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FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA TECNICHE ANALITICHE SEPARATIVE Le tecniche analitiche si dividono in due grandi famiglie: tecniche separative.

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1 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA TECNICHE ANALITICHE SEPARATIVE Le tecniche analitiche si dividono in due grandi famiglie: tecniche separative e tecniche identificative. Le tecniche separative hanno come primo obbiettivo la separazione degli analiti nel campione. Sono impiegate quando i campioni sono molto complessi. La identificazione è affidata a tecniche di rivelazione adatte (es: spettrofotometria, spettrometria di massa).

2 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA GAS CROMATOGRAFIA (GC)

3 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA FASI STAZIONARIE PER GLC

4 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA I tempi di ritenzione crescono con il logaritmo dell’abbassamento di temperatura della colonna TEMPERATURA PROGRAMMATA IN GLC

5 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA RIVELATORI PER GC

6 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Metodi di cromatografia liquida Criteri in base alla struttura e proprietà chimiche degli analiti

7 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA IL SISTEMA HPLC Contenitori dei solventi che costituiscono la fase mobile miscelatore pompa sistema di introduzione del campione precolonna e colonna rivelatore computer raccoglitore di frazioni

8 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA IL SISTEMA HPLC I componenti fondamentali del sistema HPLC sono: una pompa che regola e mantiene costante il flusso della fase mobile. Poiché la fase stazionaria è costituita da particelle di diametro micrometrico impaccate, il flusso della fase mobile attraverso la fase stazionaria richiede un’elevata pressione; un sistema di introduzione del campione; una colonna contenente la fase stazionaria. Può essere presente una precolonna (o colonna di guardia) che riduce la quantità della matrice del campione che entra nella colonna analitica. La colonna può essere termostatata per migliorare la riproducibilità della separazione; un rivelatore che evidenzia, mediante segnali elettrici, gli analiti che eluiscono dalla colonna.

9 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA CROMATOGRAFIA LIQUIDA SU COLONNA I tipi di cromatografia liquida su colonna possono essere classificati in base alla natura del processo di separazione: cromatografia di adsorbimento : la fase stazionaria è un adsorbente e la separazione è basata su un susseguirsi di stadi di adsorbimento e desorbimento. cromatografia di ripartizione : la separazione è basata sulla ripartizione tra fase mobile e fase stazionaria, entrambe liquide. cromatografia di scambio ionico : la separazione è basata sull’ interazione ionica tra fase stazionaria ed analiti. cromatografia di esclusione dimensionale : la separazione è basata sulle dimensioni relative degli analiti.

10 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA CROMATOGRAFIA DI SCAMBIO IONICO La fase stazionaria presenta gruppi ionici sulla superficie, di carica opposta rispetto a quella degli analiti. Questa tecnica viene utilizzata per analiti di tipo ionico o ionizzabili. Quanto è più forte la carica del campione, tanto più verrà trattenuto all’interno della colonna. La fase mobile è un tampone acquoso in cui il pH e la concentrazione vengono regolati per controllare il tempo di eluizione degli analiti flusso

11 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA La separazione è basata sulla dimensioni e massa molecolari degli analiti. La fase stazionaria è costituita da materiale di porosità controllata. Le molecole grandi eluiscono prima di quelle piccole. Infatti le molecole che sono troppo grandi per entrare nei pori della fase stazionaria hanno un percorso più breve nella colonna, rispetto a quelle che entrano nei pori. La porosità della fase stazionaria può essere controllata per ottenere la separazione di molecole in uno specifico intervallo di dimensioni. CROMATOGRAFIA DI ESCLUSIONE DIMENSIONALE (SEC) flusso

12 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA CROMATOGRAFIA DI ADSORBIMENTO La fase stazionaria è un solido. La separazione è dovuta all’alternarsi di fenomeni di adsorbimento e desorbimento. CROMATOGRAFIA DI RIPARTIZIONE La fase stazionaria è un liquido. La separazione è basata sulla partizione degli analiti tra la fase stazionaria e la fase mobile (solubilità relativa). Le specie che hanno più affinità per la fase stazionaria rispetto alla fase mobile saranno maggiormente ritenute. flusso

13 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA CROMATOGRAFIA DI RIPARTIZIONE/ADSORBIMENTO Spesso non è possibile definire in maniera chiara se la separazione degli analiti avvenga in base ad un processo di adsorbimento o di ripartizione, ovvero entrambi. Si parla quindi di cromatografia di adsorbimento/ripartizione, che viene suddivisa, in base alle polarità relative delle due fasi: Cromatografia in fase normale : la fase stazionaria è polare (ad es. silice), la fase mobile è non polare (ad es. n-esano o tetraidrofurano). I campioni polari vengono trattenuti nella colonna più a lungo di quelli non polari o poco polari. Cromatografia in fase inversa (RP) : la fase stazionaria è non polare (idrocarburo), la fase mobile è polare (ad es. acqua o alcol). I campioni poco o non polari vengono trattenuti nella colonna più a lungo di quelli polari. Utilizzando uno o l’altro metodo, l’ordine di eluizione dei composti si inverte, anche se non sempre in maniera esattamente speculare. FASE NORMALE E IN FASE INVERSA

14 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA FASE STAZIONARIA In cromatografia liquida di adsorbimento, la fase stazionaria è un solido poroso. In cromatografia liquida di partizione si utilizza una fase stazionaria liquida, che riveste la superficie delle particelle di supporto. La fase stazionaria liquida è oggi costituita da una fase stabile chimicamente legata alla supporto, detta bonded phase (BP). Il supporto (o matrice) è generalmente costituito da silice: i gruppi OH della silice (silanoli) vengono utilizzati per legare chimicamente la fase stazionaria. Le fasi legate possono essere polari (ad es. con un ammino gruppo o un ciano gruppo), utilizzate in fase normale; oppure apolari (ad es. con una catena alchilica, come quella octadecilica, C18), usate in fase inversa. CROMATOGRAFIA DI RIPARTIZIONE/ADSORBIMENTO

15 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA FASE MOBILE IN CROMATOGRAFIA LIQUIDA In tutti i tipi di cromatografia liquida, tranne quella di esclusione dimensionale, la fase mobile gioca un ruolo fondamentale nella separazione. E’ possibile utilizzare un solvente singolo, tuttavia molto spesso è necessario utilizzare una miscela di due o più solventi per ottenere la fase mobile di composizione ottimale. Durante l’analisi è possibile effettuare un’eluizione isocratica (mantenendo costante la composizione della fase mobile) o un’eluizione in gradiente (la composizione della fase mobile varia durante l’analisi). L’eluizione in gradiente viene utilizzata quando la miscela di analiti comprende composti di caratteristiche molto diverse tra loro e serve per migliorare la separazione e ridurre i tempi di analisi.

16 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA SCELTA DELLA FASE MOBILE La scelta dei solventi da utilizzare per la fase mobile dipende dal tipo di cromatografia: nella cromatografia di adsorbimento/ripartizione la polarità dei solventi è il parametro più importante; nella cromatografia a scambio ionico sono importanti il pH e la forza ionica; nella cromatografia ad esclusione dimensionale deve essere considerata la solubilità degli analiti nella fase mobile ed il suo effetto sulle dimensioni e l’arrangiamento sterico delle molecole degli analiti.

17 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Non tutti i solventi possono essere utilizzati in HPLC. Devono infatti possedere queste caratteristiche: devono essere miscelabili in diverse proporzioni non devono interagire chimicamente con gli analiti o gli altri solventi non devono alterare la risposta del rivelatore (ad es. assorbire significativamente all’UV) devono avere una bassa viscosità devono essere poco tossici e poco infiammabili devono essere non troppo costosi La fase mobile più comune in HPLC a fase inversa (RP-HPLC) è costituita da acqua miscelata con metanolo, acetonitrile, oppure tetraidrofurano (THF). SCELTA DELLA FASE MOBILE

18 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA LA COLONNA CROMATOGRAFICA Le dimensioni della colonna vengono scelte in modo da raggiungere il miglior compromesso in funzione di: capacità di carico, consumo di solventi, risoluzione desiderata e velocità dell’analisi. Le tipiche colonne cromatografiche analitiche sono lunghe cm, hanno diametro interno di 2-5 mm e sono riempite con materiali a granulometria di 5-10 m. Le colonne più moderne (per cromatografia ad alta velocità) sono lunghe 3-5 cm e sono riempite con materiali di 3-5 m. Sono inoltre disponibili colonne microbore di lunghezza 25 cm, diametro interno di 1 mm e materiali di 10 m. Le colonne cromatografiche preparative sono lunghe almeno 25 cm ed hanno diametro interno di almeno 7.

19 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA SCELTA DELLA FASE STAZIONARIA

20 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Rivelatori per cromatografia liquida HPLC a Tipo: S: selettivo; G: generale

21 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Accoppiamento cromatografia/MS Caratteristiche di un rivelatore ideale per cromatografia 1.Non alterare la risoluzione cromatografica, ossia non produrre nel rivelatore una miscela dei composti separati. 2.Avere la massima sensibilità possibile. 3.Essere universale, cioè rivelare tutti i composti eluiti. 4.Fornire quante più informazioni possibile sulla struttura dei composti eluiti, per permetterne l’identificazione. 5.Essere selettivo, cioè consentire l’identificazione dell’analita in miscela. 6.Dare un segnale proporzionale alla concentrazione. 7.Avere un fattore di risposta costante, o quantomeno prevedibile. 8.Non danneggiare i prodotti. 9.Non produrre artefatti. 10.Consentire la deconvoluzione dei picchi cromatografici, ossia la scomposizione dei picchi non risolti nei solo componenti. 11.Avere il più basso rapporto costi/prestazioni possibile.

22 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Schema di uno spettrometro di massa Sistema di introduzione Sorgente di ioni Analizzatore di massa Sistema di vuoto Rivelatore SegnaleComputer Campione torr Campione Ioni

23 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Componenti di uno spettrometro di massa Sistema di introduzione del campioneSistema di introduzione del campione –Consente di trasferire il campione dal suo stato originario (solido, liquido o gassoso) ad una forma adatta alla ionizzazione. Sistema di ionizzazioneSistema di ionizzazione –E’ il dispositivo in cui si formano gli ioni gassosi degli analiti o di loro frammenti Analizzatore di massaAnalizzatore di massa –E’ un dispositivo che separa gli ioni gassosi in base al loro rapporto m/z, nello spazio (ossia deviandoli su diverse traiettorie) o nel tempo (ossia facendo loro percorrere la stessa traiettoria in tempi diversi).

24 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Componenti di uno spettrometro di massa RivelatoreRivelatore –E’ un dispositivo che consente di misurare la quantità di ioni che emergono dall’analizzatore di massa, convertendone l’energia cinetica in corrente elettrica. Sistema di controllo e di acquisizione del segnaleSistema di controllo e di acquisizione del segnale –Controlla l’introduzione del campione, le modalità di ionizzazione, i parametri di lavoro dell’analizzatore e registra il segnale acquisito dal rivelatore Sistema da vuotoSistema da vuoto –Deve avere un’efficienza sufficiente a ridurre la pressione del campione in ingresso da 1 atm a quella richiesta nell’analizzatore.

25 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Sistemi di introduzione del campione Sistemi a carica (off line) –Il campione viene volatilizzato termicamente ed inviato nella zona di ionizzazione. Sistemi a sonda –Per solidi, liquidi non volatili e per campioni in piccole quantità Sistemi per iniezione diretta (o per FIA) –Per inviare campioni liquidi ad interfacce a flusso (es. elettrospray) Sistemi cromatografici (GC, LC), CE. –Interfaccia online con sistemi a flusso

26 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Interfacciamento GC/MS Queste sorgenti sono adatte all’interfacciamento con la gascromatografia, purché il flusso di fase mobile sia compatibile con la MS GC con colonne impaccate: ~ 20 cm 3 min -1 GC con colonne capillari: ~ 1 cm 3 min -1 (accettabile per la MS) Stato del campioneSorgente GassosoIonizzazione elettronica (EI) Ionizzazione chimica (CI)

27 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA GC/MS a iniezione diretta Colonna GC capillare all’analizzatore di massa Lenti Camera di ionizzazione Colonna GC capillare: d ~ 250 µm L ~ 25 m F ~ 1-2 cm 3 min -1

28 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA GC/MS con iniettore jet-orifice Si basa sulla diversa direzione in cui nebulizzano molecole di massa atomica diversa. Il gas di trasporto (di solito He) diffonde più rapidamente dell’analita, che viene quindi arricchito. vuoto Sorgente ionica all’analizzatore di massa GC apertura di ~ 50 µm

29 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA GC/MS open-split con gas di spurgo Un flusso di gas (He) impedisce all’analita eluito di ossidarsi a contatto con l’aria (O 2 ) Vantaggio: facile cambiare la colonna Svantaggio: non arricchisce il campione

30 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Schema di uno spettrometro di massa Sistema di introduzione Sorgente di ioni Analizzatore di massa Sistema di vuoto Rivelatore SegnaleComputer Campione torr Campione (gassoso) Ioni

31 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Sorgenti ioniche Per GC:Impatto elettronico (EI) Ionizzazione chimica (CI) Per LC:Elettrospray – nanospray APCI (atmospheric pressure chemical ionization) APPI (atmospheric pressure photoionization) MALDI (off line)

32 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Classificazione delle sorgenti ioniche Sorgenti “dure” (elevata frammentazione) –Impatto elettronico Sorgenti “molli” (bassa frammentazione) –Ionizzazione chimica –Desorbimento (MALDI, elettrospray) –Fotoionizzazione

33 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Sorgente di ionizzazione elettronica Anodo All’analizzatore di massa Fenditura di prima accelerazione Fenditura di focalizzazione Fenditura di prima accelerazione Regione di ionizzazione Vuoto Riscaldatore e catodo Regione di accelerazione degli ioni (ddp = V) Flusso di molecole in ingresso Riflettore

34 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Meccanismo di ionizzazione per EI Un fascio di elettroni viene generato da un filamento riscaldato di W o Re ed accelerato da una d.d.p. di ~70V. Il fascio di elettroni investe il fascio di molecole del campione a 90°. I prodotti primari dell’interazione fra elettroni e molecole (“collisione”) sono ioni positivi a carica unitaria (ioni molecolari, M + ), che si formano per repulsione elettrostatica: M + e -  M+ + 2e - M+ è uno ione radicale. Siccome per ionizzare una molecola organica sono sufficienti circa 10 eV, l’eccesso di energia viene trasferito alla molecola e provoca la frammentazione.

35 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Lo spettro di massa Spettro di massa di frammentazione Spettro semplificato del pentano CH 3 CH 2 CH 2 CH 2 CH 3

36 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Sorgente per EI/CI Si impiega la stessa strumentazione della EI, con lievi modifiche. Le molecole del campione vengono ionizzate per collisione con gli ioni di un gas reagente, a sua volta ionizzato per EI. La zona di ionizzazione chimica viene tenuta ad una pressione maggiore (~ 60 Pa) per rendere abbastanza frequenti gli urti fra molecole dell’analita e ioni primari generati in sorgente.

37 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Meccanismo di ionizzazione chimica Le molecole del campione vengono ionizzate per collisione con gli ioni di un gas reagente, ionizzato per impatto elettronico. È possibile generare anche ioni negativi per cattura di elettroni “lenti”. Si impiega la strumentazione della EI, opportunamente modificata. Nella zona di ionizzazione il gas reagente viene mantenuto alla pressione di circa 1 torr. Il gas impiegato più comunemente è CH 4 : CH 4 + e -  CH e - EI del gas di ionizzazione CH 4+ + CH 4  CH CH 3 Trasferimento di un protone CH CH 4  C 2 H H 2 Reazioni ione-molecola CH XH  XH CH 4 C 2 H XH  XH C 2 H 4 C 2 H XH  X + + C 2 H 6 Lo ione generato può avere massa M+1, M+2, M-1 o anche M+29 (+C 2 H 5 ).

38 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Sorgenti ioniche Stato del campioneSorgenti a flusso LiquidoElettrospray – nanospray APCI ( atmospheric pressure chemical ionization ) APPI ( atmospheric pressure photoionization ) LC: flussi ~ 0.1 – 1 cm 3 min -1. Se l’eluente è acqua, 0.1 cm 3 min -1 = 5.6 mmol min -1 = 135 cm 3 min -1 (c.n.) Nano-HPLC: flussi ~ cm 3 min -1  0.1 cm 3 min (c.n.)

39 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Meccanismo fisico dell’elettrospray L’applicazione di un potenziale elettrico ad alto voltaggio ad una goccia di liquido ne provoca la frammentazione in goccioline fini. La causa e’ la repulsione elettrostatica tra le cariche che si generano nella goccia.

40 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Cono di Taylor Cono di Taylor Punta dell’ago

41 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Ago cavo per elettrospray Campione Liquido di trasporto Gas di trasporto Cono di Taylor Capillare riscaldato Gas di desolvatazione 2-6 kV + - Gocce di circa 1 µm

42 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Nanospray con geometria “a Z” Accoppiamento nanoHPLC-MS

43 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA L’elettrospray genera spettri multicarica m/z La carica degli ioni è dovuta agli ioni metallici (es Na + ) o ai protoni associati alla molecola. Gli addotti carichi sono quindi della forma: (M + H) +, (M + 2H) 2+, …, (M + nH) n+

44 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Ionizzazione chimica a pressione atmosferica LC-APCI/MS

45 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Ionizzazione chimica a pressione atmosferica Sorgente ionica analoga alla CI, in cui la ionizzazione avviene per reazioni ione-molecola a pressione atmosferica Gli ioni primari vengono generati a pressione atmosferica mediante scariche a corona nel solvente nebulizzato o mediante emissione β -. Si applica a molecole ioniche o polari, di massa molare fino a circa Può funzionare sia in modalità positiva che negativa genera prevalentemente ioni monocarica.

46 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA ESI vs APCI - Sensibilità Sensibilità relativa Flusso (µL/min) La ESI è sensibile alla concentrazione dell’analita, la APCI alla sua quantità. Per questo la ESI si presta ad essere accoppiata alla micro e nano HPLC.

47 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Sorgente ionica a fotoionizzazione

48 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Sorgente ionica a fotoionizzazione Sorgente ionica a pressione atmosferica (APPI) di recente introduzione Una lampada UV a Kr emette fotoni di energia ~ 10 eV. L’energia dei fotoni è tale da ionizzare selettivamente un’ampia classe di molecole organiche, senza ionizzare il solvente. È adatta a molecole piccole e poco polari, che sono difficilmente ionizzabili con altri metodi. È una sorgente estremamente soft, e rappresenta un’alternativa alla APCI e alla ESI per la ionizzazione a pressione atmosferica.

49 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Applicabilità delle sorgenti API

50 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Schema di uno spettrometro di massa Sistema di introduzione Sorgente di ioniAnalizzatore di massa Sistema di vuoto Rivelatore SegnaleComputer Campione torr Campione (gassoso) Ioni

51 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Analizzatore di massa Intervallo di m/z : indica i valori minimo e massimo di m/z degli ioni che l’analizzatore è in grado di selezionare (determina l’applicabilità per un certo problema analitico). Potere risolutivo: indica la capacità di un analizzatore di distinguere due ioni con rapporti m/z simili tra loro (determina le prestazioni nell’analisi qualitativa). Efficienza di trasmissione: percentuale degli ioni selezionati che raggiungono il rivelatore dopo avere attraversato l’analizzatore, senza venire dispersi (determina le prestazioni nell’analisi quantitativa). Caratteristiche di un analizzatore di massa

52 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Risoluzione La capacità di uno spettrometro di massa di differenziare le masse è generalmente espressa dalla risoluzione R definita come : R = m/Δm dove Δm è la differenza di massa tra due picchi adiacenti risolti e m è la massa nominale del primo picco (o la media delle masse dei due picchi). Due picchi sono considerati risolti se l’altezza della valle tra di essi è inferiore ad una certa percentuale dell’altezza del picco meno intenso (di solito il 10%). Uno spettrometro con una risoluzione di risolverà due picchi con valori di m/z 400,0 e 400,1 (o di 40,00 e 40,01). Gli spettrometri commerciali hanno R che variano circa tra 500 e

53 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Classi di analizzatori di massa A settore magnetico A doppia focalizzazione A quadrupolo (lineare) Trappola ionica a quadrupolo A tempo di volo

54 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Analizzatore a settore magnetico 1 2 B V + m, z Rivelatore Lo spettro si registra facendo una scansione di V o di B. La scansione di V permette di usare magneti permanenti per la generazione del campo B. Normalmente gli strumenti commerciali sono a scansione di V. Di solito la sorgente è a EI o CI torr Ioni più pesanti Ioni più leggeri Schermo metallico 60, 90 o 180° R < 2000, perché gli ioni entrano nel settore magnetico con una distribuzione di energie cinetiche, e quindi di velocità. Spettrometro di massa a focalizzazione semplice

55 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Analizzatore elettrostatico E + m, z r Energia cinetica V Forza centripeta Per potere attraversare la fenditura, gli ioni devono avere una determinata velocità. L’analizzatore elettrostatico non è un analizzatore di massa, ma un filtro di velocità, per cui viene utilizzato in combinazione con un analizzatore di massa per aumentarne la risoluzione.

56 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Doppia focalizzazione Campo magnetico + – – – + + m/z Campo elettrico Punto di doppia focalizzazione (Rivelatore) Risoluzioni (m/Δm) fino a al 10% dell’altezza di picco) Piano focale delle energie Piano focale delle velocità Spettrometro di Nier-Jonson

57 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Analizzatore di massa a quadrupolo Potenziale nel quadrupolo

58 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Campo “a sella” del quadrupolo Al centro del quadrupolo lo ione si trova in un potenziale elettrico a sella, che ruota alla frequenza del campo a RF. L’energia dello ione viene continuamente convertita da cinetica a potenziale e viceversa. Lo ione assume quindi un moto oscillatorio attorno alla posizione di equilibrio (sull’asse del quadrupolo), con una frequenza ed un ampiezza di oscillazione che dipendono dalla frequenza e ampiezza del campo, dalla massa e dalla carica dello ione.

59 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Traiettorie dello ione piano xz piano yz piano xz piano yz Traiettoria instabile lungo x, stabile lungo y Traiettoria stabile sia lungo x che lungo y

60 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Analizzatore di massa a quadrupolo Massimo valore m/z ~ Risoluzione ~ –I quadrupoli sono strumenti a bassa risoluzione –Si lavora normalmente alla risoluzione di una unità di massa. Leggero, di dimensioni contenute Facile da accoppiare alla cromatografia Efficiente trasmissione degli ioni Necessaria una elevata precisione nell’allineamento delle barre degli elettrodi

61 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Classi di analizzatori di massa A settore magnetico A doppia focalizzazione A quadrupolo (lineare) Trappola ionica a quadrupoloTrappola ionica a quadrupolo A tempo di volo

62 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Trappola ionica a quadrupolo Processore di scansione Generatore di RF Rivelatore Generatore supplementare di RF Elettrodo a calotta (end-cap) Elettrodo ad anello Filamento

63 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Traiettorie ioniche nella trappola a quadrupolo Moto degli ioni in direzione z Moto degli ioni in direzione r tempo Gli ioni vengono intrappolati forzandoli su traiettorie chiuse stabili all’interno della trappola. Quando la traiettoria di uno ione diventa instabile, questo esce dalla trappola e viene rivelato.

64 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Classi di analizzatori di massa A settore magnetico A doppia focalizzazione A quadrupolo (lineare) Trappola ionica a quadrupolo A tempo di voloA tempo di volo

65 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Analizzatore a tempo di volo (TOF) Ioni positivi Sorgente L d Zona di accelerazione con campo elettrostatico E V = 0 dE = V 0 = V V = V 0 Tempo di volo

66 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA API – QqTOF MS/MS Ottica di trasferimento Quadrupolo (ponte ionico) Esapolo (ponte ionico) Cono di campionamento

67 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Analizzatore di massa a tempo di volo Massimo valore m/z > Risoluzione fino a – Il reflectron consente di: –Ridurre le dimensioni –Aumentare la risoluzione Ideale accoppiamento con sorgenti pulsate Efficiente trasmissione degli ioni

68 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Schema di uno spettrometro di massa Sistema di introduzione Sorgente di ioni Analizzatore di massa Sistema di vuoto Rivelatore SegnaleComputer Campione torr Campione (gassoso) Ioni

69 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Rivelatori di ioni Lastre fotografiche –Ad AgBr. Sono state i primi rivelatori di ioni Coppa di Faraday –Un semplice elettrodo collettore schermato –Economico, poco sensibile Rivelatori a scintillazione –A cristalli di materiale fosforescente Moltiplicatori di elettroniMoltiplicatori di elettroni –A dinodi separati –A dinodo continuo

70 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Doppia spettrometria di massa (MS/MS) Ionizzazione e frammentazione analisi di massa m/z decomposizione m1m1 analisi di massa m/z m1m1

71 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Applicazioni della MS/MS Maggior contenuto di informazioni Studio della struttura –Informazioni addizionali per determinare la struttura di uno ione Rivelazione selettiva di uno ione –Drastica riduzione delle interferenze Studio delle reazioni ione-molecola

72 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Tandem MS - nomenclatura Corrente ionica totale (total ion current, TIC) 1. (dopo l’analisi di massa): La somma di tutte le correnti ioniche trasportate dagli ioni che contribuiscono allo spettro di massa (detta anche corrente ionica ricostruita). È la somma di tutte le correnti di monitoraggio di ioni singoli (single ion monitoring, SIM) 2. (prima dell’analisi di massa): La somma di tutte le correnti ioniche relative a ioni dello stesso segno, prima dell’analizzatore di massa (il rivelatore è posto tra la sorgente e l’analizzatore di massa).

73 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Tandem MS - nomenclatura Ione molecolare: ione formato per addizione o rimozione di uno o più elettroni dalla molecola dell’analita. Per definizione è lo ione che contiene l’isotopo più abbondante di tutti gli elementi coinvolti (per ragioni statistiche, non sempre dà il picco più intenso). Ione addotto: ione formato dall’interazione di due specie, contenente tutti gli atomi di una di esse e uno o più atomi dell’altra. Ione pseudomolecolare: ione formato dalla molecola dell’analita per sottrazione di un protone (M – H) - o di uno ione idruro (M + H) +, o per formazione di un addotto con uno uno ione presente nel plasma di ionizzazione. Da questi ioni è possibile ricavare la massa molare dell’analita.

74 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Tandem MS - nomenclatura Ione precursore: (ione genitore) uno ione che subisce una decomposizione o una variazione di carica. Ione prodotto: (ione figlio) ione formato da una qualsiasi reazione dello ione precursore. Ione frammento: ione formato dalla frammentazione dello ione precursore. Perdita neutra: specie neutra formata dalla frammentazione di uno ione precursore. Spettro della sorgente: spettro ottenuto con un singolo analizzatore.

75 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA MS/MS nello spazio e nel tempo MS/MS nello spazio MS/MS nel tempo Scansione dello ione prodotto Cella di collisione Tempo 1Tempo 2Tempo 3 Scansione Selezione m/z

76 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Modalità di scansione MS/MS Scansione dello ione prodotto Scansione Selezione m/z Scansione dello ione precursore Scansione Selezione m/z Scansione di perdita neutra Monitoraggio di reazione selezionata Scansione m/z = x Scansione m/z = x-a Selezione del precursore m/z = a Selezione del frammento m/z = b Analizzatore di massa fisso Spettrometro di massa a scansione Scansione dello ione prodotto Scansione dello ione precursore Scansione di perdita neutra Monitoraggio di reazione selezionata Simbolismo alternativo

77 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Modalità di scansione MS/MS 1.Scansione dello ione prodotto: consiste nel selezionare uno ione precursore, di m/z fissato, e nella determinazione di tutti gli ioni prodotti dalla frammentazione attivata per collisione (CID). Se nella cella di collisione si usa un gas reagente, si osservano i prodotti di reazione attivate per collisione (CAR). Quando vengono prodotti solo ioni frammento, questa modalità di scansione è detta anche scansione di ioni frammento. 2.Scansione dello ione precursore: consiste nello scegliere uno ione prodotto e nel determinare gli ioni precursori. Permette di identificare gli ioni precursori di un certo frammento. Questa modalità di scansione, che non si può realizzare con la in time MS/MS, richiede la focalizzazione del secondo analizzatore su di uno ione selezionato, e la scansione di massa sul primo analizzatore. Vengono rivelati gli ioni precursori che per reazione o frammentazione producono ioni figlio della massa selezionata.

78 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Modalità di scansione MS/MS 3.Scansione di perdita neutra (NLS): consiste nello scegliere un frammento neutro e nel rivelare tutte le frammentazioni che portano alla perdita di tale frammento. Come nel caso della scansione dello ione precursore, questa modalità non è realizzabile in MS/MS nel tempo. La scansione richiede che entrambi gli analizzatori scandiscano contemporaneamente, ma con una differenza di massa fissa a fra di loro. Quando uno ione di massa m attraversa il primo analizzatore, viene rivelato solo se produce un frammento di massa m – a. 4.Monitoraggio di reazioni selezionate (SRM): consiste nel selezionare una reazione di frammentazione. In questa modalità, entrambi gli analizzatori sono focalizzati su masse selezionate. Non si ha quindi scansione. È analogo al “monitoraggio di ioni selezionati” in spettrometria di massa singola, ma in questo caso gli ioni selezionati dal primo analizzatore danno un segnale solo se producono un certo frammento mediante una certa reazione. L’assenza di scansione permette di aumentare la sensibilità, oltre che la selettività.

79 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Combinazioni strumentali per MS/MS MS/MS nello spazio Settori elettrico-magnetico: EB/EB o BE/BE (max MS 4 ). Triplo quadrupolo: QqQ Tempo di volo lineare/reflectron: TOF/TOF. Combinati: Combinati: EBqQ QqTOF MS/MS nel tempo (MS n ) Trappola ionica a quadrupolo (max MS 8 ) Risonanza ciclotronica (ICR FTMS) Combinati: Combinati: Qq(trap) MS n nello spazio e/o nel tempo

80 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Analisi qualitativa Criteri stabiliti dalla CE per la prevenzione dei falsi positivi Il sistema prevede un punteggio per ogni identificazione, e sono richiesti 3 punti per confermare un risultato positivo. Inoltre, le intensità relative degli ioni registrati non devono scostarsi più del 20% rispetto a quelle ottenute da uno standard, e i tempi di ritenzione di non più del 2.5%.

81 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Analisi quantitativa Confronto fra le sensibilità di diverse modalità di MS e MS-MS. Analisi di naftalene-1,5-disolfonato in ESI -

82 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA GC-QMS di ormoni steroidei Cromatogramma ottenuto dall’analisi “spazio di testa-SPME-GC-MS” di un campione di acqua di fiume in entrata ad un depuratore. Condizioni sperimentali: colonna GC: BD-5MS, 30mx0,25 mm I.D., spessore del film: 0,25μm. Analizzatore di massa: singolo quadrupolo operante in modalità SIM. nonilfenolo acido nonilfenossiacetico acido nonilfenossietossiacetico nonilfenolo dietossilato nonilfenolo monoetossilato

83 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA GC-MS con iniezione “purge and trap” (PTI) Diagramma a blocchi del sistema per l’analisi on-line PTI-GC-MS di campioni di acqua e neve.

84 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Sistema di iniezione PTI STEP 1STEP 2 Sistema di introduzione del campione “Purge and Trap”. Step 1: caricamento del campione. Step 2: fase di estrazione (purge). (a) contenitore di vetro, (b) ago fisso, (c) tubicino collegato all’ago che termina sul fondo del contenitore, usato per l’introduzione e la rimozione del campione (d) setto poroso.

85 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Analisi di idrocarburi alogenati Cromatogramma di un campione di acqua di rete ottenuto mediante PTI-GC-MS, operante in modalità SIM. 1) cloroformio; 2) 1,1,1-tricloroetano; 3) tetraclorometano; 4) 1,1,2-tricloroetilene; 5) bromodiclorometano; 6) dibromoclorometano; 7) tetracloroetilene; 8) bromoformio. Volume del campione 10 mL; tempo di purge 10 min; temperatura della trappola per l’umidità -10°C; temperatura della trappola fredda -100°C; temperatura del forno: temperatura iniziale 10°C, tempo iniziale 1,50 min; gradiente 40°C/min, temperatura finale 120°C, tempo finale 1,25 min.

86 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Fast GC-MS Confronto tra cromatogrammi acquisiti rispettivamente a 500 e 50 spettri per secondo. Condizioni sperimentali: colonna capillare: OV-1, 0,3mX50μm I.D., 0,17 df. Analizzatore di massa: TOF, operante nell’intervallo di m/z Composti: 1) pentano, 2) 2,3- dimetilbutano, 3) esano, 4) benzene, 5) eptano, 6) metilcicloesano, 7) toluene, 8) ottano.

87 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Tecniche separative per classi di composti Correlazione tra le proprietà dell’analita e la tecnica separativa più appropriata.

88 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA MS per classi di composti Correlazione tra le proprietà dell’analita e la modalità di ionizzazione a pressione atmosferica più appropriata

89 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA LC/MS di composti fortemente acidi Spettro ESI + di una soluzione di Na 2 EDTA in presenza di vari metalli. La miscela può essere preventivamente separata in cromatografia ionica per ridurre eventuali interferenze.

90 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA LC/MS di acidi deboli Cromatogrammi e transizioni impiegate per la MRM di una miscela di tannini. La MRM permette di distinguere oligomeri non risolti cromatograficamente. Trigalloil glucosio Digalloil glucosio Monogalloil glucosio Acido elagico Acido gallico

91 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA LC/MS di composti basici RPLC-APCI-MS di una miscela di composti di alchilstagno. La LC/MS permette l’identificazione dei composti, che saranno poi determinati con maggiore sensibilità in LC-ICP-MS a.Difenilstagno b.Dibutilstagno c.Trifenilstagno d.Tributilstagno 50 mg/L 10 µg/L

92 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Classi di inquinanti emergenti

93 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Diffusione degli inquinanti emergenti Frequenza di rivelazione (A) e percentuale rispetto alla concentrazione totale misurata (B) di contaminanti di acque di scarico facenti parte della categoria di uso generale. Il numero di composti per ogni categoria è riportato sopra la barra.

94 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Metodi LC-MS per classi di composti Rassegna dei metodi LC-MS impiegati nell’analisi quantitativa di farmaci per uso umano e veterinario

95 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Metodi LC-MS per classi di composti

96 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Metodi LC-MS per classi di composti

97 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA Metodi LC-MS per classi di composti

98 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA LC-MS-MS di ormoni steroidei Spettri full-scan MS-MS ed ipotetiche strutture chimiche del precursore (riquadro a tratto continuo) e degli ioni prodotto (riquadro tratteggiato) ottenuti per infusione dell’estrone (sopra) e dell’estradiolo (sotto) in APCI(PI)-MS-MS.

99 FACOLTA’ DI SCIENZE FF.MM.NN. - CHIMICA ANALITICA LC-MS di antibiotici in campioni solidi Cromatogrammi e corrispondenti spettri di massa tandem di tetracicline e clorotetracicline, ottenuti da un campione di terreno agricolo concimato con letame


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