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ANALISI QUANTITATIVA Lanalisi quantitativa UV-VIS si basa sulla legge di Lambert-Beer che esprime una relazione di proporzionalità tra la conc. di un analita.

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1 ANALISI QUANTITATIVA Lanalisi quantitativa UV-VIS si basa sulla legge di Lambert-Beer che esprime una relazione di proporzionalità tra la conc. di un analita e lassorbanza a una determinata. Perchè tale legge sia applicata in analisi quantitativa devono essere rispettate due condizioni: - Lanalita deve assorbire in modo rilevabile nellintervallo spettrale nm.Questo si verifica con una analisi spettrale dellanalita. Si identifica quindi la lunghezza donda (solitamente max) per lanalisi quantitativa - La relazione assorbanza/conc. deve essere lineare. Questo si verifica allestendo una curva di calibrazione Esistono diversi fattori che possono provocare deviazioni dalla linearità tra cui fattori fisici/chimici, fattori strumentali e operativi

2 -Variazioni di pH, temperature e solvente possono avere effetto sulla linearità -In soluzioni torbide la luce incidente viene in parte persa per effetto della diffusione con un aumento (apparente) della assorbanza. Si risolve il problema utilizzando opportuni sistemi in grado di raccogliere la luce dispersa (sfera integratice) - A concentrazioni elevate, le molecole possono formare dimeri e polimeri, anche aggregati con il solvente. Di conseguenza si possono osservare deviazioni positive o negative dalla legge di lambert Beer concentrazione Assorbanza Formazione di dimeri Formazione di polimeri Fattori fisici e chimici -Lindice di rifrazione della soluzione varia al variare della concentrazione (quando è elevata) e di conseguenza varia anche la poiché la rifrazione fa variare la lunghezza donda della radiazione incidente. Per ridurre tale inconveniente, di solito si lavoro con soluzioni diluite – M.

3 concentrazione Assorbanza Radiazione monocromatica Banda stretta Banda larga Fattori strumentali -Lampiezza della banda passante, oltre ad essere decisiva sulla precisione e accuratezza dellanalisi, influisce inoltre sulla linearità della legge di lambert Beer. -La luce diffusa dovuta a cause strumentali altera l assorbanza soprattutto per soluzioni concentrate (la curva assume pendenza negativa) A = log P 0 + S P + S A = log P 0 + S S Per soluzioni molto concentrate, P diminuisce e al limite si annulla

4 CALIBRAZIONE La calibrazione determina la relazione tra la risposta analitica e la concentrazione dellanalita. Di solito tale operazione si effettua mediante standard. Calibrazione con std. esterno Lo std. esterno viene preparato separatamente dal campione (al contrario lo std. Interno è aggiunto al campione stesso). Si prepara una serie di std. esterni contenenti lanalita a concentrazioni note (almeno 3 conc., metodo della diluizione progressiva). Si misura quindi lassorbanza rispetto alla concentrazione dellanalita e e si determina la curva di calibrazione fittando i dati con unappropriata equazione matematica, quale la relazione lineare usata nel metodo dei minimi quadrati

5 Il metodo dei minimi quadrati Lassorbanza (ordinata) è la variabile dipendente mentre concentrazione (ascissa) è la variabile indipendente. In condizioni ideali tutti i punti sono allineati con lorigine degli assi (ratta passante per lo 0, y= mx). In condizioni reali, a causa degli errori indeterminati associati al processo di misurazione, non tutti i dati si trovano sulla stessa linea y=mx x y m= y/ x y=mx+b

6 In tali condizioni bisogna derivare la migliore retta che interpoli i punti. Lanalisi dei minimi quadrati lineare fornisce lequazione della migliore retta passante tra un insieme di dati x,y, assumendo che ogni deviazione dei punti dalla linea retta deriva da un errore commesso nel corso della misurazione. Quindi si assume che ai valori x, ovvero alla preparazione delle concentrazioni, non è associato alcun errore La linea costruita con il metodo dei minimi quadrati è quella che minimizza la somma dei quadrati dei residui (deviazione verticale di ciascun punto dalla retta) corrispondenti a tutti i punti

7 Uso di Excel nel calcolo dei minimi quadrati 1. Inserire i dati x e y su due colonne 2. Selezionare una serie di celle con larghezza pari a due celle e lunghezza cinque

8 3. Selezionare la funzione statistica REGR.LIN 4. Compilare gli argomenti funzione come indicato 5. Per visualizzare i risultati digitare la seguente combinazione Ctr+Shift+Invio

9 intercetta pendenza d.s. pendenzad.s. intercetta Coeff. di deter. (R 2 ) d.s. della regressione F gradi libertà Somma quadrati residui Somma quadrati regr. Pendenza = mIntercetta = b y = mx + b Coefficiente di determinazione (R 2 ): è un indice della variazione totale tra il valore y misurato e quello derivante dalla relazione lineare determinata. Il valore va da 0 a 1. Più il valore di R 2 si avvicina allunità meglio il modello lineare esprime le variazioni di y

10 Rappresentazione grafica

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13 Il metodo dellaggiunta standard Tale metodo si applica qualora lanalita sia in una matrice più o meno complessa possibile interferenza dei componenti della matrice con la determinazione dellanalita. Per eliminare tali interferenze bisognerebbe preparare una serie di std. che riproducono esattamente il campione (spesso non è possibile). In tali casi si utilizza il metodo dellaggiunta standard che controbilancia gli effetti della matrice. Il metodo prevede laggiunta di diverse aliquote di una soluzione std. ad uguali aliquote di campione. V x =volume soluzione incognita C x VtVt V s =volume soluzione std. Cs Diverse aliquote uguali V x della soluzione incognita di concentrazione C x sono trasferiti in matracci volumetrici aventi volume V t. A ciascuno di essi è aggiunto un volume variabile V s di una soluzione std. a concentrazione nota C s. Si determina sperimentalmente la assorbanza.

14 Lassorbanza della soluzione è descritta da: A s = b V s C s VtVt b V x C x VtVt + = k V s C s + kV x C x Dove k è una costante uguale a b/V t. Un grafico di A s in funzione di V s, produce una linea retta di equazione: A s = mV s + b ove m= kC s e b= kV x C x Dallanalisi dei minimi quadrati si determina m e b. m b = kC s kV x C x C x = bC s mV x

15 Esempio metodo delle aggiunte std. Aliquote di 10 ml di un campione di Fe 3+ di una soluzione incognita vengono aggiunte in matracci volumetrici da 50 ml. Esattamente 0.00, 5.00, 10.00, e ml di una soluzione std. contenente 11.1 ppm di Fe 3+ vengono aggiunti a ciascuna aliquota, seguiti da un eccesso di ione tiocianato, per dare il complesso Fe(SCN) 2+. Dopo diluizione a volume le assorbanze misurate risultano rispettivamente: 0.240, 0.437, 0.621, e Calcolare la concentrazione di ioni Fe 3+ della soluzione incognita. Cx = bC s mV x m = b = ppm Fe 3+

16 Analisi di miscele Lassorbanza di una soluzione ad una particolare lunghezza donda è uguale alla somma delle assorbanze di tutte le specie presenti nella soluzione Assorbanza di una miscela A = x b [X] + Y b [Y] + Z b [Z] + ….. Si consideri un miscela costituita da due composti X e Y, si distinguono due casi: Spettri sovrappostiSpettri solo in parte sovrapposti

17 Procedimento per lanalisi di una miscela i cui componenti presentano spettri sovrapposti Si consideri lanalisi dei complessi di Ti(IV) e V(V) con H 2 O 2

18 1.Determinare lassorbanza di ciascun std. a diverse lunghezze donda 2.Calcolare lassorbività molare a ciascuna lunghezza donda mediante la legge di Beer [Ti] std= M[V] std= M

19 3. Misurare lassorbanza della miscela che è data dalla somma delle assorbanze delle componenti Am = x b [X] + Y b [Y] (non si conoscono tuttavia [X] e [Y]

20 3. Stimare la concentrazione di X e Y (il valore stimato non deve necessariamente essere vicino al valore vero) e calcolare usando la funzione Excel, il valore ai A calc mediante lequazione Acalc = x b [X] + Y b [Y] Valori stimati

21 5. Calcolare con funzione Excel la somma dei quadrati [H9 =SOMMA(H4:H8)] 4. Calcolare con funzione Excel il quadrato della differenza tra lassorbanza calcolata e quella misurata [Acalc-Am]^2

22 5. Effetuare lanalisi dei minimi quadrati per minimizzare la somma dei quadrati [Acalc- Am]^2 variando le concentrazioni di [X]stima e [Y]stima. I valori migliori di [X]stima e [Y]stima sono quelli che rendono minima la somma dei quadrati (cella H9). Excel contiene una macro per lo svolgimento della minimizzazione (RISOLUTORE) Se non presente scegliere componenti aggiuntivi dal menu strumenti e selezionare aggiunta risolutore

23 6. Impostare i parametri di minimizzazione e quindi risolvere lanalisi

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25 Procedimento per lanalisi di una miscela i cui componenti presentano spettri risolti Se gli spettri dei componenti di una miscela sono risolti sufficientemente (come nel caso di 1 e 2 ), le concentrazioni della miscela si determinano risolvendo una sistema di due equazioni A = X b [X] + Y b [Y] Ove A e A sono lassorbanza rispettivamente a e

26 A = X b [X] + Y b [Y] Risolvendo lequazione nelle due incognite X e Y si ottengono i seguenti risultati: [X] = A Y b X b Y b Y b Y b [Y] = X b A Y b A X b Y b Y b Y b Ciascun simbolo a b c d è detto determinante ed è un modo abbreviato per scrivere ( a x d) – (c x b)

27 Si considerino le sostanze X e Y le cui assorbività molari sono di seguito riportate (nm) XY Una mscela di composti X e Y è caratterizzata da una assorbanza di a 272 nm e di a 327 nm. Calcolare la concentrazione di X eY nella miscela

28 Punto isosbestico Se in una reazione chimica una specie assorbente X viene convertita un unaltra specie assorbente Y e se gli spettri delle due specie si intersecano in un punto, qualsiasi spettro registrato durante tale reazione passerà per quel punto detto punto isosbestico Lesistenza del punto isosbestico è una buona prova del fatto che esistono solo due specie principali


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