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By NA Premesse e riepilogo Lezione 1. By NA Scopo del corso Lo scopo di questo corso non e quello di imparare la clinica delle malattie, ma capire come.

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1 By NA Premesse e riepilogo Lezione 1

2 By NA Scopo del corso Lo scopo di questo corso non e quello di imparare la clinica delle malattie, ma capire come si sceglie un test diagnostico nei casi di malattie che coinvolgono il materiale ereditario. Quindi dovrete rinfrescarvi la Genetica fatta finora. In questo corso parleremo di diagnostica e quindi necessariamente dovremo parlare di malattie, ma ora come sempre le malattie ci servono come modelli per capire le strategie.

3 By NA Cosa significa ricerca delle mutazioni. Vi ricordo che mutazione significa semplicemente variazione di una sequenza confrontata con una sequenza di riferimento. Da questo ne consegue che mutazione non vuol dire che ci sia un effetto patologico. Vi ricordo la definizione di polimorfismo:variazione presente nella popolazione con una frequenza superiore a 1%. Per definizione un polimorfismo e innocuo, almeno finche non si dimostra il contrario. E comunque vero che generalmente quando si parla di mutazione si intende una variazione patogenetica e il polimorfimo viene chiamato anche variante allelica, tuttavia non e completamente corretto e noi specificheremo sempre mutazione patogenetica o non patogenetica

4 By NA Il genoma umano, come tutti i genomi e plastico: la sopravvivenza di una specie dipende dalla sua variabilita e dalla capacita di evolvere. Il genoma umano e il risultato di eventi di poliploidizzazione che hanno modificato drasticamente il numero cromosomico. Le mutazioni cromosomiche di solito alterano il fenotipo riducendo la fitness, e sono pertanto rare a livello costituzionale, ma frequenti a livello somatico nei tumori. A livello molecolare si distinguono diversi tipi di mutazione che ormai dovreste conoscere percio vi risparmio il loro elenco. La variazione di una sequenza in una popolazione naturale non comporta necessariamente linsorgenza di un fenotipo anomalo. Quando si parla di alleli di un locus questi sono il risultato di una mutazione che per caso, per effetto della deriva genetica si sono fissati nella popolazione Mutazioni Eterozigosi media per il DNA genomico umano: ~0,0037 (0,37%). Cio significa che in due alleli circa 1:250-1:1000 basi sono diverse

5 By NA Va ricordato che le mutazioni avvengono a caso percio sia il DNA codificante che il non codificante sono egualmente suscettibili. Le conseguenze sono ovviamente diverse. Le conseguenze nella parte codificante (che costituisce circa il 3% del genoma umano) sono legate al tipo di mutazione e anche questo lo sapete. Mutazioni Il tasso di mutazione del DNA codificante risulta piu basso rispetto al non codificante in quanto la pressione selettiva agisce eliminando dalla popolazione gli alleli negativi e rendendo di fatto assenti nella popolazione quelle mutazioni che alterino pesantemente la funzione del prodotto genico (per es. le frameshift piu frequenti nel non codificante). Le mutazioni del DNA non codificante hanno effetto se avvengono nelle sequenze regolatrici o nelle sequenze introniche deputate allo splicing. Anche in questo caso leffetto dipende dal mantenimento della funzione.

6 By NA Sostituzione silente: non determina alcun cambiamento nel prodotto: lamminoacido resta lo stesso. Dal momento che modifica la sequenza puo originare un RFLP. In qualche caso puo dare origine ad un sito di splicing criptico e quindi essere tuttaltro che neutre come la semplice sequenza potrebbe far pensare. Sostituzione non senso: si origina un codone di stop. Dal momento che la pressione selettiva e forte su un prodotto troncato prematuramente, sono rare. Sostituzione di senso errato:si origina un codone per un altro amminoacido non conservativa: il nuovo ammnoacido e completamente diverso dal vecchio. Puo avere effetti deleteri. conservativa : il nuovo amminoacido ha caratteristiche chimiche simili al vecchio. Pertanto leffetto sul prodotto puo essere minimo e puo essere definito polimorfismo sia a livello di DNA che di prodotto. Mutazioni

7 By NA Il tasso e il tipo di sostituzioni percio e estremamente variabile fra i diversi geni. Alcune proteine come le ubiquitine hanno un livello di conservazione totale nella scala zoologica dalluomo al lievito. La loro sequenza a livello di DNA indica che le sostituzioni ci sono, ma sono praticamente tutte sinonime. Allestremo opposto ci sono geni pochissimo conservati se non in brevi domini nellevoluzione come SRY. SRY ha una funzione chiave in tuttii mammiferi, ma questa e demandata all HMG box, che corrisponde a 78 aa. I segmenti N- e C- terminali sono estremamente variabili, indicando che per la funzione del gene questi segmenti non sono critici Mutazioni

8 By NA Mutazioni dovute allespansione di trinucleotidi localizzati nelle regioni codificanti o non-codificanti di alcuni geni, si originano per errori nella replica del DNA. Non tutte le espansioni sono instabili. Se laumento di lunghezza non e eccessivo, e una mutazione patogena ma stabile nella trasmissione. Si comportano cioe come le mutazioni canoniche, e seguono le leggi di Mendel Gene HOXD13 : lespansione determina la formazione di lunghi tratti di polialananina, e provoca sinpolidattilia. E rimasta stabile per 7 generazioni Quando una sequenza trinucleotidica cambia le proprie dimensioni da una generazione allaltra si parla di mutazioni dinamiche Mutazioni dinamiche

9 By NA Principio dellequivalenza dei gameti: lespressione di un gene non dipende dal sesso del genitore che lo trasmette. Esclusione allelica: in alcuni tipi cellulari viene espresso uno solo dei due alleli, anche se entrambi sono in grado di esprimersi. Si ha una emizigosi funzionale:linfociti B e immunoglobuline, geni dei recettori olfattivi nei neuroni.... Mutazioni che alterano i meccanismi epigenetici: Imprinting

10 By NA Leredita mitocondriale non segue il principio dellequivalenza dei gameti, ma in questo caso non si parla di imprinting: i gameti sono effettivamente non equivalenti in termini di contenuto genico perche il gamete maschile non contribuisce alla dotazione di mitocondri dellembrione. Leredita legata al sesso non segue il principio dellequivalenza dei gameti, ma di nuovo i gameti sono effettivamente non equivalenti perche i cromosomi sessuali non sono del tutto omologhi. Lespressione di un fenotipo dovuto a un locus localizzato sui cromosomi sessuali dipende dal sesso della progenie. Ricordiamo cosa non e e cosa e limprinting Imprinting genomico: espressione differenziata di un gene perfettamente funzionale legata allorigine parentale, indipendente dal sesso della progenie, che puo essere limitata nello spazio e nel tempo.

11 By NA Mutazioni cromosomiche Sono una categoria di mutazioni rara nel costituzionale, e il piu delle volte sono patogenetiche. Possono provocare patologie gravi a livello dellindividuo e quindi non vengono ereditate. Oppure ridurre la fitness per la presenza di gameti sbilanciati, ma possono venir trasmesse alla generazione successiva per la loro tollerabilita in eterozigosi. Sono frequenti nei tumori, dove possono indurre la tumorigenesi a causa della creazione di geni ibridi, o perche portono alla sovraespressione di geni

12 By NA Modifiche nella configurazione della cromatina Il cambiamento di configurazione, legato ad un effetto di posizione per un riarrangiamento, puo portare alla manifestazione di fenotipi patologici: Aniridia: silenziamento del gene PAX6 Distrofia Facioscapolomerale: una delezione di 3-4Kb elimina dalla regione compresa fra due geni: FRG1 e FRG2, delle sequenze ripetute denominate D4Z4. La perdita di queste sequenze porta questi due geni normalmente localizzati in due domini diversi, a mappare nello stesso dominio. Lassenza delle ripetizioni che interagiscono con proteine regolatrici per modificare lespressione di questi geni, comporterebbe un over espressione, con conseguente fenotipo patologico

13 By NA RIEPILOGO TECNICHE

14 By NA sono routinariamente usati a scopo diagnostico SNPs che alterano la struttura primaria di una proteina coinvolta nel metabolismo di un farmaco bersagli dellanalisi farmacogenetica SNPs nelle regioni non-codificanti del genoma, quindi senza impatto sul fenotipo dellindividuo markers usati in genetica di popolazione e negli studi di evoluzione SNP SNPs nella regione codificante di un gene, alterando la struttura di una proteina, possono essere la causa di disordini monogenici ereditati in maniera dominante

15 By NA ASO (Allele Specific Oligonucleotide)

16 By NA Caricamento su gel SSCP : Single Strand Conformational Polymorphism Omozigote Wild-typeOmozigoteMutante PCR Eterozigote Omo WTOmo mutetero Denaturazione Reverse Forward Reverse Forward C G C G C G A T A T A T C G C G C G A T A T A T C G A T VARIAZIONI ANCHE DI 1 SOLA BASE PROVOCANO UNA DIFFERENZA NELLA CORSA SU GEL

17 By NA DGGE elettroforesi su gel in gradiente denaturante Si basa sulla selettivita del gel che deve essere in grado di creare un gradiente di denaturazione molto stringente: LINIZIO della denaturazione con formamide o urea dipende dalla sequenza la variazione anche di una singola base puo modificare la risposta allagente denaturante per cui una sequenza comincia a denaturarsi prima o dopo quella di riferimento. Si amplifica il DNA con primer alla cui estremita 5 a monte e stata aggiunta una coda di G. questa coda generera un allungamento della sequenza amplificata con una serie di CG (40basi) che tenderanno a stabilizzare la molecola e aumentano la capacita discriminante della corsa elettroforetica. il limite della tecnica e la messa a punto delle condizioni sperimentali che richiedono una accurata conoscenza della sequenza da testare. La presenza della sequenza di riferimento in banca dati facilita la messa a punto con questa tecnica e possibile individuare il 99% delle variazioni

18 By NA DGGE elettroforesi su gel in gradiente denaturante GGGG CCCC GGGG CCCC PCR CCCC GGGG CCCC GGGG Gel denaturante Denaturazione crescente Fig 7.7

19 By NA DGGE schema II

20 By NA DGGE gel

21 By NA DGGE CFTR

22 By NA DGGE esone 12 CFTR

23 By NA Figure 1 shows ß-thalassemia samples run on a parallel DGGE gel. The three heterozygous samples in lanes 1–3 were resolved into two heteroduplex and two homoduplex bands. The heteroduplex bands (upper bands) migrated slower than the corresponding homoduplex bands (lower bands). The wild-type sample in lane 4 was resolved as one band, and it migrated to the same distance as the wild-type band in the mutant samples. The ability to resolve the heteroduplex fragments and the mutant homoduplex fragment in the mutant samples makes it possible to distinguish between samples that are mutant or wild type. From the results, it was possible to detect single base substitutions in the mutant samples from the wild-type sample using parallel DGGE. DGGE -Thalassemia

24 By NA DGGE Poliposi del colon

25 By NA MLPA ® Multiplex Ligation Probe Amplification

26 By NA MLPA ® Multiplex Ligation Probe Amplification Each peak is the amplification product of a specific probe. Samples are compared to a control sample. A difference in relative peak height or peak area indicates a copy number change of the probe target sequence

27 By NA Normal Ligation of the two probe oligonucleotides Amplification product Mismatch at the probe ligation site No ligation, no amplification product MismatchPerfect match MLPA ® Multiplex Ligation Probe Amplification

28 By NA Unmethylated Target M M Methylated Target Denaturation and Multiplex probe hybridization M Only undigested (methylated) and ligated probes are exponentially amplified Ligation and Digestion with methylation sensitive endonucleases M MS-MLPA

29 By NA Control Undigested ME028 PW / Angelman kit Control Hha1 digested Arrows indicate probes for imprinted sequences (1 copy methylated) MS-MLPA

30 By NA

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33 Il materiale didattico e presente in rete : sono presenti anche i file PDF degli articoli necessari per la preparazione


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