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1 Ministero dellUniversità e della Ricerca Scientifica e Tecnologica Università degli studi di Palermo Unione europea Dottorato in Tecnologie delle Sostanze.

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1 1 Ministero dellUniversità e della Ricerca Scientifica e Tecnologica Università degli studi di Palermo Unione europea Dottorato in Tecnologie delle Sostanze Biologicamente Attive XX Ciclo A.A.2005/06 Dipartimento di Scienze Chimiche, Università di Catania, V.le A. Doria, 6, Catania TECNICHE TERMOANALITICHE APPLICATE ALLO STUDIO DI COMPOSTI E SISTEMI COLLOIDALI BIOLOGICAMENTE ATTIVI Dott.ssa Dorotea Micieli Tutor: Chiar.mo Prof. Francesco Castelli Coordinatore: Chiar.mo Prof. Gaetano Giammona Università degli Studi di Catania

2 2 ARTICOLAZIONE DELLA RICERCA: 1. Studi cinetici e dinterazione con modelli di biomembrane: Sitosterolo e -Ciclodestrine; Castelli F, Sarpietro MG, Micieli D, Trombetta D, Saija A ; J.Agr.Food Chem. 2006; 54: Resveratrolo e suoi derivati; Sarpietro MG, Spatafora C, Tringali, Micieli D, Castelli F; J. Agric. Food Chem. 2007; 55: Terpeni, derivati dellorigano; Castelli F, Sarpietro MG, Micieli D, Trombetta D, Saija A, Bisignano G ; J. Agric. Food Chem : Gemcitabina e Aciclovir: suoi prodrugs squalenici; Castelli F, Sarpietro MG, Micieli D, Stella B, Rocco F, Cattel L. ; J. Coll. Interf. Sci ; 316:43-52 Castelli F., Sarpietro M.G., Micieli D., Ottimo S., Rocco F., Ceruti M.; 6th World Meeting on Pharmaceutics, Biopharmaceutics and Pharmaceutical Technology. Barcelona, Spain, 7-10 April 2008 Idrogel di Inulina: effetto del loading e del pH; Castelli F., M.G. Sarpietro, Micieli D., Ottimo S., Pitarresi G., Tripodo G., Carlici B., Giammona G. Eur J Pharm Eur J Pharm Sci ; 35(1-2):76-85 Prodrugs lipofilici del Naprossene; Castelli F., Sarpietro M.G., Micieli D., PantòV., Pignatello R.; 6th World Meeting on Pharmaceutics, Biopharmaceutics and Pharmaceutical Technology. Barcelona, Spain, 7-10 April 2008 Lipopeptidi immunogenici a diverso numero e lunghezza di catena; Sarpietro MG, Micieli D, Pignatello R, Liang MT, Toth I, Castelli F.; Termoch. Acta 2008; 471(1-2):14-19 SLN a base di DEET e OMC; Puglia C., Bonina F., Rizza L., Castelli F., Sarpietro M.G., Micieli D.; 6th World Meeting on Pharmaceutics, Biopharmaceutics and Pharmaceutical Technology. Barcelona, Spain, 7-10 April 2008 Inquinanti ambientali; Castelli F., Micieli D., Minniti Z., Sarpietro M.G Librando V., Chemosphere 2008; 73: Librando V, Sarpietro MG, Minniti Z, Micieli D, Castelli F; Environ Sci Technol. 2006; 40(7): Sintesi e caratterizzazione di carriers colloidali osteotropici per il trasporto di antitumorali al tessuto osseo metastatico. Pignatello R, Cenni E, Micieli D, Fotia C, Salerno M, Granchi D, Sarpietro MG, Castelli F, Baldini N.; Nanomedicine 2009, 4: Cenni E, Granchi D, Avnet S, Fotia C, Salerno M, Micieli D, Sarpietro MG, Pignatello R, Castelli F, Baldini N.; Biomaterials 2008; 29:

3 3 Tecniche impiegate: 1.Calorimetria a Scansione Differenziale (DSC) Interazione con modelli di biomembrana Cinetiche di contatto Cinetiche di trasferimento 2.Langmuir Blodgett (LB) Isoterme a 10°C Isoterme a 37°C

4 4 Liposomi come modelli di biomembrana I liposomi sono vescicole lipidiche preparate con fosfolipidi sia sintetici: dipalmitoilfosfatidilcolina, DPPC; dimiristoilfosfatidilcolina, DMPC; acido dimiristoilfosfatidico, DMPA; dilaurilfosfatidilcolina, DLPC; che naturali: fosfatidilcoline, PC; fosfatidilserine, PS; fosfatidilglicerolo, PG; etc. In particolare, utilizzando opportune miscele di questi fosfolipidi è possibile creare un sistema modello che riproduca la carica superficiale negativa delle membrane cellulari.

5 5 Le strutture vescicolari, cioè quelle sferoidali delimitate da uno o più doppi strati fosfolipidici, aventi un diametro compreso tra 20 nm e 20 m sono dette "liposomi". In queste strutture i fosfolipidi sono organizzati in modo tale da formare uno o più strati concentrici, detti lamelle, separati da uno o più strati acquosi (rispettivamente liposomi unilamellari e multilamellari). In base al metodo di preparazione si possono ottenere diversi tipi di liposomi, che possono essere così classificati: Multilamellar Vesicles (MLV); Large Unilamellar Vesicles (LUV); Small Unilamellar Vesicles (SUV).

6 6 La natura anfifilica dei liposomi permette il loro uso come drug delivery system, dal momento che allinterno delle lamelle le sostanze si possono collocare in maniera differente in funzione della loro idrofilia, infatti: le sostanze idrosolubili sono intrappolate negli spazi acquosi tra le lamelle o nello spazio acquoso interno dei liposomi; le sostanze liposolubili trovano collocazione tra le catene idrofobiche degli acidi grassi; le sostanze anfotere si possono collocare con la parte idrofila allesterno dei bilayer e con la parte idrofoba allinterno. Liposomi come drug delivery system

7 7 I fosfolipidi, quando idratati, presentano un liotropismo (esistenza di fasi differenti) in funzione della differente % di acqua presente e della temperatura di idratazione. Diagramma di fase del sistema 1,2-dipalmitoil-l-fosfatidilcolina/H 2 O

8 8 Al variare della temperatura si ottiene una transizione di fase gel-cristallo liquido, caratterizzata da una temperatura di transizione, T m, e da una variazione dentalpia, H. Questo processo può essere seguito mediante la tecnica della Calorimetria Differenziale a Scansione.

9 9 Calorimetria a Scansione Differenziale (DSC) La Calorimetria a Scansione Differenziale è una tecnica che consente di determinare, durante una scansione effettuata con incrementi lineari della temperatura, la variazione dentalpia di processo mediante misura del flusso di calore necessario per mantenere il campione della sostanza in esame alla stessa temperatura di un campione di riferimento (inerte). La tecnica consente, altresì, di eseguire misure di capacità termica, d'emissività termica e di purezza di campioni solidi; inoltre essa consente lo studio di equilibri di fase e della cinetica dei processi.

10 10 In generale composti lipofili posti a contatto con liposomi tendono a collocarsi tra le catene alifatiche o tra gli strati dei bilayers lipidici, mentre, composti che possiedono natura anfipatica, posti a contatto con i liposomi (ad una temperatura al di sopra di quella di transizione), tendono a penetrare il bilayer lipidico (processo rapido) e migrare verso gli strati più interni (processo più lento). Questa penetrazione è causata dallinterazione tra la parte polare del farmaco e le teste polari dei lipidi, e tra la parte apolare del farmaco e le catene alifatiche, causando una modificazione della struttura del bilayer lipidico che si riflette in variazioni dei T m e H.

11 Langmuir-Blodgett 11 KSV LangmuirMinitrough ( KSV, instruments Ltd., Finland) Il monolayer è un sistema bidimensionale, generalmente studiato con il metodo del film-balance di Langmuir-Adam, che in seguito a variazioni di pressione superficiale, area e temperatura, fornisce utili informazioni sulla distribuzione e sullorientazione molecolare. Esso costituisce un valido strumento per lo studio dellorganizzazione dei fosfolipidi di membrana. Luso dei monolayer, come modello di membrana, deriva dal fatto che esso rappresenta la metà di un doppio strato lipidico (bilayer) e che possiede caratteristiche direttamente legate alle proprietà di questultimo apparentemente più simile alle membrane naturali.

12 Formazione del Film Sostanze anfifiliche sono disciolte in un solvente insolubile in acqua, volatile (cloroformio, esano, etc.) Sono posizionate con una microsiringa su una superficie liquida, la soluzione diffonde rapidamente coprendo tutta larea disponibile Il solvente evapora e si foma il monolayer 12 Se larea disponibile per la deposizione è grande le molecole sono molto distanziate (il monolayer è considerato un gas bidimensionale).

13 13 DEPOSIZIONE d) Area effettiva per molecola a vari gradi di compressione del monolayer. a) stato gassoso; b) stato di liquido espanso; c) stato di liquido condensato; d) collasso del film fosfolipidico. Curva isoterma Tensione superficiale/Area per molecola

14 14 Parametri fondamentali alla base del processo sono: Tensione superficiale Tipo di molecole adoperate Pressione superficiale =tensione superficiale in assenza di monolayer 0 =tensione superficcilae in presenza di momolayer

15 15

16 16 X1X1 A P

17 Naprossene e suoi derivati lipoamminoacidici 17 Naprossene [acido (S)-(+)-6-metossi-α-metil-2-naftalen acetico ] FANS Intensa attività antinfiammatoria Moderata attività antipiretica Antidolorifico Antiaggregante piastrinico

18 18 La Demenza di Alzheimer (AD) Descritta per la prima volta nel 1907 dal neurologo tedesco Aloïs Alzheimer, è la più frequente causa di demenza nei paesi occidentali. Reazioni infiammatorie croniche, alti livelli di colesterolo, stress ossidativo sembrano essere importanti agenti promotori dei cambiamenti neurodegenerativi comunemente riscontrati nei pazienti affetti da AD. ANALISI POST MORTEM DI PAZIENTI AFFETTI DA AD Grovigli neurofibrillari intracellulari (NFT tangles) Proteina β–amiloide (Aβ), ruolo centrale nella patogenesi dellAD Mediatori dellinfiammazione intorno alle placche amiloidi nel cervello EffettoneuroprotettivodeiFANS Effetto neuroprotettivo dei FANS

19 19 ATTRAVERSAMENTO BEE PRODRUG Lipofilia Anfifilicità Membrane like-character Nap-EDA-LAA10 Nap-EDA-LAA14

20 20 Tecniche impiegate: Calorimetria a Scansione Differenziale (DSC) Interazione con modelli di biomembrana Cinetiche di contatto Cinetiche di trasferimento 2. Langmuir Blodgett (LB) Isoterme a 10°C Isoterme a 37°C

21 21 NaprosseneNap-EDA-LAA 10Nap-EDA-LAA 14

22 22 Cinetica di contatto Cinetica di trasferimento

23 23 NaprosseneNap-EDA-LAA 10Nap-EDA-LAA 14

24 24 In conclusione: La coniugazione del Naprossene ai lipoamminoacidi migliora la sua interazione con i modelli di biomembrana: la porzione LAA potrebbe localizzarsi tra le catene fosfolipidiche con la parte del farmaco che protrude nel mezzo acquoso. Lentità dellinterazione dipende dalla lunghezza della catena alchilica del lipoamminoacido. La porzione lipoaminoacidica aiuta il prodrug a essere gradualmente rilasciato dal carrier liposomiale ai modelli di biomembrana.

25 25 Resveratrolo e suoi derivati Il Resveratrolo è una sostanza fitochimica naturale presente in oltre 70 specie di piante, nelluva e arachidi Esiste in due forme, cis e trans, la forma trans, maggiormente presente nel vino, sembra essere quella più attiva biologicamente Appartiene ad una classe di fitochimici nota come stilbeni Esso è noto, ed intensamente studiato per le svariate proprietà biologiche ad esso attribuite tra cui: attività antiossidante inibizione della cicloossigenasi inibizione dellaggregazione piastrinica attività antiestrogenica Il resveratrolo ed altri stilbenoidi ad esso correlati sono stati considerati per la loro abilità di agire come radical scavenger, di prevenire la perossidazione lipidica, di avere attività chemio-protettive nelle malattie degenerative umane come laterosclerosi ed il cancro.

26 26 Resveratrolo e suoi derivati H 3 CO OCH 3 OCH 3 HO OH OH trans-Resveratrolo Metilazione chimica Acilazione chimica OCOCH 3 H 3 COCO 3,5,4-trimetilresveratrolo 3,5,4-acetilresveratrolo

27 27 Resveratrolo e suoi derivati Tecniche impiegate: Calorimetria a Scansione Differenziale (DSC) Interazione con modelli di biomembrana Cinetiche di contatto Cinetiche di trasferimento 2. Langmuir Blodgett (LB) Isoterme a 10°C Isoterme a 37°C

28 28 Resveratrolo e suoi derivati DSC 00,050,10,150, Frazione molare ( T/T° m ) x 10 3 Resveratrolo Trimetilresveratrolo Triacetilresveratrolo Resveratrolo v.c. Trimetilresveratrolo v.c. Triacetilresveratrolo v.c.

29 29 Resveratrolo TrimetilResveratrolo TriacetilResveratrolo ESPERIMENTI A 10°C ESPERIMENTI A 37°C ResveratroloTrimetilResveratrolo TriacetilResveratrolo LB

30 30 CONCLUSIONI Esaminando i risultati ottenuti si evince che: Il resveratrolo e il trimetil-derivato sono capaci di fluidificare i modelli di membrana di DMPC in dipendenza della loro concentrazione, modificando quindi la transizione di fase del lipide usato. Il triacetilresveratrolo, invece, provoca un piccolo aumento della fluidità di membrana; Per quanto riguarda le cinetiche di contatto i risultati ottenuti dimostrano che solo il resveratrolo è capace di attraversare il mezzo acquoso e interagire con i doppi strati lipidici degli MLV. Per i due derivati non si osserva questa interazione probabilmente a causa della loro incapacità di dissolversi e attraversare il mezzo acquoso; Dai dati relativi alle cinetiche di trasferimento si può osservare che tutti e tre i composti sono capaci di migrare dagli MLV contenenti lo stilbene a quelli di DMPC pura. Il resveratrolo completa il trasferimento dopo solo 4 ore di incubazione, quindi molto velocemente, i suoi due derivati anche dopo 24 ore non lo completano del tutto; In accordo con i dati calorimetrici, anche quelli di Langmuir-Blodgett indicano che questi composti hanno un effetto fluidificante su monolayer fosfolipidici.

31 IDROGEL DI INULINA 31 INULINAINULINA Polisaccaride naturale trovato in vari vegetali Appartiene ai glucofruttani È costituita da molecole di fruttosio legate in β 2-1 Può contenere una molecola di glucosio ad una estremità della catena Non tossica, biocompatibile, solubile in acqua, biodegradabile e poco costosa GLI IDROGELI Sistemi che assorbono una grande quantità di acqua senza passare in soluzione o perdere lintegrità strutturale Formati da polimeri idrofili ramificati covalentemente, ma anche mediante legami idrogeno, legami ionici o Forze di Van der Waals Bassa tossicità, buona biocompatibilità Dispersi in mezzo acquoso rilasciano i soluti in essi contenuti Adatti per sistemi di rilascio prolungato e/o controllato o in un sito specifico

32 32 Derivatizzazione dellinulina (INU) con anidride metacrilica (MA) Ramificazione fotochimica (Photocrosslinking) del derivato con irradiazione UV Derivatizzazione con anidride succinica (SA) LINU-MA ottenuto presenta: Buona capacità di swelling Bassa resistenza allidrolisi acida La presenza di gruppi carbossilici determina: Ridotto swelling nel mezzo acido Resistenza ai fluidi gastrici

33 33 Lidrogel di INU-MA-SA Potrebbe essere adatto per il rilascio di farmaci nel tratto intestinale Potrebbe permettere una minore degradazione dei farmaci sensibili al pH acido gastrico Potrebbe ridurre gli effetti collaterali sulla mucosa gastrica (ad es. per gli NSAID) Lidrogel è stato caricato con un farmaco modello diflunisal È un derivato dellacido salicilico Poco solubile in acqua Analgesico, antinfiammatorio Effetti collaterali gastrointestinali (emorragie, ulcerazioni)

34 34 Esperimenti effettuati Studi di swelling Studi di swelling Studi di degradazione chimica Studi di degradazione chimica Studi di degradazione enzimatica Studi di degradazione enzimatica Interazione LUV/diflunisal Interazione LUV/diflunisal Cinetiche di rilascio: Cinetiche di rilascio: eseguite con idrogeli caricati con diverse quantità di farmaco e a pH 7,4 e 4,0

35 35 mezzo STUDI DI SWELLING q = Ws/Wd Ws = peso idrogel rigonfiato Wd = peso idrogel secco Degradazione chimica ll saggio quantitativo del fruttosio, liberato dalla degradazione enzimatica con inulinasi dellidrogel INU-MA-SA, effettuato usando il metodo colorimetrico dellantrone ha evidenziato una degradazione dellidrogel del 53 ± 3% in peso rispetto al campione iniziale. Degradazione enzimatica

36 Dati calorimetrici pH 7,4 Notevole decremento della temperatura di transizione, proporzionale allaumento della frazione molare A pH 4,0 il diflunisal causa la scomparsa del picco di pretransizione, l allargamento e lo spostamento a temperature più basse del picco di transizione variazioni minori rispetto a quelle a pH 7,4

37 Curve calorimetriche di LUV di DMPC in contatto con lidrogel di INU-MA-SA a tempi di incubazione crescenti pH 7,4 Curve calorimetriche di LUV di DMPC in contatto con diflunisal (frazione molare 0,09) a tempi di incubazione crescenti

38 pH 7,4 pH 4,0 Lidrogel di INU-MA-SA non è degradato chimicamente Subisce degradazione enzimatica da parte della β-fruttosidasi inulinasi Il rilascio del diflunisal dallidrogel di INU-MA-SA è influenzato dal grado di loading Il rilascio del diflunisal dallidrogel di INU-MA-SA è influenzato dal pH del mezzo. Infatti, a pH 7,4 la velocità di rilascio e la quantità rilasciata sono maggiori Lidrogel di INU-MA-SA risulta un buon carrier per il rilascio di farmaci al colon CONCLUSIONI

39 39 Terpeni, derivati dellorigano I terpeni, sono componenti degli oli essenziali delle piante che presentano attività antimicrobica su: batteri Gram-positivi batteri Gram-negativi Tale attività sembrerebbe dovuta, almeno in parte, alla loro capacità di penetrare la membrana cellulare dei batteri, che dipende dalle loro caratteristiche strutturali ma soprattutto dalle loro proprietà lipofile. Le proprietà antimicrobiche e antiossidanti degli oli essenziali sono ormai note da lungo tempo e sono stati condotti numerosi studi per indagare sulla loro attività antimicrobica impiegando diversi tipi di batteri, virus e funghi.

40 40 Terpeni, derivati dellorigano OH OH p-Cimene Timolo Carvacrolo Terpinene

41 41 Studi condotti: 1. Calorimetria a Scansione Differenziale (DSC) Interazione con modelli di biomembrana Cinetiche di contatto Cinetiche di trasferimento 2. Langmuir Blodgett (LB) Isoterme a 10°C Isoterme a 37°C 3. Studi microbiologici Minima concentrazione inibente (MIC) Terpeni, derivati dellorigano

42 42 Cinetiche di contatto MLVStudi di interazione Cinetiche di contatto LUVCinetiche di trasferimento MLV

43 43 Timolo -Terpinene p-CimeneCarvacrolo Esperimenti a 10°C

44 44 p-Cimene -Terpinene Timolo Carvacrolo Esperimenti a 37°C

45 45 TERPENEMIC (mg/ml) S.aureus ATCC 6538P E.coli ATCC CARVACROLO1.25 ( )2.50 TIMOLO ( ) P-CIMENE TERPINENE 2.50 ( )5.0 ( ) Attività antimicrobica

46 46 CONCLUSIONI I dati di calorimetria permettono di evidenziare che i quattro composti studiati interagiscono con le membrane modello costituite da liposomi di DMPC causandone una destabilizzazione; I dati ottenuti permettono di classificare i composti in due gruppi: il timolo e il carvacrolo, che per la presenza della funzione fenolica, interagiscono con le membrane in quasi uguale misura, ma con effetti più marcati rispetto al p- cimene e il γ-terpinene; Gli esperimenti di cinetiche di contatto terpeni-MLV rivelano che i quattro composti sono in grado di attraversare lo strato acquoso, raggiungere la superficie degli MLV ed interagire con questi. Nel tempo tutti e quattro i terpeni tendono a raggiungere la massima interazione possibile, ma la cinetica di interazione è più lenta nel caso del γ-terpinene e del p-cimene, più veloce nel caso del timolo e soprattutto del carvacrolo;

47 47 Gli esperimenti di cinetiche di contatto terpeni-LUV mostrano che i terpeni attraversano lo strato acquoso, raggiungono la superficie dei LUV interagendo con essi. Il confronto tra gli esperimenti di cinetica di contatto condotti con gli MLV e con i LUV mostrano che tutti i terpeni interagiscono più velocemente con i LUV probabilmente per la maggiore superficie che questi espongono; Le cinetiche di trasferimento indicano che i terpeni sono capaci di migrare dagli MLV carichi a quelli scarichi. Il -terpinene il p-cimene sono più veloci a trasferirsi dagli MLV carichi a quelli scarichi rispetto al timolo e al carvacrolo; I risultati degli esperimenti con la tecnica di Langmuir-Blodgett sono in accordo con i dati calorimetrici. Tutti e quattro i terpeni hanno un effetto espansore sul monolayer di DMPC. Tale effetto è più evidente per il carvacrolo e il timolo; Dai risultati ottenuti dalle prove dattività antimicrobica è emerso che tutti e quattro i terpeni, anche se in misura diversa, sono capaci di impedire la crescita batterica sia di Escherichia coli che di Staphylococcus aureus. CONCLUSIONI

48 Assorbimento del -sitosterolo mediato da -ciclodestrine I fitosteroli sono sostanze che si trovano naturalmente nelle piante, sono le controparti del colesterolo nei prodotti animali. I fitosteroli sono presenti in una dieta normale, in particolare b-sitosterolo, campesterolo and stigmasterolo presenti in maggior quantità in molte fonti, e sono assorbiti proporzionalmente al colesterolo ma in misura minore. Linteresse allo studio dei fitosteroli è dovuto inizialmente al loro effetto nel ridurre lassorbimento del colesterolo introdotto con la dieta proteggendo quindi da malattie cardiovascolari sitosterolo

49 Insieme a vitamine liposolubili e carotenoidi, i fitosteroli sono costituenti alimentari vegetali altamente lipofili; inoltre, similarmente al colesterolo, i fitosteroli, possiedono sostituzioni in posizione C-24 responsabili del loro scarso assorbimento. Infatti è stato suggerito che negli esseri umani e altri mammiferi approssimativamente solo il 5% degli steroli ingeriti sono assorbiti. Per questo motivo molte preparazioni sono state formulate in maniera specifica per aumentare la solubilità in acqua e la biodisponibilità dei fitosteroli. 49 CICLODESTRINE

50 50 Tecniche impiegate: Calorimetria a Scansione Differenziale (DSC): Interazione con modelli di biomembrana Cinetiche di contatto

51 51 Frazione molare

52 52 Tempo (ore)

53 Quindi concludendo possiamo confermare che il -sitosterolo di per sè è molto idrofobo e quindi incapace di attraversare il mezzo acquoso, interagendo molto poco con il bilayer lipidico. Ciò è ben coerente con la ben nota scarsa disponibilità del -sitosterolo se introdotto per via orale. Inoltre la presenza di adeguate concentrazioni di -CDs possono migliorare linterazione MLV/ -sitosterolo. Infatti il -sitosterolo incapsulato in -CDs è reso più disponibile a diffondere nel mezzo acquoso e a raggiungere la superficie degli MLV, consentendo quindi una sua permeazione attraverso le biomembrane (modelli che mimano lassorbimento cellulare). Alte concentrazioni di -CDs invece causano una variazione del comportamento termotripico della DMPC con un incremento della T m. Lincremento della T m della DMPC causato dallinterazione con -CDs è stato già riportato da alcuni ricercatori che studiarono leffetto degli zuccheri sulle membrane fosfolipidiche. 53 CONCLUSIONI

54 I nostri risultati sono in accordo con i dati in letteratura considerando che laumento della temperatura della transizione di fase gel-cristallo liquido è dovuto alleffetto stabalizzante dei carboidrati sul doppio strato fosfolipidico attraverso la formazione di legami idrogeno più probabile alla testa del gruppo fosfato. Inoltre è stato anche dimostrato che alte concentrazioni di CDs possono catalizzare il non assorbimento dal monolayer e bilayer delle membrane, ostacolando quindi le nostre condizioni sperimentali e quindi anche linterazione del sistosterolo con i fosfolipidi. Pertanto la scelta di un opportune rapporto molare -sitosterolo/ -CDs potrebbe essere importante per evitare modifiche al modello di biomembrana dato da eccessive concentrazioni di -CD. 54 CONCLUSIONI

55 Prodrug Gemcitabina-Squalene 55 Antimetabolita pirimidinico derivato dal nucleoside naturale deossicitidina. Presenta caratteristiche strutturali e metaboliche simili alla Citarabina (Ara-C). Ampio spettro dazione sia nei tumori murini che nei tumori eterotrapiantati. Gemcitabina (2,2-difluoro-deossicitidina)

56 56 Come lAra-C nella forma trifosfato è in grado di bloccare la sintesi del DNA. Una volta incorporato nel DNA in costruzione è in grado di legare un ulteriore nucleotide naturale che nasconde il farmaco agli enzimi di riparazione: le esonucleasi. Presenta inoltre un particolare meccanismo di autopotenziamento dellattività citotossica (inibizione enzima inattivatore ad alte concentrazioni intracellulari). Meccanismo dazione Incorporazione del farmaco in liposomi a lunga emivita (approccio tecnologico) Sintesi di pro-drugs della Gemcitabina: Aumento della lipofilia del farmaco Protezione chimica del gruppo amminico in posizione N4 della citosina (che viene velocemente metabolizzato nel plasma) Incremento della stabilità metabolica della Gemcitabina

57 57 GEM-SQUALENE Studi condotti: 1. Calorimetria a Scansione Differenziale (DSC) Interazione con modelli di biomembrana Cinetiche di contatto Cinetiche di trasferimento 2. Langmuir Blodgett (LB) Isoterme a 10°C Isoterme a 37°C

58 Risultati DSC t inf Tempo (ore) T/T° m x 1000 Squalene squalCOOH gemcitabina Gem-squalene Interazione Cinetica di contatto Cinetica di trasferimento

59 59 Gemcitabina 10°C 37°C 10°C 37°C Squalene Risultati LB

60 60 Squalene acido 10°C 37°C Gem-Squalene 10°C 37°C

61 61 CONCLUSIONI Gli studi effettuati mediante Calorimetria a Scansione Differenziale e le misure eseguite mediante il metodo del film-balance (tecnica di Langmuir-Blodgett, LB) hanno dimostrato che: a) la Gemcitabina e lo Squalene hanno uno scarsissimo effetto sul comportamento termotropico delle membrane modello dovuto, nel caso della gemcitabina, alla sua localizzazione negli strati acquosi fra i doppi strati fosfolipidici e, nel caso dello Squalene alla sua insolubilità nellambiente idrofobo delle catene aciliche dei fosfolipidi; al contrario lo Squalene-acido, grazie alla presenza del gruppo carbossilico determina una forte destabilizzazione del doppio strato lipidico. b) la Gemcitabina per il suo carattere idrofilo è capace di attraversare la strato acquoso ma non è in grado di penetrare nel doppio strato lipidico; lo squalene sia per la sua incapacità di attraversare lo strato acquoso sia per la sua insolubilità nel doppio strato lipidico non è in grado di avere effetti sul comportamento termotropico degli MLV di DMPC; sia lo Squalene-acido che lo Gem-squalene si sono dimostrati incapaci di raggiungere la membrana liposomiale ed interagire con essa, probabilmente a causa della loro elevata lipofilicità che non consente di diffondere in un mezzo idrofilo.

62 62 CONCLUSIONI c) La Gemcitabina non è capace di trasferirsi dagli MLV carichi a quelli vuoti. Lo Squalene non ha alcun effetto sul comportamento termotropico degli MLV a conferma della sua insolubilità nel doppio strato lipidico; il sistema liposomiale favorisce il rilascio sia dello Squalene-acido che dello Gem-squalene e il loro successivo assorbimento da parte della membrana modello; la cinetica di rilascio dello Squalene- acido e dello Gem-squalene è graduale e lenta nel tempo. d) la tecnica di Langmuir-Blodgett ha permesso di avvalorare i risultati ottenuti mediante DSC evidenziando il diverso effetto dei composti esaminati sul monostrato di DMPC. In conclusione il confronto di tutti i risultati ottenuti hanno dimostrano limportanza del prodrug Gem-squalene nel consentire: una migliore interazione con le membrane biologiche del prodrug rispetto alla Gemcitabina libera; un rilascio del prodrug controllato e graduale nel tempo rispetto alla Gemcitabina libera.

63 63 LIPOPEPTIDI m porzione peptidica un residuo aminoacidico una catena lipidica (satura o insatura) * H HN O n Lys-Ala-Val-Tyr-Asn-Phe-Ala-Thr-Met-NH 2

64 64 La coniugazione tra queste due porzioni comporta: Aumento dela lipofilia del peptide Aumento della resistenza del peptide alla degradazione enzimatica Maggiore permeabilità attraverso le membrane biologiche Aumento immunogenicità Solubilità in acqua drasticamente ridotta

65 65 Curve DSC

66 66 Frazione molare Risultati

67 CONCLUSIONI Il peptide puro mostra un interazione molto bassa con il bilayer di DMPC, mentre la coniugazione del peptide ai lipoaminoacidi migliora la loro capacità di interagire con i modelli di biomembrana. Linterazione dipende fortemente dalla lunghezza delle catene e dal numero, in quanto al loro incremento ne consegue un decremento della cooperatività della transizione di fase e linduzione di un disordine nel doppio strato lipidico. Inoltre la coniugazione dei lipoaminoacidi ad LCMV potrebbe far si che il peptide sia più efficientememte trasportato attraverso il sistema liposomiale. 67

68 Prodrug squalenici dellAciclovir 68 LAciclovir (ACV), è un analogo nucleosidico purinico di sintesi, derivato dalla deossiguanidina, è un principio attivo con potente attività antivirale contro lHerpes Simplex Virus di tipo 1 (HSV-1), di tipo 2 (HSV-2), lHerpes Zoster, il virus di Epstein Barr (EBV) ed il Citomegalovirus

69 69 N N H N N O NH 2 O SqualeneCOOH DMAP, DMF anidra N 2, 70°C + EDC - + H + H + Aciclovir Aciclovir-Squalene COOH N N NH O O N N NH N N NH N N H N N O NH 2 OH O O O

70 70 Tecniche impiegate: Calorimetria a Scansione Differenziale (DSC) Interazione con modelli di biomembrana Cinetiche di contatto Cinetiche di trasferimento 2. Langmuir Blodgett (LB) Isoterme a 10°C Isoterme a 37°C

71 71 AciclovirSqualene Squalene COOH Aciclovir-Squalene

72 72 AciclovirSqualene Squalene COOH Aciclovir-Squalene Aciclovir Aciclovir-Squalene Squalene COOH Squalene Cinetica di contattoCinetica di trasferimento RISULTATI

73 73 Isoterme a 10°C

74 74 Misure a 37°C

75 75 CONCLUSIONI LAciclovir e lo Squalene hanno uno scarsissimo effetto sul comportamento termotropico delle membrane modello; lo SqualeneCOOH determina una forte destabilizzazione del doppio strato lipidico. Nel caso dellAciclovir-Squalene, si osserva una forte destabilizzazione del doppio strato lipidico proporzionale alla quantità di prodrug. LAciclovir potrebbe essere capace di attraversare lo strato acquoso, ma non è in grado di penetrare nel doppio strato lipidico; gli altri tre composti si sono dimostrati incapaci di raggiungere la membrana liposomiale ed interagire con essa, probabilmente a causa della loro elevata lipofilicità che non consente di diffondere in un mezzo idrofilo. LAciclovir non è capace di trasferirsi dagli MLV pieni a quelli vuoti; lo Squalene non ha alcun effetto sul comportamento termotropico degli MLV a conferma della sua insolubilità nel doppio strato lipidico; il sistema liposomiale favorisce il rilascio sia dello SqualeneCOOH che dellACV-SQ e il loro successivo assorbimento da parte della biomembrana modello; la cinetica di rilascio dello SqualeneCOOH e dellAciclovir-Squalene è graduale e lenta nel tempo.

76 RILASCIO DI DEET E OTC DA SLN 76 Agli inizi degli anni 90, con lo sviluppo delle Nanoparticelle Solide Lipidiche (SLN), sono stati uniti i vantaggi di liposomi, emulsioni e particelle solide. Le SLN sono state ottenute semplicemente scambiando la fase lipidica liquida (olio) delle emulsioni con un lipide che si trova allo stato solido sia a temperatura ambiente che alla temperatura corporea. In base al tipo di SLN prodotte è possibile ottenere il rilascio modificato del principio attivo.

77 77 a) b) c) Le SLN agiscono, inoltre, come occlusivi, perciò possono essere usate per aumentare il contenuto in acqua della pelle. Grazie alle loro ridotte dimensioni possiedono proprietà adesive che consentono la formazione di un film sulla superficie della pelle. Ladesività è una caratteristica tipica delle particelle molto fini e consente la formazione di un film costituito da sfere densamente impaccate sulla superficie cutanea

78 78 SLN Scattering dei raggi UV + FILTRO SOLARE: OMC + REPELLENTE: DEET octyl methoxy cinnamate N,N–diethyl–m toluamide SLN/OMC-DEET ultrasuoni

79 79 RISULTATI Dinamic light scattering: diametro medio nm Elevata incorporazione di principi attivi DSC:

80 80 Studi di assorbimento percutaneo in vitro Valori di flusso del DEET e dellOMC allo steady-state dalle SLN e dallemulsione o/w. Sia lOMC che il DEET incorporati nelle SLN mostrano un flusso allo steady-state significativamente minore rispetto a quello riscontrato nellemulsione o/w contenente la stessa quantità di principi attivi. Conclusioni: si può ipotizzare che limpiego delle SLN come sistemi carrier per la veicolazione dellOMC e del DEET garantisce una maggiore permanenza dei composti sulla superficie della pelle, ovvero nel sito in cui devono svolgere la loro azione, riducendo, inoltre, la loro permeazione attraverso la pelle e di conseguenza i possibili effetti collaterali o tossici.

81 81 Erbicidi, derivati della Fenilurea Gli erbicidi sono sostanze chimiche che uccidono le piante e sono largamente usati per aumentare la resa e migliorare la qualità della produzione agricola; Generalmente essi esibiscono una tossicità nei mammiferi, alcuni di loro sono altamente tossici, mentre altri sono genotossici e alcuni sono cancerogeni in saggi in vivo; Gli erbicidi derivati della fenilurea sono principalmente assorbiti attraverso le radici e trasportati al sito dazione dove essi bloccano il trasporto di elettroni nella fotosintesi; La presenza degli erbicidi nel sottosuolo indica che molti di questi composti non sono biodegradabili e possono persistere per un lungo periodo nellambiente inquinandolo.

82 82 Erbicidi, derivati della Fenilurea

83 83 Tecniche impiegate: Calorimetria a Scansione Differenziale (DSC): Interazione con modelli di biomembrana Cinetiche di contatto Cinetiche di trasferimento Erbicidi, derivati della Fenilurea

84 84 tempo (ore) r ( T/T° m ) x 10 3 fenuron chlorotoluron metobromuron monolinuron chlorbromuron 02468r Studi di interazioneCinetiche di contatto MLV Cinetiche di contatto LUVCinetiche di trasferimento MLV

85 85 CONCLUSIONI Dai dati calorimetrici ottenuti è possibile concludere che: Tutti gli erbicidi causano un decremento nella temperatura di transizione ma in maniera diversa. Il maggior effetto è esibito dal clorbromuron, seguito da monolinuron e metobromuron, e poi da clorotoluron e fenuron con il più basso effetto; Per quanto riguarda la cinetica di contatto possiamo dire che fenuron e monolimuron riescono a dissolversi nel mezzo acquoso, raggiungere la superficie degli MLV e interagire con il bilayer fosfolipidico, probabilmente grazie alla loro elevata solubilità in acqua; Comparando i risultati ottenuti tra LUV ed MLV sembra che gli erbicidi interagiscano meglio con i primi, probabilmente grazie alla maggiore superficie di contatto che questi espongono; Dalle cinetiche di trasferimento è emerso che questi composti sono in grado di trasferirsi da MLV pieni a MLV vuoti, che ciò succede piuttosto velocemente e che lequilibrio di concentrazione è raggiunto in poche ore.

86 86 Sono derivati degli Idrocarburi Policiclici Aromatici (IPA), che contengono due o più anelli aromatici condensati; Sono presenti nellambiente in miscela con altri composti organici, sia liberi nellaria che adsorbiti a materiale particolato; I nitro-IPA sono prodotti diretti o indiretti di combustioni incomplete; Tali composti sono solo parzialmente degradati da microrganismi e possono persistere nellambiente. Nitro-Idrocarburi Policiclici Aromatici

87 87 Nitro-Idrocarburi Policiclici Aromatici 3-nitrofluoranthene2-nitrofluorene2,7-dinitrofluorene

88 88 Nitro-Idrocarburi Policiclici Aromatici Tecniche impiegate: Calorimetria a Scansione Differenziale (DSC) Interazione con modelli di biomembrana Cinetiche di contatto Cinetiche di trasferimento

89 89 2,7-dinitrofluorene 2-nitrofluorene 3-nitrofluorantene

90 90 Cinetica di contatto Cinetica di trasferimento CONCLUSIONI È stato trovato: (a) il seguente ordine di interazione: 3-nitrofluoranthene>2- nitrofluorene>2,7-dinitrofluorene; (b) uno scarso assorbimento dei nitro-IPA attraverso i modelli di biomembrana nel mezzo acquoso (c) mentre un forte assorbimento dei nitro-IPA attraverso i modelli biomemrana mediato dal mezzo lipofilo.

91 91 Diverse strategie, che sfruttano la coniugazione con i bisfosfonati, per lottenimento di trattamenti e sistemi terapeutici per la cura di osteoporosi, osteoartriti, cancro allosso, ed in generale di Osteotropic Drug Delivery System (ODDS), sono ampiamente descritte in letteratura; Lo scopo del lavoro è stato quello di formulare un carrier colloidale osso-affine per lincapsulazione ed il trasporto di un antitumorale come la doxorubicina per la cura delle metastasi ossee SINTESI E CARATTERIZZAZIONE DI CARRIERS COLLOIDALI OSTEOTROPICI PER IL TRASPORTO DI ANTITUMORALI AL TESSUTO OSSEO METASTATICO

92 92 1° Step: Sintesi e caratterizzazione del coniugato ammidico tra un polimero (PLA/PLGA) ed un bisfosfonato (Alendronato sodico)

93 93 C O n O C CH 3 C H O O C H 3 C H C O O C CH 3 C H O O C H 3 C H y * -[(C 6 H 8 O 4 ) x (C 4 H 4 O 4 ) y ] n - x * Sintesi 1 Attivazione del carbossile via EDAC Attivazione del carbossile via N-idrossisuccinimmide Sintesi 2 2° Step: coniugazione dellalendronato sodico al polimero attivato

94 94 3° Step: caratterizzazione del coniugato ammidico, 1 H-NMR

95 95 Resomer 502H PLA/PLGA-Ale 3° Step: caratterizzazione del coniugato ammidico, MALDI-TOF

96 96 3° Step: caratterizzazione del coniugato ammidico, DSC Curve DSC di PLGA (a), PLGA-ALE coniugato (b), PLGA/ALE miscela fisica (c) e alendronato sodico (d).

97 97 Test di emolisi: il Resomer 502H ed il coniugato polimerico non mostrano avere effetti emolitici; 4° Step: Test di biocompatibilità in vitro

98 Effetto del coniugato polimerico sulla fase plasmatica della coagulazione: alte concentrazioni di campione (10 -4 e M) inducono un decremento dellattività protrombinica (PT) ed un importante estensione del Tempo di Attivazione Parziale della Tromboplastina (APTT). Basse concentrazioni ( M) non hanno effetti sulla fase plasmatica di coagulazione. Il coniugato polimerico non determina importanti variazioni nella concentrazione di fibrinogeno rispetto al DMSO;

99 Neutral red test su cellule endoteliali: il coniugato polimerico alle diluizioni testate non ha effetti sulla vitalità delle cellule (Kruskal-Wallis test p= Neutral red test su osteoblasti: il coniugato polimerico alle diluizioni testate non ha effetti sulla vitalità degli osteoblasti (Kruskal- Wallis test p=0.9781).

100 100 5°Step: Preparazione e caratterizzazione delle nanoparticelle a partire dal coniugato ammidico Nanoparticelle del coniugato PLA/PLGA-Ale sono state preparate in accordo con il metodo della nanoprecipitazione usando la tecnica di evaporazione del solvente. Le nanoparticelle così ottenute sono state sterilizzate mediante due tecniche: filtrazione sterilizzante con filtri da 0,45 m sterilizzazione con raggi Dinamic Light Scattering

101 Size (nm) Intensity Np-PLA/PLGA-Ale DMSO/Acetone (1:1 v:v) Np-PLA/PLGA-AleKCpsZAvePolyFit 146,5182,20,1440, ,7179,80,1740, ,8183,001400,0003 Average46,0181,70,153 +/-0,51,70,019 Np-PLA/PLGA-AleKcpsMobZetaWidth 1891,1-2,920-36,56,0 2814,2-3,164-39,40,1 3730,6-3,283-40,80,1 Average812,0-3,122-38,96,0 +/-80,30,1852,20,1

102 102 6°Step: Incapsulazione delle nanoparticelle con Doxorubicina 7°Step: Valutazione del loading di Doxorubicina Le nanoparticelle fatte dal coniugato PLGA/Ale e Doxorubicina usando il metodo della nanoprecipitazione appaiono essere sferiche e mostrano una distribuzione omogenea e un basso indice di polidispersione. 60x 40X Efficienza di incapsulazione: 61%

103 103 8°Step: Saggio per laffinità allidrossiapatite (HA) di nanoparticelle di PLGA-ALE Sembra che laffinità aumenti con il tempo dincubazione ed è proporzionale alla concentrazione di idrossiapatite nella sospensione. In particolare mentre alla concentrazione di 1mg/ml di HA, i due tipi di nano particelle non mostrano nessuna evidente differenza in termini di riduzione di assorbanza di Oil red O e quindi di assorbimento allHA. Ad alte concentrazioni del sale (5 mg/mL) le nano particelle di PLGA-ALE rimangono legate allHA maggiormente che quelle di solo PLGA mostrando un 43 e un 50% di incremento di affinità rispettivamente dopo 15 e 30 min.

104 104 In questo lavoro lo scopo è stato quello di realizzare un carrier polimerico per il trasporto di farmaci al tessuto osseo malato, un coniugato tra il PLGA 50:50 e lamino bisfosfonato ALE, quindi questo è stato sintetizzato e caratterizzato. Da questo coniugato di partenza sono state preparate nano particelle dalle dimensioni comprese tra 200 e 300 nm con il classico metodo di evaporazione del solvente. Il PLGA-ALE non causa emolisi o alterazioni della fase plasmatica di coaugulazione in vitro o effetti citotossici su cellule endoteliali e osteoblasti trabecolari, quindi dimostrandosi un ottimo prodotto di partenza per il caricamento di farmaci come quello descritto. Conclusioni

105 105 RINGRAZIO… Prof. re Francesco Castelli Dott. ssa Maria Grazia Sarpietro Prof. re Rosario Pignatello Prof. re Gaetano Giammona Dott. re Nicola Baldini e la Dott.ssa Cenni Elisabetta (Istituto Rizzoli, Bologna) Dott. ssa Valentina Pantò & Co. TUTTO IL MIO LAB. …e voi tutti per la cortese attenzione!


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