità di soluto (in moli) che attraversa unarea unitaria nellunità di tempo [moli/(cm 2 ·sec)] Flusso netto:

9 Il flusso è proporzionale alla pendenza del gradiente di concentrazione La costante di proporzionalità è il coefficiente di diffusione (D) Prima Legge di Fick flusso d[C] dx flusso F D d[C] dx C X XoXo

10 Quali sono le unità di misura del coefficiente di diffusione (D) ? == mol cm 2 s D mol cm 3 D mol cm 4 D cm 2 s

11 Le unità di misura del flusso sono: Ammontare di C per Area per Secondo; Dal momento che il flusso si sviluppa nel tempo, il risultante movimento di C causa un corrispondente cambiamento della sua concentrazione nel tempo Seconda legge di Fick LEquazione della Diffusione" t0t0 t1t1 t2t2 t3t3

12 Condizione iniziale: a t=0 tutte le N o particelle sono concentrate nellarea (A) Condizioni al contorno: (1.) la concentrazione è finita ovunque. (2.) il numero totale di particelle (N 0 ) è costante. allora la soluzione sarà: Per risolvere questequazione differenziale occorre specificare una condizione iniziale e due condizioni al contorno, quindi essa ha più soluzioni diverse, Inoltre, essendo: sarà: Seconda legge di Fick: il tempo necessario affinchè ad una certa distanza dalla sorgente della diffusione, la concentrazione del soluto raggiunga un determinato livello, cresce col quadrato della distanza

13 Distanza (x) Concentrazione (C) 0.05 = Dt Ciascuna linea è unistantanea del profilo spaziale della concentrazione in funzione della distanza a tempi diversi dalla partenza del processo diffusivo La relaziomne tra concentrazione (C) e distanza (x) è simmetrica rispetto allorigine per valori positivi e negativi di x Distanza (x) C Mostra il profilo spaziale della concentrazione ad un tempo fisso Si tratta di una curva di Gauss (distribuzione normale)

14 Cè un flusso netto di soluto dalla zona ad alta concentrazione a quelle a bassa concentrazione I a Legge di Fick per la diffusione flusso diffusivo Da cui si ricava che, allo stato stazionario: Il flusso è proporzionale alla pendenza del gradiente di concentrazione La costante di proporzionalità dipende dalla mobilità del soluto CF d

15 Diffusione attraverso una membrana aspetti quantitativi Rappresentazione grafica del processo di diffusione animazioni

16 Lato est. Lato int. Prima legge di Fick della diffusione attraverso una membrana Assumiamo: - V i e V o sono costanti - i bagni sono ben mescolati - vale il principio di conservazione della materia e la membrana è sottile: c i V i +c o V o =N - la membrana si trova sempre allo stato stazionario: F=P(c i -c o ) (Pperm. della membr. al soluto)

17 Diffusione attraverso una membrana la concentrazione di soluto varia nel tempo con un andamento esponenziale 63% di (c - c o ) = 77 37% di (c o - c ) = 143 c eq =110

18 Una membrana costituita da un puro bilayer fosfolipidico è impermeabile alle proteine, alla maggior parte delle piccole molecole e agli ioni Gas Etanolo Piccole molecole polari non cariche Acqua Urea Grosse molecole polari non cariche Glucosio Ioni Molecole polari cariche Aminoacidi ATP Glc-6-P

19 Passaggio attraverso la membrana di particelle mediante proteine di trasporto

20 Caratteristiche dei trasporti mediati I carriers sono dotati di specificità Sono soggetti a saturazione Possono essere bloccati dagli inibitori competitivi Hanno unelevata dipendenza termica e dal pH

21 I trasportatori hanno le caratteristiche di enzimi I carriers agiscono cataliticamente come gli enzimi Legano selettivamente il loro substrato, cioè la molecola che deve essere trasportata Cambiano di conformazione per rilasciare il substrato dallaltro lato Ritornano alla conformazione originale per legare unaltra molecola di substrato Seguono una cinetica del tipo Michaelis-Menten

22 Flusso netto [moli/(cm 2 s] C (mM) 10 4 F max F C F=k d C Analisi cinetica del transporto di una molecola tramite proteina carrier: saturazione In base alla I a legge di Fick il flusso di particelle che diffondono liberamente aumenta linearmente allaumentare della concentrazione Ma la I a legge di Fick non viene più rispettata se si tratta di un flusso di particelle attraverso la membrana mediato da carriers I flussi mediati da carriers - a differenza della diffusione libera - sono saturanti Ciò accade per due motivi: 1.Sulla membrana è presente un numero finito di carriers; 2.Ciascun carrier opera ad una velocità finita

23 Flusso (Particelle/Carrier/s) N. particelle N. partic.Vel. (p./s) Rappresentazione del concetto di saturazione con un esempio numerico Velocità del carrier: 50 part./s Per semplicità consideriamo una membrana con un solo carrier

24 Quesito su cui meditare Distruggendo, o bloccando irreversibilmente con un farmaco la metà dei carriers sulla membrana, F max rimarrebbe inalterata, aumenterebbe o diminuirebbe?

25 ? C1C1 1.Si introduce nella provetta il substrato S radioattivo ad una concentrazione C 1 2.A tempi successivi (t 0, t 1, t 2, t 3, …) si preleva un campione dalla provetta e si misura la concentrazione di S radioattivo allinterno delle cellule del campione [S] in Tempo pendenza della retta 3.Dividendo la velocità v 1 per larea della membrana si ottiene il primo valore del flusso F 1 riferito alla concentrazione C 1 (vedere definizione di flusso) Flusso netto [moli/(cm 2 s] C (mM) C1C1 F1F1 Cellule in sospensione Come sono stati ottenuti i dati del grafico che illustra come varia il flusso al variare della concentrazione?

26 C2C2 C3C3 C4C4 Successivamente si introduce in ciascuna provetta substrato S radioattivo alle altre concentrazioni C 2, C 3, C 4 …. crescenti e si ripete la stessa procedura descritta precedentemente Flusso netto [moli/(cm 2 s] C (mM) C1C1 F1F [S] in Tempo C2C2 F2F2 C3C3 F3F3 V 4 F 4 V 3 F 3 V 2 F 2 C4C4 F4F4

27 Flusso netto [moli/(cm 2 s] C (mM) 10 4 F max + I c I carriers, come gli enzimi, possono essere soggetti ad inibizione competitiva

28 Prob[Ic][S] Come funziona un inibitore competitivo? Flusso [S] S S+Ic substrato Inibitore comp. solo SS << I c S >> I c Se si vuole costruire un grafico che rappresenti un range di concentrazioni molto ampio (alcuni ordini di grandezza) conviene rappresentare le concentrazioni in scala logaritmica

29 Flusso netto [moli/(cm 2 s] C (mM) Flusso netto [moli/(cm 2 s] C (mM) k a1 k a2 k a3 Calcolo della costante di affinità k a k a è quel valore di concentrazione del substrato al quale il flusso è la metà di quello massimo k a è inversamente proporzionale allaffinità del carrier per il substrato In presenza di I c varia k a Mentre, il valore di F max non cambia

30 Un ricercatore trova che la velocità con cui una sostanza è trasportata allinterno di certe cellule varia al variare della sua concentrazione come illustrato in tabella. 1.Trovare i corrispondenti valori di flusso sapendo che larea di membrana su cui sono state fatte le misure è 3·10 -2 cm 2 ; 2.Rappresentare graficamente i valori del flusso al variare della concentrazione di substrato in due grafici distinti ove le concentrazioni sono rappresentate rispettivamente in forma lineare e logaritmica; 3.Ricavare dal grafico i valori di F max e k a. Quesito del giorno Conc. mM v (mmol/s)

31 Risposta al quesito mmoli/s/cm 2 Concentr mmoli/s/cm 2 Concentr.

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33 Migrazione in un campo elettrico t0t0 t1t1 è la pendenza del gradiente elettrico La costante di proporzionalità dipende dalla mobilità e dalla concentrazione del soluto ovvero: Cè un flusso netto di cationi (K + ) verso il catodo (polo -) e di anioni (Cl - ) verso lanodo (polo +)

34 cariche -cariche + Anioni Cationi Citoplasma Spazio extracell. { membrana Una differenza di cariche (Δq) ovvero di potenziale elettrico (ΔV) ai due capi della membrana influenza il movimento degli ioni Equazione di Nernst-Planck: Quindi, il flusso di particelle cariche dipende non solo dal gradiente di concentrazione ma anche dal gradiente elettrico

35 Equazione di Nernst Permette di calcolate il potenziale di equilibrio di una specie ionica note le sue concentrazioni allequilibrio a cavallo della membrana

36 u N u /N Legge di distribuzione di Boltzmann Ogni curva di distribuzione ha la forma di una campana irregolare e asimmetrica. E' una legge sperimentale che rappresenta il numero di particelle N u che possiedono una certa energia, in funzione dell'energia stessa u: cioè ad ogni valore di energia (a una data temperatura T) corrisponde un numero definito di particelle con quella energia. A T 1 < T 2 la maggior parte delle molecole è distribuita in un intervallo più ridotto di u: poche molecole perciò potranno avere u sufficiente per superare la barriera energetica. All'aumentare della T (curva T 2 ) aumenta il numero di molecole con u sufficiente, perciò aumenta la velocità della reazione. Le aree sottese dalle due curve sono eguali poiché rappresentano lo stesso numero totale di molecole N

37 Equazione di Boltzmann Mette in relazione le probabilità di una particella di trovarsi nello stato energetico o nello stato energetico con le differenze di energia u 2 -u 1 = u tra i due stati: k cost. di Boltzmann T temp. assoluta u 2 -u 1 = G variaz. di energia libera La particella spende il minor tempo nello stato ad energia maggiore Stato 1 Stato 2 Energia u Lequazione di Nernst è ricavabile dall equazione di Boltzmann della meccanica statistica

38 Nel caso di particelle elettricamente cariche, se U 2 -U 1 è la differenza di potenziale elettrochimico molare di uno ione permeante, dovuta alla differenza di potenziale di membrana V 2 -V 1, e se la carica dello ione è z, allora: Allequilibrio U 2 -U 1 =0: che è lequazione di Nernst ! Passando dalle probabilità P alle concentrazioni c e dallenergia di una singola particella u allenergia molare U, si ottiene: R cost. dei gas ( R=k·N, N n o di Avogadro) U 2 -U 1 = è lenergia molare (potenziale chimico) ed espressa in joules/mole ovvero: c1c1 c2c2

39 K + Cl mM Na + Cl mM K+K+ K+K+ K+K+ K+K+ K+K+ ΔCΔC ΔEΔE ΔCΔC ΔEΔE ΔCΔC ΔEΔE 0 Quando si applica lequazione di Nernst: membrana permeabile ad almeno una specie ionica ed impermeabile ad almeno unaltra Allequilibrio: flusso dovuto al gradiente di conentrazione = flusso dovuto al potenziale elettrico Si tratta di un equilibrio elettrochimico: Equilibrio di Donnan

40 Equilibrio di Donnan fusso dovuto al gradiente di concentrazione fusso dovuto al gradiente elettrico La lunghezza delle frecce indica lintensità dei flussi toto t1t1 t2t2 Allequilibrio, applicando lequazione di Nernst sarà: Ovvero:(Equazione di Donnan)

41 Conseguenze: Viene prodotta una differenza di potenziale transmembranaria ΔV stabile nel tempo; La concentrazione totale degli ioni diffusibili (K + e Cl - ) è maggiore dal lato dove si trova lo ione non diffusibile (Pr - ): [K + ] 2 +[Cl - ] 2 >[K + ] 1 +[Cl - ] 1 Vi è un aumento di pressione osmotica dal lato dello ione non diffusibile

42 In tutte le cellule cè una differenza di potenziale a cavallo del plasmalemma stabile nel tempo (pot. di riposo) Cellula Assone gigante di Calamaro Fibrocellula muscolare di Rana Neurone di Mammifero ione K + Na + Cl - K + Na + Cl K + Na + Cl - conc.extracell. (mM/litro) conc.intracell. (mM/litro) pot. di Eq. (mV) Potenziali di equilibrio dei vari ioni in alcuni tipi di cekllule

43 Domanda molto pertinente: visto che il PR si mantiene costante nel tempo (e così pure le concentrazioni ioniche), si può dire che a cavallo della membrana sussiste un equilibrio elettrochimico ? La risposta è NO Infatti, il PR non coincide col potenziale di equilibrio (potenziale di Nernst) per nessuna delle specie ioniche presenti. A 18°C …. Cellula Assone gigante di Calamaro Fibrocellula muscolare di Rana Neurone di Mammifero ione K + Na + Cl - K + Na + Cl K + Na + Cl - conc.extracell. (mM/litro) conc.intracell. (mM/litro) pot. di Eq. (mV) RP ( mV )

44 K + Cl mM Na + Cl mM K+K+ Na + K+K Quando si genera un potenziale di diffusione: t1t1 t2t2 p K >p Na f K >f Na f K =f Na p K >p Na Si genera quando la membrana è permeabile in misura diversa alle varie specie ioniche Il suo raggiungimento comporta: Equilibrio elettrico ma squilibrio elettrochimico Flusso netto non nullo delle varie specie ioniche Un potenziale di diffusione non si mantiene indefinitivamente

45 K + Na + Cl - Il potenziale di membrana è una conseguenza di una permanente differenza di concentrazione ionica ai due capi della membrana Questa è prodotta da: una membrana permeabile in maniera selettiva ma con valori diversi di permeabilità a diverse specie ioniche (potenziale di diffusione) flussi passivi e attivi degli ioni permeanti GENESI DEL POTENZIALE DI MEMBRANA

46 Equazione di Goldman-Hodgkin-Katz (GHK) per il Voltaggio V m RT F ln P K K O P Na Na O P K K i P Na Na i P Cl Cl i P Cl Cl O Se il potenziale di membrana V m è dovuto ad un potenziale di diffusione, esso non coinciderà con nessuno dei potenziali di equilibrio delle specie ioniche permeanti (V m E i ). In questo caso, invece dellequazione di Nernst vale la seguente equazione: che è derivata dallequazione di Nernst-Plank per i flussi: Qualora la membrana fosse permeabile solo al K + (cioè P Na =0 e P Cl =0): V m RT F ln P K K O P K K i RT F ln K O K i E K

47 In base ai dati indicati in tabella e sapendo che la membrana è permeabile a Na e K con il seguente rapporto di permeabilità: PK : PNa = 10 : 1, calcolare il potenziale di membrana V m applicando lequazione di GHK. Confrontare il valore trovato con quello che si otterrebbe se PK:PNa=1:1. IoneCitoplasmaExtracell. (mM) Na K + 3 Quesito P K :P Na =10:1 P K :P Na =1:1

48 È possibile costruire un modello circuitale elettrico equivalente della membrana Ciò semplifica la trattazione dei fenomeni bioelettrici di membrana

49 A questo punto, però, sarà bene andare a ripassare le principali leggi che regolano i circuiti elettrici e i principali elementi passivi che li costituiscono

50 Definizione di potenziale elettrico A ha un potenziale elettrico più elevato di B se connettendo A e B con un conduttore una corrente positiva fluisce da A a B La convenzione standard per il potenziale di membrana è: E m = (Ψ e -Ψ i ) ΨiΨi ΨeΨe Potenziale del bagno Potenziale intracellulare La convenzione standard per la corrente di membrana è: cariche (+) che si muovono fuori dalla cellula generano una corrente positiva +I m -I m Lenergia immagazzinata nel potenziale elettrico è in grado di compiere un lavoro dal momento che le cariche si muovono da un alto a un basso valore del potenziale

51 EstInt Il gradiente di concentrazione dellNa + è orientato in modo da mandare cariche positive nella cellula qualora lNa + possa passare Da un punto di vista elettrico ciò equivale a dire che esiste una batteria al Na + con un determinato orientamento Nonostante esista un gradiente di concentrazione dellNa +, cioè una batteria al Na +, per il momento non cè flusso di corrente perché il canale del Na+ è per ora chiuso! Cioè, da un punto di vista circuitale ciò equivale a dire che per il momento il circuito è aperto E Na +

52 In seguito allapertura del canale selettivo per il Na + vi sarà un flusso di corrente (I Na ) generato dal gradiente di concentrazione dellNa +, cioè dalla batteria al sodio E Na Lintensità del flusso di corrente I Na dipenderà, oltre che dallintensità della batteria al Na + (E Na ), anche dalla resistenza che il canale offrirà al passaggio degli ioni Na + La permeabilità del canale nei confronti dello ione può essere rappresentato da un punto di vista elettrico con un resistore R Na ovvero con il suo inverso la conduttanza g Na g Na E Na EstInt E Na + g Na

53 Pertanto, un canale e il gradiente di concentrazione dello ione permeante che lo attraversa possono essere rappresentati da un punto di vista elettrico come costituiti rispettivamente da un resistore e da una batteria in serie Se sulla membrana esistono più canali ciascuno selettivo per un certo ione, il circuito elettrico equivalente sarà del tipo: esterno interno Na + K+K+ Cl - E Na g Na gKgK g Cl EKEK E Cl

54 K + Cl - Na + Cl - ExtraIntra VmVm Si è visto che un potenziale di diffusione si genera quando la membrana è permeabile in misura diversa ad almeno due specie ioniche, ad es. Na + e K + Daltra parte la membrana plasmatica con il suo corredo di canali ionici e di ioni diversamente concentrati ai suoi lati, è assimilabile ad un conduttore elettrico dotato di batterie e resistori Nellesempio a lato il circuito simula una membrana dotata di canali selettivi per K + e Na + E possibile applicare la legge di Ohm ad ogni maglia del circuito: I i = g i ·(V m -E i ) dove:g i conduttanza della membrana per lo ione i (V m -E i ) d.d.p. elettrochimico che muove lo ione i (driving force) Studiando il potenziale di diffusione abbiamo visto che a un certo istante il flusso di K + è uguale e contrario al flusso di Na +, ovvero la somma delle correnti I K e I Na è nulla: equilibrio elettrico I Na + I K = 0 Quindi: Pertanto il potenziale di membrana sarà: E Na g Na EKEK I Na IKIK

55 Quesito del giorno Dati: Trovare: 2) Vm= -30mV; E Na =+50mV; E K = -70mV; g Na =10mS; g Cl =0 gK=….. 1) E Na =+55mV; E K = -90mV; g Na =22mS; g K =55mS; g Cl =0 Vm=….. 3) E Na =+62mV; E K = -90mV; E Cl = -92mV; g Na =20mS; g K =50mS; g Cl =20 mS Vm=…..

56 12 Risposte 3

57 Problema In seguito allarrivo di un quanto di neurotrasmettitore, che attiva un certo numero di recettori-canale a livello di un terminale postsinaptico, viene generato un potenziale postsinaptico di mV. Se a livello del terminale postsinaptico il potenziale di membrana prima dellarrivo del neurotrasmettitore era di -80 mV, la conduttanza di un singolo recettore canale è di 30 pS, il potenziale di equilibrio dello ione permeante attraverso il recettore-canale è di 0 mV e la resistenza dingresso della cellula a livello del terminale postsinaptico è di 1M, stabilire quanti recettore-canali vengono attivati durante la genesi di quel potenziale post- sinaptico. La resistenza dingresso (R i ) di una cellula è la resistenza complessiva che la membrana offre al passaggio di corrente, e quindi ad una variazione del potenziale. Essa è misurabile applicando una differenza di potenziale nota ai due capi della cellula e andando a misurare la corrente transmembranaria, oppure iniettando una corrente nota nella cellula e andando a misurare la differenza di potenziale generata ai due capi della membrana.

58 Dati del problema: V PPS = mV = 30 pS V r = -80 mV V eq = 0 mV R i = 1 M Calcoliamo innanzi tutto la corrente che attraversa un singolo recettore-canale: i = ·(V r -V eq ) = 30· ·(-80·10 -3 ) A = -24· A = -2.4 pA Ricordando che la resistenza dingresso (R i ) di una cellula è la resistenza complessiva che la membrana offre al passaggio di corrente, e quindi ad una variazione del potenziale, ed essendo R i, secondo la legge di Ohm, uguale al rapporto tra la differenza di potenziale generata ai due capi della membrana e la corrente totale che attraversa la membrana, avremo che: V PPS = I tot ·R i = n·i·R i e quindi, n = V PPS /(i·R i ) = -0.24·10 -3 /(-24· ·1·10 6 ) = 100 Soluzione


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