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CORSO DI PERFEZIONAMENTO DIAGNOSTICA MICROBIOLOGICA: ATTUALITA’ E PROSPETTIVE Istituito con Decreto Rettorale n.985 del 2.8.2001 Evento ECM [50 crediti],

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1 CORSO DI PERFEZIONAMENTO DIAGNOSTICA MICROBIOLOGICA: ATTUALITA’ E PROSPETTIVE Istituito con Decreto Rettorale n.985 del Evento ECM [50 crediti], # Medici e Biologi e # [TSLB CORSO DI PERFEZIONAMENTO DIAGNOSTICA MICROBIOLOGICA: ATTUALITA’ E PROSPETTIVE Istituito con Decreto Rettorale n.985 del Evento ECM [50 crediti], # Medici e Biologi e # [TSLB] 2° Modulo – 28 settembre 2002 Rosanna Dei Rosanna Dei La tipizzazione intraspecifica

2 LA TIPIZZAZIONE INTRASPECIFICA GenereSpecie Variabilità entro la specie

3 LA TIPIZZAZIONE INTRASPECIFICA Variabilità all’interno della specie Variabilità all’interno della specie Rilevanza clinica fattori di virulenza/patogenicità sensibilità ai farmaci Rilevanza epidemiologica infezioni nosocomiali infezione esogena vs endogena fonte comune Rilevanza forense

4 LA TIPIZZAZIONE INTRASPECIFICA Variabilità all’interno della specie CaratterizzazioneCaratterizzazione l’isolato va qualificato ConfrontoConfronto gli isolati vanno comparati

5 TIPIZZAZIONE - metodi Grande varietà fenotipici / genotipicifenotipici / genotipici tradizionali / innovativitradizionali / innovativi one-set / two-setone-set / two-set Range di applicabilitàRange di applicabilità –Ristretto o allargato semplici / difficoltosi tutti i lab / centri di riferimento

6 TIPIZZAZIONE - metodi Valutazione Potere discriminantePotere discriminante ‘Tipabilità’ (typing ability, typeability)‘Tipabilità’ (typing ability, typeability) RiproducibilitàRiproducibilità FattibilitàFattibilità

7 TIPIZZAZIONE - metodi valutazione TIPIZZAZIONE - metodi valutazione Potere discriminante distinguere senza ambiguità isolati epidemiologicamente indipendentidistinguere senza ambiguità isolati epidemiologicamente indipendenti –Errore di tipo I Dare per uguali isolati diversiDare per uguali isolati diversi –Errore di tipo II Dare per diversi isolati ugualiDare per diversi isolati uguali

8 TIPIZZAZIONE - metodi valutazione TIPIZZAZIONE - metodi valutazione Potere discriminante numero di tipi ottenuti rispetto ai ceppi saggiatinumero di tipi ottenuti rispetto ai ceppi saggiati –tipizzazione fine fingerprinting non generalizzabilenon generalizzabile

9 Blanc DS et al. Molecular typing methods and discriminatory power. Clin Microbiol Infect 1998;4:61-63

10 TIPIZZAZIONE - metodi valutazione TIPIZZAZIONE - metodi valutazione C. difficile tipizzati per sensibilità fagica C. difficile tipizzati per sensibilità fagica Set FagiN° profiliN° resistenti Ref (6) 8194 Nuovi (12) R + N

11 TIPIZZAZIONE - metodi valutazione TIPIZZAZIONE - metodi valutazione Tipabilità risultato su ogni isolato esaminatorisultato su ogni isolato esaminato –frequenza non-tipizzabili

12 TIPIZZAZIONE - metodi valutazione TIPIZZAZIONE - metodi valutazione Riproducibilità lo stesso risultato in occasioni diverselo stesso risultato in occasioni diverse un ceppo –preparazioni diverse –la stessa preparazione ripetuta nella stessa o in prove successive Stabilità del carattere

13 TIPIZZAZIONE - metodi valutazione Fattibilità / robustezza Facilità di esecuzioneFacilità di esecuzione Disponibilità di reagenti,attrezzatureDisponibilità di reagenti,attrezzature RapiditàRapidità CostiCosti StandardizzabilitàStandardizzabilità Applicabilità ampiaApplicabilità ampia Lettura, elaborazione dei risultatiLettura, elaborazione dei risultati

14 TIPIZZAZIONE Confronto dei risultati Identità [criterio qualitativo]Identità [criterio qualitativo] Somiglianza [criterio quantitativo]Somiglianza [criterio quantitativo] Indici di somiglianza Elaborazione [cluster analysis]Elaborazione [cluster analysis] DendrogrammiDendrogrammi

15 TIPIZZAZIONE metodi tradizionali Su base fenotipicaSu base fenotipica –Fagi –Batteriocine –Antigeni –Profilo biochimico –Sensibilità agli antibiotici –Inibizione dello swarming, Proteus

16 TIPIZZAZIONE metodi tradizionali Fagi / Batteriocine Sensibilità degli isolati in esame ad un panello di fagi / batteriocineSensibilità degli isolati in esame ad un panello di fagi / batteriocine –passiva Produzione da parte degli isolati in esame di fagi / batteriocine e saggio su un pannello di indicatoriProduzione da parte degli isolati in esame di fagi / batteriocine e saggio su un pannello di indicatori –attiva

17 TIPIZZAZIONE metodi innovativi Su base genetica molecolareSu base genetica molecolare –DNA –RNA –Plasmidi –Proteine –Multi Locus Enzyme Electrophoresis –Pirolysis mass spectrometry

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22 Antibiogram typing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus with selected antibiotics was evaluated as a primary epidemiological typing tool and compared with ribotyping. Antibiograms were derived with the Kirby- Bauer disk diffusion method by using erythromycin, clindamycin, cotrimoxazole, gentamicin, and ciprofloxacin. For typing, antibiogram data were analyzed by similarity analysis of disk zone diameters (quantitative antibiogram typing). One hundred seventy-two isolates were typed. Reproducibility reached 98% for the quantitative antibiogram and 100% for ribotyping. With three selected restriction enzymes (EcoRV, HindIII, and KpnI), 40 epidemiologically unrelated isolates could be classified into 21 ribotypes, whereas quantitative antibiogram typing classified these isolates into 19 groups. To evaluate the discriminatory power of the methods, we calculated an index of discrimination from data obtained with these 40 isolates. This index takes into consideration both the number of types defined by the typing method and their relative frequencies. With both ribotyping and quantitative antibiogram typing, high discrimination indices (0.972 and 0.954, respectively) were obtained. When epidemiological links between patients (ward, period of hospitalization, and contacts between staff and patients) were compared with the results of ribotyping or the quantitative antibiogram typing method, it appeared that both methods were able to discriminate epidemiological clusters, with only a few discrepancies. In conclusion, quantitative antibiogram typing, although not necessarily based on genomic markers, is a simple method which enables a reliable workup of methicillin-resistant S. aureus epidemic when sophisticated molecular typing methods are not available. Blanc DS et al. J Clin Microbiol 1994;32:2505-9Antibiogram typing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus with selected antibiotics was evaluated as a primary epidemiological typing tool and compared with ribotyping. Antibiograms were derived with the Kirby- Bauer disk diffusion method by using erythromycin, clindamycin, cotrimoxazole, gentamicin, and ciprofloxacin. For typing, antibiogram data were analyzed by similarity analysis of disk zone diameters (quantitative antibiogram typing). One hundred seventy-two isolates were typed. Reproducibility reached 98% for the quantitative antibiogram and 100% for ribotyping. With three selected restriction enzymes (EcoRV, HindIII, and KpnI), 40 epidemiologically unrelated isolates could be classified into 21 ribotypes, whereas quantitative antibiogram typing classified these isolates into 19 groups. To evaluate the discriminatory power of the methods, we calculated an index of discrimination from data obtained with these 40 isolates. This index takes into consideration both the number of types defined by the typing method and their relative frequencies. With both ribotyping and quantitative antibiogram typing, high discrimination indices (0.972 and 0.954, respectively) were obtained. When epidemiological links between patients (ward, period of hospitalization, and contacts between staff and patients) were compared with the results of ribotyping or the quantitative antibiogram typing method, it appeared that both methods were able to discriminate epidemiological clusters, with only a few discrepancies. In conclusion, quantitative antibiogram typing, although not necessarily based on genomic markers, is a simple method which enables a reliable workup of methicillin-resistant S. aureus epidemic when sophisticated molecular typing methods are not available. Blanc DS et al. J Clin Microbiol 1994;32:2505-9

23 Evaluation of the discriminatory powers of the Dienes test and ribotyping as typing methods for Proteus mirabilis. Pfaller MA, Mujeeb I, Hollis RJ, Jones RN, Doern GV. A total of 63 clinical isolates of Proteus mirabilis collected over a 19-month period were typed by the Dienes test and ribotyping. Ribotyping was performed using the fully automated RiboPrinter Microbial Characterization System (Qualicon, Wilmington, Del.). Isolates that were indistinguishable by the Dienes test and/or ribotyping were characterized further by pulsed- field gel electrophoresis (PFGE). Most of the isolates represented unique strains as judged by the Dienes test and ribotyping. Forty isolates represented 40 different ribotypes and Dienes types. The remaining 23 isolates were grouped into 13 Dienes types, 12 ribotypes, and 14 PFGE types. The index of discrimination was for the Dienes test, for ribotyping, and for PFGE. Both the Dienes test and ribotyping are useful methods for identifying individual strains of P. mirabilis. The Dienes test is simple, inexpensive, and easy to perform. It can be performed in virtually any laboratory and should be used in the initial epidemiologic characterization of P. mirabilis isolates. J Clin Microbiol 2000 Mar;38(3):

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