Unione europea Università degli Studi di Catania

Presentazione sul tema: "Unione europea Università degli Studi di Catania"— Transcript della presentazione:

1 Unione europea Università degli Studi di Catania Ministero dell’Università e della Ricerca Scientifica e Tecnologica Università degli studi di Palermo Dottorato in “Tecnologie delle Sostanze Biologicamente Attive” XX Ciclo A.A.2005/06 Dipartimento di Scienze Chimiche, Università di Catania, V.le A. Doria, 6, Catania “TECNICHE TERMOANALITICHE APPLICATE ALLO STUDIO DI COMPOSTI E SISTEMI COLLOIDALI BIOLOGICAMENTE ATTIVI” Dott.ssa Dorotea Micieli Tutor:             Chiar.mo Prof. Francesco Castelli Coordinatore: Chiar.mo Prof. Gaetano Giammona

2 ARTICOLAZIONE DELLA RICERCA:
1. Studi cinetici e d’interazione con modelli di biomembrane: Sitosterolo e b-Ciclodestrine; Castelli F, Sarpietro MG, Micieli D, Trombetta D, Saija A ; J.Agr.Food Chem. 2006; 54: Resveratrolo e suoi derivati; Sarpietro MG, Spatafora C, Tringali, Micieli D, Castelli F; J. Agric. Food Chem. 2007; 55: Terpeni, derivati dell’origano; Castelli F, Sarpietro MG, Micieli D, Trombetta D, Saija A, Bisignano G ; J. Agric. Food Chem : Gemcitabina e Aciclovir: suoi prodrugs squalenici; Castelli F, Sarpietro MG, Micieli D, Stella B, Rocco F, Cattel L. ; J. Coll. Interf. Sci ; 316:43-52 Castelli F., Sarpietro M.G., Micieli D., Ottimo S., Rocco F., Ceruti M.; 6th World Meeting on Pharmaceutics, Biopharmaceutics and Pharmaceutical Technology. Barcelona, Spain, 7-10 April 2008 Idrogel di Inulina: effetto del loading e del pH; Castelli F., M.G. Sarpietro, Micieli D., Ottimo S., Pitarresi G., Tripodo G., Carlici B., Giammona G. Eur J Pharm Eur J Pharm Sci ; 35(1-2):76-85 Prodrugs lipofilici del Naprossene; Castelli F., Sarpietro M.G., Micieli D., PantòV., Pignatello R.; 6th World Meeting on Pharmaceutics, Biopharmaceutics and Pharmaceutical Technology. Barcelona, Spain, 7-10 April 2008 Lipopeptidi immunogenici a diverso numero e lunghezza di catena; Sarpietro MG, Micieli D, Pignatello R, Liang MT, Toth I, Castelli F.; Termoch. Acta 2008; 471(1-2):14-19 SLN a base di DEET e OMC; Puglia C., Bonina F., Rizza L., Castelli F., Sarpietro M.G., Micieli D.; 6th World Meeting on Pharmaceutics, Biopharmaceutics and Pharmaceutical Technology. Barcelona, Spain, 7-10 April 2008 Inquinanti ambientali; Castelli F., Micieli D., Minniti Z., Sarpietro M.G Librando V., Chemosphere 2008; 73: Librando V, Sarpietro MG, Minniti Z, Micieli D, Castelli F; Environ Sci Technol. 2006; 40(7):2462-8 2. Sintesi e caratterizzazione di carriers colloidali osteotropici per il trasporto di antitumorali al tessuto osseo metastatico. Pignatello R, Cenni E, Micieli D, Fotia C, Salerno M, Granchi D, Sarpietro MG, Castelli F, Baldini N.; Nanomedicine 2009, 4: Cenni E, Granchi D, Avnet S, Fotia C, Salerno M, Micieli D, Sarpietro MG, Pignatello R, Castelli F, Baldini N.; Biomaterials 2008; 29:

3 Tecniche impiegate: 1.Calorimetria a Scansione Differenziale (DSC) Interazione con modelli di biomembrana Cinetiche di contatto Cinetiche di trasferimento 2.Langmuir Blodgett (LB) Isoterme a 10°C Isoterme a 37°C

4 Liposomi come modelli di biomembrana
I liposomi sono vescicole lipidiche preparate con fosfolipidi sia sintetici: dipalmitoilfosfatidilcolina, DPPC; dimiristoilfosfatidilcolina, DMPC; acido dimiristoilfosfatidico, DMPA; dilaurilfosfatidilcolina, DLPC; che naturali: fosfatidilcoline, PC; fosfatidilserine, PS; fosfatidilglicerolo, PG; etc. In particolare, utilizzando opportune miscele di questi fosfolipidi è possibile creare un sistema modello che riproduca la carica superficiale negativa delle membrane cellulari.

5 Le strutture vescicolari, cioè quelle sferoidali delimitate da uno o più doppi strati fosfolipidici, aventi un diametro compreso tra 20 nm e 20 m sono dette "liposomi". In queste strutture i fosfolipidi sono organizzati in modo tale da formare uno o più strati concentrici, detti lamelle, separati da uno o più strati acquosi (rispettivamente liposomi unilamellari e multilamellari). In base al metodo di preparazione si possono ottenere diversi tipi di liposomi, che possono essere così classificati: Multilamellar Vesicles (MLV); Large Unilamellar Vesicles (LUV); Small Unilamellar Vesicles (SUV).

6 Liposomi come drug delivery system
La natura anfifilica dei liposomi permette il loro uso come drug delivery system, dal momento che all’interno delle lamelle le sostanze si possono collocare in maniera differente in funzione della loro idrofilia, infatti: le sostanze idrosolubili sono intrappolate negli spazi acquosi tra le lamelle o nello spazio acquoso interno dei liposomi; le sostanze liposolubili trovano collocazione tra le catene idrofobiche degli acidi grassi; le sostanze anfotere si possono collocare con la parte idrofila all’esterno dei bilayer e con la parte idrofoba all’interno.

7 I fosfolipidi, quando idratati, presentano un liotropismo (esistenza di fasi differenti) in funzione della differente % di acqua presente e della temperatura di idratazione. Diagramma di fase del sistema 1,2-dipalmitoil-l-fosfatidilcolina/H2O

8 Al variare della temperatura si ottiene una transizione di fase gel-cristallo liquido, caratterizzata da una temperatura di transizione, Tm, e da una variazione d’entalpia, H. Questo processo può essere seguito mediante la tecnica della Calorimetria Differenziale a Scansione.

9 Calorimetria a Scansione Differenziale (DSC)
La Calorimetria a Scansione Differenziale è una tecnica che consente di determinare, durante una scansione effettuata con incrementi lineari della temperatura, la variazione d’entalpia di processo mediante misura del flusso di calore necessario per mantenere il campione della sostanza in esame alla stessa temperatura di un campione di riferimento (inerte). La tecnica consente, altresì, di eseguire misure di capacità termica, d'emissività termica e di purezza di campioni solidi; inoltre essa consente lo studio di equilibri di fase e della cinetica dei processi.

10 In generale composti lipofili posti a contatto con liposomi tendono a collocarsi tra le catene alifatiche o tra gli strati dei bilayers lipidici, mentre, composti che possiedono natura anfipatica, posti a contatto con i liposomi (ad una temperatura al di sopra di quella di transizione), tendono a penetrare il bilayer lipidico (processo rapido) e migrare verso gli strati più interni (processo più lento). Questa penetrazione è causata dall’interazione tra la parte polare del farmaco e le teste polari dei lipidi, e tra la parte apolare del farmaco e le catene alifatiche, causando una modificazione della struttura del bilayer lipidico che si riflette in variazioni dei Tm e H.

11 Langmuir-Blodgett Il monolayer è un sistema bidimensionale, generalmente studiato con il metodo del film-balance di Langmuir-Adam, che in seguito a variazioni di pressione superficiale, area e temperatura, fornisce utili informazioni sulla distribuzione e sull’orientazione molecolare. Esso costituisce un valido strumento per lo studio dell’organizzazione dei fosfolipidi di membrana. L’uso dei monolayer, come modello di membrana, deriva dal fatto che esso rappresenta la metà di un doppio strato lipidico (bilayer) e che possiede caratteristiche direttamente legate alle proprietà di quest’ultimo apparentemente più simile alle membrane naturali. KSV LangmuirMinitrough ( KSV, instruments Ltd., Finland)

12 Formazione del Film Sostanze anfifiliche sono disciolte in un solvente insolubile in acqua, volatile (cloroformio, esano, etc.) Sono posizionate con una microsiringa su una superficie liquida, la soluzione diffonde rapidamente coprendo tutta l’area disponibile Il solvente evapora e si foma il monolayer Se l’area disponibile per la deposizione è grande le molecole sono molto distanziate (il monolayer è considerato un gas bidimensionale).

13 DEPOSIZIONE Curva isoterma Tensione superficiale/Area per molecola
Area effettiva per molecola a vari gradi di compressione del monolayer. a) stato gassoso; b) stato di liquido espanso; c) stato di liquido condensato; d) collasso del film fosfolipidico.

14 Parametri fondamentali alla base del processo sono:
Tipo di molecole adoperate Pressione superficiale Tensione superficiale P=g-g0 g=tensione superficiale in assenza di monolayer g0=tensione superficcilae in presenza di momolayer Per quanto riguarda la tensione superficiale sappiamo che le molecole hanno un grado di attrazione (coesione) le une con le altre che dipende dalle proprietà della sostanza. Quello che si ha è una situazione di non equilibrio di forze all’interfaccia acqua/aria, sviluppando un’energia libera superficiale, mentre una situazione di equilibrio nel bulk in cui si sviluppano forze attrattive in tutte le direzioni. L’energia di coesione può essere quantificata anche come una Forza/Lunghezza [mN/m]: tensione superficiale. L’aria è il mezzo più idrofobico, l’acqua è quello più idrofilico e polare: la loro interfaccia ha un’elevata tensione superfiaciale. Le molecole adoperate sono costituite da due parti differenti: una parte idrofoba e una idrofila. La loro natura anfifilica gli conferisce la tendenza a disporsi autonomamente su una superficie, la parte polare posta a contatto con la soluzione acquosa e le code idrofobiche esposte all’aria. Affinchè si formi un monolayer è necessario che la coda idrofobica abbia una certa lunghezza (CH2)n n>12. se troppo corta si formano delle micelle che sono solubili in acqua. Per quanto riguarda la pressione superficiale le molecole anfifiliche vengono posizionate in superficie e forzate ad avvicinarsi. È misurata attraverso il metodo di Wilhelmy. Una lastrina di platino è montata su una elettrobilancia: si misura la forza (dovuta alla tensione superficiale) sulla piastrina sospesa e parzialmente immersa nella sottofase; la forza è convertita in tensione superficiale (mN/m) con le dimensioni della piastra. Π è data misurando la variazione della F tra la superficie liquida senza e quella con il monostrato flottante. Questa F a sua volta dipende dalla gravità dalla tensione superficiale e dalla spinta idrostatica dell’acqua.

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16 X1 AP Tutte le molecole depositate restano sulla superficie acquosa, quindi si può ricavare direttamente il numero di molecole per unità di area di superficie, numero che può essere fatto aumentare eseguendo una riduzione dell’area a disposizione. Applicando al monolayer compressioni maggiori, è modificata la distribuzione superficiale delle molecole, forzandole a passare da uno stato a bassa densità “gassoso” o di “liquido espanso”, ad uno stato a maggiore densità, detto “liquido condensato”, e successivamente ad uno stato di “solido condensato”. Ulteriori diminuzioni dell’area effettiva per molecola, in seguito a maggiori compressioni del monolayer, risultano in un collasso del film. Fino al punto di collasso, le molecole fosfolipidiche sono stabilizzate da interazioni fra i gruppi metilenici delle catene idrofobiche e da interazioni elettrostatiche nelle zone dei gruppi polari. Al punto di collasso le repulsioni molecolari vincono sulle forze attrattive, creando una situazione energeticamente sfavorevole che porta i fosfolipidi ad uscire dal piano del monolayer ed a formare multilayer ed isole. In letteratura, sono riportati molti studi sulle curve ottenute correlando l’area media per molecola (Å2) con la frazione molare (X) del composto in esame, che forniscono informazioni sull’impaccamento molecolare, sulla miscibilità, e sulle interazioni tra le molecole componenti monolayer misti Riportando su un grafico A / X1 (fig. 13) si ottiene una retta se i due componenti del monolayer sono completamente immiscibili o possiedono una miscibilità ideale. Qualunque deviazione da questa relazione lineare indica interazione tra le molecole, cioè una miscibilità non ideale.

17 Naprossene e suoi derivati lipoamminoacidici
Intensa attività antinfiammatoria Moderata attività antipiretica Antidolorifico Antiaggregante piastrinico FANS [acido (S)-(+)-6-metossi-α-metil-2-naftalen acetico] 17

18 La Demenza di Alzheimer (AD)
Descritta per la prima volta nel 1907 dal neurologo tedesco Aloïs Alzheimer, è la più frequente causa di demenza nei paesi occidentali. Reazioni infiammatorie croniche, alti livelli di colesterolo, stress ossidativo sembrano essere importanti agenti promotori dei cambiamenti neurodegenerativi comunemente riscontrati nei pazienti affetti da AD. ANALISI POST MORTEM DI PAZIENTI AFFETTI DA AD Grovigli neurofibrillari intracellulari (NFT tangles) Proteina β–amiloide (Aβ), ruolo centrale nella patogenesi dell’AD Mediatori dell’infiammazione intorno alle placche amiloidi nel cervello Effetto neuroprotettivo dei FANS 18

19 Membrane like-character Lipofilia Anfifilicità
ATTRAVERSAMENTO BEE Membrane like-character Lipofilia Anfifilicità PRODRUG Nap-EDA-LAA10 Nap-EDA-LAA14 19

20 Calorimetria a Scansione Differenziale (DSC)
Tecniche impiegate: Calorimetria a Scansione Differenziale (DSC) Interazione con modelli di biomembrana Cinetiche di contatto Cinetiche di trasferimento 2. Langmuir Blodgett (LB) Isoterme a 10°C Isoterme a 37°C 20

21 Naprossene Nap-EDA-LAA 10 Nap-EDA-LAA 14 21

22 Cinetica di trasferimento
Cinetica di contatto 22

23 Naprossene Nap-EDA-LAA 10 Nap-EDA-LAA 14 23

24 In conclusione: La coniugazione del Naprossene ai lipoamminoacidi migliora la sua interazione con i modelli di biomembrana: la porzione LAA potrebbe localizzarsi tra le catene fosfolipidiche con la parte del farmaco che protrude nel mezzo acquoso. L’entità dell’interazione dipende dalla lunghezza della catena alchilica del lipoamminoacido. La porzione lipoaminoacidica aiuta il prodrug a essere gradualmente rilasciato dal carrier liposomiale ai modelli di biomembrana. 24

25 Resveratrolo e suoi derivati
Il Resveratrolo è una sostanza fitochimica naturale presente in oltre 70 specie di piante, nell’uva e arachidi Esiste in due forme, cis e trans, la forma trans, maggiormente presente nel vino, sembra essere quella più attiva biologicamente Appartiene ad una classe di fitochimici nota come stilbeni Esso è noto, ed intensamente studiato per le svariate proprietà biologiche ad esso attribuite tra cui: attività antiossidante inibizione della cicloossigenasi inibizione dell’aggregazione piastrinica attività antiestrogenica Il resveratrolo ed altri stilbenoidi ad esso correlati sono stati considerati per la loro abilità di agire come radical scavenger, di prevenire la perossidazione lipidica, di avere attività chemio-protettive nelle malattie degenerative umane come l’aterosclerosi ed il cancro.

26 Resveratrolo e suoi derivati
H3CO O CH3 OCH3 Metilazione chimica HO O H 3,5,4’-trimetilresveratrolo OCOCH3 H3COCO trans-Resveratrolo Acilazione chimica 3,5,4’-acetilresveratrolo

27 Resveratrolo e suoi derivati
Tecniche impiegate: Calorimetria a Scansione Differenziale (DSC) Interazione con modelli di biomembrana Cinetiche di contatto Cinetiche di trasferimento 2. Langmuir Blodgett (LB) Isoterme a 10°C Isoterme a 37°C

28 Resveratrolo e suoi derivati
DSC 0,05 0,1 0,15 0,2 -30 -25 -20 -15 -10 -5 Frazione molare ( D T/T° m ) x 10 3 Resveratrolo Trimetilresveratrolo Triacetilresveratrolo Resveratrolo v.c. Trimetilresveratrolo v.c. Triacetilresveratrolo v.c. 5 10 15 20 25 t inf -25 -20 -15 -10 -5 tempo (ore) ( D T/T° m ) x 10 3 Resveratrolo Trimetilresveratrolo Triacetilresveratrolo 5 10 15 20 25 t inf -25 -20 -15 -10 -5 tempo (ore) ( D T/T° m ) x 10 3 Resveratrolo Trimetilresveratrolo Triacetilresveratrolo

29 LB ESPERIMENTI A 10°C ESPERIMENTI A 37°C Resveratrolo
TrimetilResveratrolo TriacetilResveratrolo ESPERIMENTI A 37°C Resveratrolo TrimetilResveratrolo TriacetilResveratrolo

30 CONCLUSIONI Esaminando i risultati ottenuti si evince che:
Il resveratrolo e il trimetil-derivato sono capaci di fluidificare i modelli di membrana di DMPC in dipendenza della loro concentrazione, modificando quindi la transizione di fase del lipide usato. Il triacetilresveratrolo, invece, provoca un piccolo aumento della fluidità di membrana; Per quanto riguarda le cinetiche di contatto i risultati ottenuti dimostrano che solo il resveratrolo è capace di attraversare il mezzo acquoso e interagire con i doppi strati lipidici degli MLV. Per i due derivati non si osserva questa interazione probabilmente a causa della loro incapacità di dissolversi e attraversare il mezzo acquoso; Dai dati relativi alle cinetiche di trasferimento si può osservare che tutti e tre i composti sono capaci di migrare dagli MLV contenenti lo stilbene a quelli di DMPC pura. Il resveratrolo completa il trasferimento dopo solo 4 ore di incubazione, quindi molto velocemente, i suoi due derivati anche dopo 24 ore non lo completano del tutto; In accordo con i dati calorimetrici, anche quelli di Langmuir-Blodgett indicano che questi composti hanno un effetto fluidificante su monolayer fosfolipidici.

31 IDROGEL DI INULINA GLI IDROGELI
Polisaccaride naturale trovato in vari vegetali Appartiene ai glucofruttani È costituita da molecole di fruttosio legate in β 2-1 Può contenere una molecola di glucosio ad una estremità della catena Non tossica, biocompatibile, solubile in acqua, biodegradabile e poco costosa I N U L A GLI IDROGELI Sistemi che assorbono una grande quantità di acqua senza passare in soluzione o perdere l’integrità strutturale Formati da polimeri idrofili ramificati covalentemente, ma anche mediante legami idrogeno, legami ionici o Forze di Van der Waals Bassa tossicità, buona biocompatibilità Dispersi in mezzo acquoso rilasciano i soluti in essi contenuti Adatti per sistemi di rilascio prolungato e/o controllato o in un sito specifico 31

32 L’INU-MA ottenuto presenta: Buona capacità di swelling
Derivatizzazione dell’inulina (INU) con anidride metacrilica (MA) Ramificazione fotochimica (Photocrosslinking) del derivato con irradiazione UV L’INU-MA ottenuto presenta: Buona capacità di swelling Bassa resistenza all’idrolisi acida La presenza di gruppi carbossilici determina: Ridotto swelling nel mezzo acido Resistenza ai fluidi gastrici Derivatizzazione con anidride succinica (SA) 32

33 L’idrogel di INU-MA-SA
Potrebbe essere adatto per il rilascio di farmaci nel tratto intestinale Potrebbe permettere una minore degradazione dei farmaci sensibili al pH acido gastrico Potrebbe ridurre gli effetti collaterali sulla mucosa gastrica (ad es. per gli NSAID) L’idrogel è stato caricato con un farmaco modello È un derivato dell’acido salicilico Poco solubile in acqua Analgesico, antinfiammatorio Effetti collaterali gastrointestinali (emorragie, ulcerazioni) diflunisal 33

34 Esperimenti effettuati
Studi di swelling Studi di degradazione chimica Studi di degradazione enzimatica Interazione LUV/diflunisal Cinetiche di rilascio: eseguite con idrogeli caricati con diverse quantità di farmaco e a pH 7,4 e 4,0 34

35 Degradazione enzimatica
STUDI DI SWELLING Degradazione enzimatica mezzo ll saggio quantitativo del fruttosio, liberato dalla degradazione enzimatica con inulinasi dell’idrogel INU-MA-SA, effettuato usando il metodo colorimetrico dell’antrone ha evidenziato una degradazione dell’idrogel del 53 ± 3% in peso rispetto al campione iniziale. Degradazione chimica q = Ws/Wd Ws = peso idrogel rigonfiato Wd = peso idrogel secco 35

36 Dati calorimetrici A pH 4,0 il diflunisal causa la scomparsa del picco di pretransizione, l’ allargamento e lo spostamento a temperature più basse del picco di transizione variazioni minori rispetto a quelle a pH 7,4 pH 7,4 Notevole decremento della temperatura di transizione, proporzionale all’aumento della frazione molare

37 pH 7,4 pH 7,4 Curve calorimetriche di LUV di DMPC in contatto con l’idrogel di INU-MA-SA a tempi di incubazione crescenti Curve calorimetriche di LUV di DMPC in contatto con diflunisal (frazione molare 0,09) a tempi di incubazione crescenti

38 pH 7,4 pH 4,0 CONCLUSIONI L’idrogel di INU-MA-SA non è degradato chimicamente Subisce degradazione enzimatica da parte della β-fruttosidasi inulinasi Il rilascio del diflunisal dall’idrogel di INU-MA-SA è influenzato dal grado di loading Il rilascio del diflunisal dall’idrogel di INU-MA-SA è influenzato dal pH del mezzo. Infatti, a pH 7,4 la velocità di rilascio e la quantità rilasciata sono maggiori L’idrogel di INU-MA-SA risulta un buon carrier per il rilascio di farmaci al colon

39 Terpeni, derivati dell’origano
I terpeni, sono componenti degli oli essenziali delle piante che presentano attività antimicrobica su: batteri Gram-positivi batteri Gram-negativi Tale attività sembrerebbe dovuta, almeno in parte, alla loro capacità di penetrare la membrana cellulare dei batteri, che dipende dalle loro caratteristiche strutturali ma soprattutto dalle loro proprietà lipofile. Le proprietà antimicrobiche e antiossidanti degli oli essenziali sono ormai note da lungo tempo e sono stati condotti numerosi studi per indagare sulla loro attività antimicrobica impiegando diversi tipi di batteri, virus e funghi.

40 Terpeni, derivati dell’origano
H p-Cimene Timolo Carvacrolo g- Terpinene

41 Terpeni, derivati dell’origano
Studi condotti: Calorimetria a Scansione Differenziale (DSC) Interazione con modelli di biomembrana Cinetiche di contatto Cinetiche di trasferimento 2. Langmuir Blodgett (LB) Isoterme a 10°C Isoterme a 37°C 3. Studi microbiologici Minima concentrazione inibente (MIC)

42 Cinetiche di contatto MLV
Studi di interazione Cinetiche di contatto MLV 5 10 15 20 25 t inf -15 -10 -5 tempo (ore) (D T/T° m ) x 1000 carvacrolo p-cimene terpinene timolo Cinetiche di contatto LUV Cinetiche di trasferimento MLV 5 10 15 20 25 t inf -20 -15 -10 -5 tempo (ore) (D T/T° m ) x 1000 carvacrolo p-cimene g -terpinene timolo 5 10 15 20 25 t inf -15 -10 -5 tempo (ore) (D T/T° m ) x 1000 carvacrolo cimene g -terpinene timolo

43 Esperimenti a 10°C Timolo Carvacrolo p-Cimene g-Terpinene

44 Esperimenti a 37°C Timolo Carvacrolo p-Cimene g-Terpinene

45 Attività antimicrobica
TERPENE MIC (mg/ml) S.aureus ATCC 6538P E.coli ATCC 10231 CARVACROLO 1.25 ( ) 2.50 TIMOLO 0.31 5.0 ( ) P-CIMENE 1.25 -TERPINENE 2.50 ( )

46 CONCLUSIONI I dati di calorimetria permettono di evidenziare che i quattro composti studiati interagiscono con le membrane modello costituite da liposomi di DMPC causandone una destabilizzazione; I dati ottenuti permettono di classificare i composti in due gruppi: il timolo e il carvacrolo, che per la presenza della funzione fenolica, interagiscono con le membrane in quasi uguale misura, ma con effetti più marcati rispetto al p-cimene e il γ-terpinene; Gli esperimenti di cinetiche di contatto terpeni-MLV rivelano che i quattro composti sono in grado di attraversare lo strato acquoso, raggiungere la superficie degli MLV ed interagire con questi. Nel tempo tutti e quattro i terpeni tendono a raggiungere la massima interazione possibile, ma la cinetica di interazione è più lenta nel caso del γ-terpinene e del p-cimene, più veloce nel caso del timolo e soprattutto del carvacrolo;

47 CONCLUSIONI Gli esperimenti di cinetiche di contatto terpeni-LUV mostrano che i terpeni attraversano lo strato acquoso, raggiungono la superficie dei LUV interagendo con essi. Il confronto tra gli esperimenti di cinetica di contatto condotti con gli MLV e con i LUV mostrano che tutti i terpeni interagiscono più velocemente con i LUV probabilmente per la maggiore superficie che questi espongono; Le cinetiche di trasferimento indicano che i terpeni sono capaci di migrare dagli MLV carichi a quelli scarichi. Il -terpinene il p-cimene sono più veloci a trasferirsi dagli MLV carichi a quelli scarichi rispetto al timolo e al carvacrolo; I risultati degli esperimenti con la tecnica di Langmuir-Blodgett sono in accordo con i dati calorimetrici. Tutti e quattro i terpeni hanno un effetto espansore sul monolayer di DMPC. Tale effetto è più evidente per il carvacrolo e il timolo; Dai risultati ottenuti dalle prove d’attività antimicrobica è emerso che tutti e quattro i terpeni, anche se in misura diversa, sono capaci di impedire la crescita batterica sia di Escherichia coli che di Staphylococcus aureus.

48 Assorbimento del b-sitosterolo mediato da b-ciclodestrine
I fitosteroli sono sostanze che si trovano naturalmente nelle piante, sono le controparti del colesterolo nei prodotti animali. I fitosteroli sono presenti in una dieta normale, in particolare b-sitosterolo, campesterolo and stigmasterolo presenti in maggior quantità in molte fonti, e sono assorbiti proporzionalmente al colesterolo ma in misura minore. L’interesse allo studio dei fitosteroli è dovuto inizialmente al loro effetto nel ridurre l’assorbimento del colesterolo introdotto con la dieta proteggendo quindi da malattie cardiovascolari. b-sitosterolo

49 Insieme a vitamine liposolubili e carotenoidi, i fitosteroli sono costituenti alimentari vegetali altamente lipofili; inoltre, similarmente al colesterolo, i fitosteroli, possiedono sostituzioni in posizione C-24 responsabili del loro scarso assorbimento. Infatti è stato suggerito che negli esseri umani e altri mammiferi approssimativamente solo il 5% degli steroli ingeriti sono assorbiti. Per questo motivo molte preparazioni sono state formulate in maniera specifica per aumentare la solubilità in acqua e la biodisponibilità dei fitosteroli. CICLODESTRINE

50 Tecniche impiegate: Calorimetria a Scansione Differenziale (DSC): Interazione con modelli di biomembrana Cinetiche di contatto

51 Frazione molare È evidente come il b-sitosterolo provochi u decremento della Tm e del DH proporzionalmente alla sua concentrazione all’interno della membrane lipidica (relativo alla quantità di composto presente nella dispersione lipidica degli MLV); un simile comportamento è stato in passato riportato per i bilayers di fosfatidilcolina contenenti b-sitosterol da Halling e Slotte (Halling, K.K. et al. 2004). Questi risultati indicano che il b-sitosterolo interagisce con i modelli di biomembrana in maniera concentrazione dipendente. Queste curve si possono considerare come il massimo effetto causato dal sitosterolo quando è omogeneamente disperso all’interno dei modelli di biomembrana; come essi rilascino la quantità di sterolo e l’interazione, e sono impiegati (i valori di Tm) come riferimento nei successivi esperimenti per monitorare il trasferimento del sitosterolo dalla soluzione al modello di membrana.

52 Tempo (ore) Tempo (ore)
Dato che il b-sitosterolo è un composto molto idrofobico, sono stati condotti degli esperimenti di cinetica con MLV e b-sitosterolo in presenza di crescenti rapporti di b-CDs, come agente solubilizzante, per determinare se le b-CDs favoriscono la dissoluzione del sitosterolo nel mezzo acquoso e la velocità di migrazione (attraverso il mezzo), attraverso la formazione di complessi di inclusione (Del Valle E.M.M. 2004; Szetli J. 1985) “in situ” evitando la formazione dei complessi durante il processo di formulazione. Si può osservare come solo ad un rapporto 1:20 di b-sitosterol/b-CDs si ha un incremento dei valori di DT/T0m, in tutti gli altri casi invece si ha un decremento della variazione di temperatura. È bene notare che nessuna delle miscele β-sitosterolo/β-CDs raggiunge il valore osservato per lo sterol puro omogeneamente disperso nella matrice lipidica (tinf). Più alto è la quantità di b-CDs più è evidente il decremento del DT/T0m fino al rapporto 1:2 b-sitosterol/b-CDs.infatti un piccolo decremento è visibile per il b-sitosterol, e non cambia in presenza della b-CDs in rapporto 1:0.5. Per provocare un maggiore decremento del DT/T0m già dopo 4 ore di incubazione è necessario un rapporto 1:1. Infine un rapporto 1:2 determina un ben definite decremento del DT/T0m. Ad un rapporto 1:20 b-sitosterol/b-CDs si ottine invece un increment del DT/T0m, indicando quindi un comportamento anomalo a questo rapporto.

53 CONCLUSIONI Quindi concludendo possiamo confermare che il b-sitosterolo di per sè è molto idrofobo e quindi incapace di attraversare il mezzo acquoso, interagendo molto poco con il bilayer lipidico. Ciò è ben coerente con la ben nota scarsa disponibilità del b-sitosterolo se introdotto per via orale. Inoltre la presenza di adeguate concentrazioni di b-CDs possono migliorare l’interazione MLV/b-sitosterolo. Infatti il b-sitosterolo incapsulato in b-CDs è reso più disponibile a diffondere nel mezzo acquoso e a raggiungere la superficie degli MLV, consentendo quindi una sua permeazione attraverso le biomembrane (modelli che mimano l’assorbimento cellulare). Alte concentrazioni di b-CDs invece causano una variazione del comportamento termotripico della DMPC con un incremento della Tm. L’incremento della Tm della DMPC causato dall’interazione con b-CDs è stato già riportato da alcuni ricercatori che studiarono l’effetto degli zuccheri sulle membrane fosfolipidiche.

54 CONCLUSIONI I nostri risultati sono in accordo con i dati in letteratura considerando che l’aumento della temperatura della transizione di fase gel-cristallo liquido è dovuto all’effetto stabalizzante dei carboidrati sul doppio strato fosfolipidico attraverso la formazione di legami idrogeno più probabile alla testa del gruppo fosfato. Inoltre è stato anche dimostrato che alte concentrazioni di CDs possono catalizzare il non assorbimento dal monolayer e bilayer delle membrane, ostacolando quindi le nostre condizioni sperimentali e quindi anche l’interazione del sistosterolo con i fosfolipidi. Pertanto la scelta di un opportune rapporto molare -sitosterolo/-CDs potrebbe essere importante per evitare modifiche al modello di biomembrana dato da eccessive concentrazioni di -CD.

55 Prodrug Gemcitabina-Squalene
Antimetabolita pirimidinico derivato dal nucleoside naturale deossicitidina. Presenta caratteristiche strutturali e metaboliche simili alla Citarabina (Ara-C). Ampio spettro d’azione sia nei tumori murini che nei tumori eterotrapiantati. Gemcitabina (2’,2’-difluoro-deossicitidina)

56 Incremento della stabilità metabolica della Gemcitabina
Come l’Ara-C nella forma trifosfato è in grado di bloccare la sintesi del DNA. Una volta incorporato nel DNA in costruzione è in grado di legare un ulteriore nucleotide naturale che nasconde il farmaco agli enzimi di riparazione: le esonucleasi. Presenta inoltre un particolare meccanismo di autopotenziamento dell’attività citotossica (inibizione enzima inattivatore ad alte concentrazioni intracellulari). Meccanismo d’azione Incremento della stabilità metabolica della Gemcitabina Incorporazione del farmaco in liposomi a lunga emivita (approccio tecnologico) Sintesi di pro-drugs della Gemcitabina: Aumento della lipofilia del farmaco Protezione chimica del gruppo amminico in posizione N4 della citosina (che viene velocemente metabolizzato nel plasma)

57 Calorimetria a Scansione Differenziale (DSC)
Studi condotti: Calorimetria a Scansione Differenziale (DSC) Interazione con modelli di biomembrana Cinetiche di contatto Cinetiche di trasferimento 2. Langmuir Blodgett (LB) Isoterme a 10°C Isoterme a 37°C GEM-SQUALENE

58 Risultati DSC Interazione Cinetica di contatto di trasferimento
5 10 15 20 t inf -20 -15 -10 -5 Tempo (ore) Squalene Squalene acido gemcitabina Gem-squalene DT/T°m x 1000 5 10 15 20 t inf -20 -15 -10 -5 Tempo (ore) DT/T°m x 1000 Squalene squalCOOH gemcitabina Gem-squalene

59 Gemcitabina Squalene 10°C 10°C Risultati LB 37°C 37°C

60 Squalene acido Gem-Squalene 10°C 10°C 37°C 37°C

61 CONCLUSIONI Gli studi effettuati mediante Calorimetria a Scansione Differenziale e le misure eseguite mediante il metodo del film-balance  (tecnica di Langmuir-Blodgett, LB) hanno dimostrato che: a) la Gemcitabina e lo Squalene hanno uno scarsissimo effetto sul comportamento termotropico delle membrane modello dovuto, nel caso della gemcitabina, alla sua localizzazione negli strati acquosi fra i doppi strati fosfolipidici e, nel caso dello Squalene alla sua insolubilità nell’ambiente idrofobo delle catene aciliche dei fosfolipidi; al contrario lo Squalene-acido, grazie alla presenza del gruppo carbossilico determina una forte destabilizzazione del doppio strato lipidico. b) la Gemcitabina per il suo carattere idrofilo è capace di attraversare la strato acquoso ma non è in grado di penetrare nel doppio strato lipidico; lo squalene sia per la sua incapacità di attraversare lo strato acquoso sia per la sua insolubilità nel doppio strato lipidico non è in grado di avere effetti sul comportamento termotropico degli MLV di DMPC; sia lo Squalene-acido che lo Gem-squalene si sono dimostrati incapaci di raggiungere la membrana liposomiale ed interagire con essa, probabilmente a causa della loro elevata lipofilicità che non consente di diffondere in un mezzo idrofilo.

62 CONCLUSIONI c) La Gemcitabina non è capace di trasferirsi dagli MLV carichi a quelli vuoti. Lo Squalene non ha alcun effetto sul comportamento termotropico degli MLV a conferma della sua insolubilità nel doppio strato lipidico; il sistema liposomiale favorisce il rilascio sia dello Squalene-acido che dello Gem-squalene e il loro successivo assorbimento da parte della membrana modello; la cinetica di rilascio dello Squalene-acido e dello Gem-squalene è graduale e lenta nel tempo. d) la tecnica di Langmuir-Blodgett ha permesso di avvalorare i risultati ottenuti mediante DSC evidenziando il diverso effetto dei composti esaminati sul monostrato di DMPC. In conclusione il confronto di tutti i risultati ottenuti hanno dimostrano l’importanza del prodrug Gem-squalene nel consentire: una migliore interazione con le membrane biologiche del prodrug rispetto alla Gemcitabina libera; un rilascio del prodrug controllato e graduale nel tempo rispetto alla Gemcitabina libera.

63 LIPOPEPTIDI porzione peptidica * H N O
Lys-Ala-Val-Tyr-Asn-Phe-Ala-Thr-Met-NH 2 m porzione peptidica un residuo aminoacidico una catena lipidica (satura o insatura)

64 La coniugazione tra queste due porzioni comporta:
Aumento dela lipofilia del peptide Aumento della resistenza del peptide alla degradazione enzimatica Maggiore permeabilità attraverso le membrane biologiche Aumento immunogenicità Solubilità in acqua drasticamente ridotta

65 Curve DSC

66 Frazione molare Risultati

67 CONCLUSIONI Il peptide puro mostra un interazione molto bassa con il bilayer di DMPC, mentre la coniugazione del peptide ai lipoaminoacidi migliora la loro capacità di interagire con i modelli di biomembrana. L’interazione dipende fortemente dalla lunghezza delle catene e dal numero, in quanto al loro incremento ne consegue un decremento della cooperatività della transizione di fase e l’induzione di un disordine nel doppio strato lipidico. Inoltre la coniugazione dei lipoaminoacidi ad LCMV potrebbe far si che il peptide sia più efficientememte trasportato attraverso il sistema liposomiale.

68 Prodrug squalenici dell’Aciclovir
L’Aciclovir (ACV), è un analogo nucleosidico purinico di sintesi, derivato dalla deossiguanidina, è un principio attivo con potente attività antivirale contro l’Herpes Simplex Virus di tipo 1 (HSV-1), di tipo 2 (HSV-2), l’Herpes Zoster, il virus di Epstein Barr (EBV) ed il Citomegalovirus

69 SqualeneCOOH DMAP, DMF anidra EDC , 70°C Aciclovir Aciclovir-Squalene
2 SqualeneCOOH DMAP, DMF anidra , 70°C + EDC - Aciclovir Aciclovir-Squalene C

70 Tecniche impiegate: Calorimetria a Scansione Differenziale (DSC) Interazione con modelli di biomembrana Cinetiche di contatto Cinetiche di trasferimento 2. Langmuir Blodgett (LB) Isoterme a 10°C Isoterme a 37°C

71 Aciclovir Squalene Squalene COOH Aciclovir-Squalene

72 RISULTATI Cinetica di contatto Cinetica di trasferimento Aciclovir
Squalene Squalene COOH Aciclovir-Squalene Aciclovir Aciclovir-Squalene Squalene COOH Squalene

73 Isoterme a 10°C

74 Misure a 37°C

75 CONCLUSIONI L’Aciclovir e lo Squalene hanno uno scarsissimo effetto sul comportamento termotropico delle membrane modello; lo SqualeneCOOH determina una forte destabilizzazione del doppio strato lipidico. Nel caso dell’Aciclovir-Squalene, si osserva una forte destabilizzazione del doppio strato lipidico proporzionale alla quantità di prodrug. L’Aciclovir potrebbe essere capace di attraversare lo strato acquoso, ma non è in grado di penetrare nel doppio strato lipidico; gli altri tre composti si sono dimostrati incapaci di raggiungere la membrana liposomiale ed interagire con essa, probabilmente a causa della loro elevata lipofilicità che non consente di diffondere in un mezzo idrofilo. L’Aciclovir non è capace di trasferirsi dagli MLV pieni a quelli vuoti; lo Squalene non ha alcun effetto sul comportamento termotropico degli MLV a conferma della sua insolubilità nel doppio strato lipidico; il sistema liposomiale favorisce il rilascio sia dello SqualeneCOOH che dell’ACV-SQ e il loro successivo assorbimento da parte della biomembrana modello; la cinetica di rilascio dello SqualeneCOOH e dell’Aciclovir-Squalene è graduale e lenta nel tempo.

76 RILASCIO DI DEET E OTC DA SLN
Agli inizi degli anni ’90, con lo sviluppo delle “Nanoparticelle Solide Lipidiche” (SLN), sono stati uniti i vantaggi di liposomi, emulsioni e particelle solide. Le SLN sono state ottenute semplicemente scambiando la fase lipidica liquida (olio) delle emulsioni con un lipide che si trova allo stato solido sia a temperatura ambiente che alla temperatura corporea. In base al tipo di SLN prodotte è possibile ottenere il rilascio modificato del principio attivo.

77 a) b) c) Le SLN agiscono, inoltre, come occlusivi, perciò possono essere usate per aumentare il contenuto in acqua della pelle. Grazie alle loro ridotte dimensioni possiedono proprietà adesive che consentono la formazione di un film sulla superficie della pelle. L’adesività è una caratteristica tipica delle particelle molto fini e consente la formazione di un film costituito da sfere densamente impaccate sulla superficie cutanea

78 SLN + FILTRO SOLARE: OMC + REPELLENTE: DEET SLN/OMC-DEET
Scattering dei raggi UV + FILTRO SOLARE: OMC + REPELLENTE: DEET octyl methoxy cinnamate N,N–diethyl–m toluamide SLN/OMC-DEET ultrasuoni

79 RISULTATI Dinamic light scattering: diametro medio 302.6 nm
Elevata incorporazione di principi attivi DSC:

80 Studi di assorbimento percutaneo in vitro
Sia l’OMC che il DEET incorporati nelle SLN mostrano un flusso allo steady-state significativamente minore rispetto a quello riscontrato nell’emulsione o/w contenente la stessa quantità di principi attivi. Valori di flusso del DEET e dell’OMC allo steady-state dalle SLN e dall’emulsione o/w. Conclusioni: si può ipotizzare che l’impiego delle SLN come sistemi carrier per la veicolazione dell’OMC e del DEET garantisce una maggiore permanenza dei composti sulla superficie della pelle, ovvero nel sito in cui devono svolgere la loro azione, riducendo, inoltre, la loro permeazione attraverso la pelle e di conseguenza i possibili effetti collaterali o tossici.

81 Erbicidi, derivati della Fenilurea
Gli erbicidi sono sostanze chimiche che uccidono le piante e sono largamente usati per aumentare la resa e migliorare la qualità della produzione agricola; Generalmente essi esibiscono una tossicità nei mammiferi, alcuni di loro sono altamente tossici, mentre altri sono genotossici e alcuni sono cancerogeni in saggi in vivo; Gli erbicidi derivati della fenilurea sono principalmente assorbiti attraverso le radici e trasportati al sito d’azione dove essi bloccano il trasporto di elettroni nella fotosintesi; La presenza degli erbicidi nel sottosuolo indica che molti di questi composti non sono biodegradabili e possono persistere per un lungo periodo nell’ambiente inquinandolo. 81 81

82 Erbicidi, derivati della Fenilurea
H 3 N O Cl Br Fenuron Clorotoluron Metobromuron Monolinuron Clorbromuron 82 82

83 Erbicidi, derivati della Fenilurea
Tecniche impiegate: Calorimetria a Scansione Differenziale (DSC): Interazione con modelli di biomembrana Cinetiche di contatto Cinetiche di trasferimento 83 83

84 Cinetiche di contatto MLV
Studi di interazione Cinetiche di contatto MLV 0,05 0,1 0,15 0,2 -30 -25 -20 -15 -10 -5 Frazione molare D T/T° m x 10 3 fenuron clorotoluron metobromuron monolinuron clorbromuron 2 4 6 8 22 r -30 -25 -20 -15 -10 -5 tempo(ore) ( D T/T° m ) x 10 3 fenuron chlorotoluron metobromuron monolinuron chlorbromuron Cinetiche di contatto LUV Cinetiche di trasferimento MLV tempo (ore) 2 4 6 8 22 r -30 -25 -20 -15 -10 -5 ( D T/T° m ) x 10 3 fenuron chlorotoluron metobromuron monolinuron chlorbromuron 2 4 6 8 22 r -30 -25 -20 -15 -10 -5 tempo (ore) ( D T/T° m ) x 10 3 fenuron chlorotoluron metobromuron monolinuron chlorbromuron 84 84

85 CONCLUSIONI Dai dati calorimetrici ottenuti è possibile concludere che: Tutti gli erbicidi causano un decremento nella temperatura di transizione ma in maniera diversa. Il maggior effetto è esibito dal clorbromuron, seguito da monolinuron e metobromuron, e poi da clorotoluron e fenuron con il più basso effetto; Per quanto riguarda la cinetica di contatto possiamo dire che fenuron e monolimuron riescono a dissolversi nel mezzo acquoso, raggiungere la superficie degli MLV e interagire con il bilayer fosfolipidico, probabilmente grazie alla loro elevata solubilità in acqua; Comparando i risultati ottenuti tra LUV ed MLV sembra che gli erbicidi interagiscano meglio con i primi, probabilmente grazie alla maggiore superficie di contatto che questi espongono; Dalle cinetiche di trasferimento è emerso che questi composti sono in grado di trasferirsi da MLV pieni a MLV vuoti, che ciò succede piuttosto velocemente e che l’equilibrio di concentrazione è raggiunto in poche ore. 85 85

86 Nitro-Idrocarburi Policiclici Aromatici
Sono derivati degli Idrocarburi Policiclici Aromatici (IPA), che contengono due o più anelli aromatici condensati; Sono presenti nell’ambiente in miscela con altri composti organici, sia liberi nell’aria che adsorbiti a materiale particolato; I nitro-IPA sono prodotti diretti o indiretti di combustioni incomplete; Tali composti sono solo parzialmente degradati da microrganismi e possono persistere nell’ambiente. 86 86

87 Nitro-Idrocarburi Policiclici Aromatici
3-nitrofluoranthene 2-nitrofluorene 2,7-dinitrofluorene 87 87

88 Nitro-Idrocarburi Policiclici Aromatici
Tecniche impiegate: Calorimetria a Scansione Differenziale (DSC) Interazione con modelli di biomembrana Cinetiche di contatto Cinetiche di trasferimento 88 88

89 2,7-dinitrofluorene 2-nitrofluorene 3-nitrofluorantene
89 89

90 CONCLUSIONI Cinetica di trasferimento Cinetica di contatto
È stato trovato: (a) il seguente ordine di interazione: 3-nitrofluoranthene>2-nitrofluorene>2,7-dinitrofluorene; (b) uno scarso assorbimento dei nitro-IPA attraverso i modelli di biomembrana nel mezzo acquoso (c) mentre un forte assorbimento dei nitro-IPA attraverso i modelli biomemrana mediato dal mezzo lipofilo. 90 90

91 SINTESI E CARATTERIZZAZIONE DI CARRIERS COLLOIDALI OSTEOTROPICI PER IL TRASPORTO DI ANTITUMORALI AL TESSUTO OSSEO METASTATICO Diverse strategie, che sfruttano la coniugazione con i bisfosfonati, per l’ottenimento di trattamenti e sistemi terapeutici per la cura di osteoporosi, osteoartriti, cancro all’osso, ed in generale di Osteotropic Drug Delivery System (ODDS), sono ampiamente descritte in letteratura; Lo scopo del lavoro è stato quello di formulare un carrier colloidale osso-affine per l’incapsulazione ed il trasporto di un antitumorale come la doxorubicina per la cura delle metastasi ossee

92 1° Step: Sintesi e caratterizzazione del coniugato ammidico tra un polimero (PLA/PLGA) ed un bisfosfonato (Alendronato sodico) P O C H ( 2 ) 3 N R1 R2 n y * -[(C 6 8 4 x (C ] - RESOMER 502 H + ACIDO ALENDRONICO CONIUGATO AMMIDICO

93 2° Step: coniugazione dell’alendronato sodico al polimero attivato
H 3 y * -[(C 6 8 4 ) x (C ] - Sintesi 2 Sintesi 1 Attivazione del carbossile via EDAC Attivazione del carbossile via N-idrossisuccinimmide 2° Step: coniugazione dell’alendronato sodico al polimero attivato

94 3° Step: caratterizzazione del coniugato ammidico, 1H-NMR

95 3° Step: caratterizzazione del coniugato ammidico, MALDI-TOF
Resomer 502H PLA/PLGA-Ale

96 3° Step: caratterizzazione del coniugato ammidico, DSC
Curve DSC di PLGA (a), PLGA-ALE coniugato (b), PLGA/ALE miscela fisica (c) e alendronato sodico (d).

97 4° Step: Test di biocompatibilità in vitro
Test di emolisi: il Resomer 502H ed il coniugato polimerico non mostrano avere effetti emolitici;

98 Effetto del coniugato polimerico sulla fase plasmatica della coagulazione: alte concentrazioni di campione (10-4 e 10-5 M) inducono un decremento dell’attività protrombinica (PT) ed un importante estensione del Tempo di Attivazione Parziale della Tromboplastina (APTT). Basse concentrazioni ( M) non hanno effetti sulla fase plasmatica di coagulazione. Il coniugato polimerico non determina importanti variazioni nella concentrazione di fibrinogeno rispetto al DMSO;

99 Neutral red test su cellule endoteliali: il coniugato polimerico alle diluizioni testate non ha effetti sulla vitalità delle cellule (Kruskal-Wallis test p= Neutral red test su osteoblasti: il coniugato polimerico alle diluizioni testate non ha effetti sulla vitalità degli osteoblasti (Kruskal-Wallis test p=0.9781).

100 5°Step: Preparazione e caratterizzazione delle nanoparticelle a partire dal coniugato ammidico
Nanoparticelle del coniugato PLA/PLGA-Ale sono state preparate in accordo con il metodo della nanoprecipitazione usando la tecnica di evaporazione del solvente. Le nanoparticelle così ottenute sono state sterilizzate mediante due tecniche: filtrazione sterilizzante con filtri da 0,45 mm sterilizzazione con raggi g Dinamic Light Scattering

101 Size (nm) Intensity Np-PLA/PLGA-Ale DMSO/Acetone (1:1 v:v)
100 200 300 400 500 600 2 4 6 8 10 12 Size (nm) Intensity Np-PLA/PLGA-Ale DMSO/Acetone (1:1 v:v) Np-PLA/PLGA-Ale KCps ZAve Poly Fit 1 46,5 182,2 0,144 0,0004 2 45,7 179,8 0,174 3 45,8 183,0 0140 0,0003 Average 46,0 181,7 0,153 +/- 0,5 1,7 0,019 Np-PLA/PLGA-Ale Kcps Mob Zeta Width 1 891,1 -2,920 -36,5 6,0 2 814,2 -3,164 -39,4 0,1 3 730,6 -3,283 -40,8 Average 812,0 -3,122 -38,9 +/- 80,3 0,185 2,2

102 6°Step: Incapsulazione delle nanoparticelle con Doxorubicina
Le nanoparticelle fatte dal coniugato PLGA/Ale e Doxorubicina usando il metodo della nanoprecipitazione appaiono essere sferiche e mostrano una distribuzione omogenea e un basso indice di polidispersione. 60x X 7°Step: Valutazione del loading di Doxorubicina Efficienza di incapsulazione: 61%

103 8°Step: Saggio per l’affinità all’idrossiapatite (HA) di nanoparticelle di PLGA-ALE
Sembra che l’affinità aumenti con il tempo d’incubazione ed è proporzionale alla concentrazione di idrossiapatite nella sospensione. In particolare mentre alla concentrazione di 1mg/ml di HA, i due tipi di nano particelle non mostrano nessuna evidente differenza in termini di riduzione di assorbanza di Oil red O e quindi di assorbimento all’HA. Ad alte concentrazioni del sale (5 mg/mL) le nano particelle di PLGA-ALE rimangono legate all’HA maggiormente che quelle di solo PLGA mostrando un 43 e un 50% di incremento di affinità rispettivamente dopo 15 e 30 min.

104 Conclusioni In questo lavoro lo scopo è stato quello di realizzare un carrier polimerico per il trasporto di farmaci al tessuto osseo malato, un coniugato tra il PLGA 50:50 e l’amino bisfosfonato ALE, quindi questo è stato sintetizzato e caratterizzato. Da questo coniugato di partenza sono state preparate nano particelle dalle dimensioni comprese tra 200 e 300 nm con il classico metodo di evaporazione del solvente. Il PLGA-ALE non causa emolisi o alterazioni della fase plasmatica di coaugulazione in vitro o effetti citotossici su cellule endoteliali e osteoblasti trabecolari, quindi dimostrandosi un ottimo prodotto di partenza per il caricamento di farmaci come quello descritto.

105 RINGRAZIO… …e voi tutti per la cortese attenzione!
Prof.re Francesco Castelli Dott.ssa Maria Grazia Sarpietro Prof.re Rosario Pignatello Prof.re Gaetano Giammona Dott. re Nicola Baldini e la Dott.ssa Cenni Elisabetta (Istituto Rizzoli, Bologna) Dott.ssa Valentina Pantò & Co. “TUTTO IL MIO LAB.” …e voi tutti per la cortese attenzione!