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Il complesso sistema delle cellule dendritiche Dr. Luigi Lembo Fazio Dipartimento di Biologia e Biotecnologia “Charles Darwin” Sezione di Scienze Microbiologiche.

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1 Il complesso sistema delle cellule dendritiche Dr. Luigi Lembo Fazio Dipartimento di Biologia e Biotecnologia “Charles Darwin” Sezione di Scienze Microbiologiche Sapienza-Università di Roma

2 I due tipi di immunità…un po’ di storia Immunita’ innata o naturalecontrollo/ pronta risposta (fase precoce) limitazione dell’infezione Immunita’ adattativa o acquisitaeradicazione più lenta (fase tardiva) dell’infezione Immunita’ di lunga durata InnataAdattativa APC TLRs NODs

3 Le DCs come sensori immunologici Controllano la durata e il tipo di risposta adattattiva La risposta adattativa è strettamente dipendente dalla natura dello stimolo che le DCs ricevono Ueno et al., Immunol. Reviews, 2007

4 L’equipaggiamento delle DCs - Recettori Fc (FcR) - Mac-1 (CD11-b/CD18, integrina aMb2): recettore del complemento CR3 utilizzato per l’uptake di batteri rivestiti con le opsonine - CD14 - recettori per il mannosio appartenenti alla famiglia delle lectine (C-type lectin receptors): impegnati nell’internalizzazione e nella presentazione di proteine mannosilate - TLRs - Nods Rescigno et al., Immunology & Cell Biology,1999

5 Che cosa analizziamo delle DCs? 1.Caratteri generali 2.Subsets delle DCs umane e murine: a) eterogeneità delle DCs b) localizzazione e funzione (DCs dell’intestino) 3. Il processo di “maturazione” 4. I microrganismi patogeni e le DCs

6 Chi sono le cellule dendritiche (DCs)? 1.Le DCs costituiscono una famiglia eterogenea di cellule presentanti l’antigene (APC), componenti importanti del sistema immunitario: - induzione e controllo della risposta dei linfociti T - modulazione della risposta dei linfociti B - attivazione del sistema immunitario innato (cellule NK, NKT) 2. L’attivazione dei linfociti T ad opera delle DCs si correla con la straordinaria capacità di cattura, internalizzazione e processamento dell’antigene, che viene successivamente riesposto complessato con le molecole dei complessi maggiore di istocompatibilità di classe I e II (MHCI e MHCII)

7 E non solo… Le DCs sono importanti anche nel mantenimento della tolleranza immunitaria, centrale e periferica 1. Tolleranza centrale - Eliminazione delle cellule T autoreattive 2. Tolleranza periferica (tolleranza orale) Presentazione degli antigeni ai linfociti T in assenza di molecole di costimolazione (anergia) - Delezione delle cellule CTL e NK - Induzione di cellule regolatorie inducibili CD4 + T - linfociti CD4 + CD25 + (T reg )

8 Le sfide del sistema immunitario 1.La frequenza con cui i linfociti entrano in contatto con i microrganismi è relativamente bassa 2.Le cellule infettate esprimono bassi livelli dei complessi peptidi/MHCII 3.Le cellule infettate mancano delle molecole di costimolazione È in questo contesto che si insericono le cellule dendritiche 1.Riconoscono e catturano i microrganismi 2.Presentano gli antigeni complessati con le molecole MHC 3.Forniscono i segnali essenziali per il differenziamento e l’aspansione clonale dei linfociti

9 Dall’iniziale scoperta….

10 ….ai giorni nostri 1.Esistono molti e ben distinti subsets di DC -Localizzazione tissutale -Microambiente (all’interno dello stesso tessuto/organo) -Specializzazione funzionale (commitment) -Diversità nei pathway di sviluppo e differenziamento -Potenziale migratorio -Espressione dei PRRs (TLRs, NODs, C-type lectins) 2.Il sistema delle DC è quello maggiormente soggetto a cambiamento (steady-state vs. infezione/infiammazione) 3.Nella maggioranza dei casi, le DC presentano un’emivita relativamente breve, quindi devono essere continuamente rinnovate

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12 The Strange Case of Dr.Jekyll and Mr. Hyde 1.Differenze nella risposta contro virus, batteri, funghi, elminti 2.Priming linfociti T e linfociti B 3.Differenze nell’induzione di una risposta protettiva rispetto alla tolleranza 4.La polarizzazione verso un fenotipo Th1 vs. Th2 o di una T reg vs. Th17 1.L’esistenza di numerosi subsets di DC genera confusione (solo nel topo sono stati individuati e caratterizzati almeno 6 subsets) 2.Le conoscenze provengono dall’analisi di modelli murini o da colture primarie umane mantenute in condizioni di differenziamento non standard Mr. Hyde Dr. Jekyll

13 Shortman AND Naik, Nat Rev Immunol 2007

14 Come possiamo classificare le DC? 1.Origine di sviluppo 2.Proprietà biologiche-funzionali (fenotipo, funzione e localizzazione) La classificazione dei subsets di cellule dendritiche viene generalmente effettuata utilizzando diversi parametri Limiti: 1.Non sempre si conoscono in maniera dettagliata i pathway di ontogenesi e differenziamento delle DC 2.Anche la classificazione basata sul fenotipo può determinare confusione: è questo il caso delle DC della mucosa intestinale (CX3CR1 e CD103 vs. CD11b e CD8  ) La classificazione ottimale dei subsets di cellule dendritiche è quella che tiene conto contemporanemente delle proprietà biologiche, del microambiente in cui le DC sono presenti e del fenotipo

15 Shortman AND Naik, Nat Rev Immunol 2007 L’ontogenesi delle DC Inizialmente considerate di origine mieloide (hanno caratteristiche in comune con i macrofagi, possono essere fatte derivare dai monociti) CD8  + vs. CD8  - Tutti i subsets di DC possono formarsi dal CLP e dal CMP 90%10%

16 Come possiamo classificare le DC? 1.Cellule dendritiche convenzionali (cDC) 2.Precursori delle cellule dendritiche (pre-DC) Una delle più semplici… 1.Cellule dendritiche convenzionali (cDC) Hanno caratteristiche morfologiche e funzionali tipiche delle DC in condizioni di steady-state. 2.Precursori delle cellule dendritiche (pre-DC) -Sono al penultimo stadio del differenziamento in senso dendritico -Necessitano di poche o nessuna divisione cellulare -Lo sviluppo dei pre-DC a DC avviene tanto in condizioni di steady-state, quanto sotto la pressione di un Danger Signal

17 Cellule dendritiche convenzionali (cDC) 1.DC con potenziale migratorio 2.DC residenti negli organi linfoidi 1.cDC migranti - Sono le DC dei tessuti periferici, che in seguito al riconoscimento e alla cattura degli antigeni migrano, attraverso la linfa, ai linfonodi, dove presentano I complessi antigene/MHC ai linfociti. - Il riconoscimento degli antigeni (Danger Signal) innesca un processo di maturazione che si conclude negli organi linfoidi. Es. Cellule di Langherans dell’epidermide e dei tratti respiratorio, gastrico e uro- genitale; DC dermiche e DC interstiziali. 2.DC residenti negli organi linfoidi (milza, timo, MLNs) -Non hanno capacità migratorie -Possono trovarsi in uno stato “immaturo” o “maturo” -Importanti anche nel mantenimento della tolleranza

18 Precursori delle DC (pre-DC) 1.Pre-DC - In condizioni di steady-state non hanno caratteristiche morfologiche e funzionali tipiche delle DC - Sono cellule di forma rotondeggianti, circolanti nel sangue - L’acquisizione del fenotipo dendritico avviene in seguito alla stimolazione con componenti virali e batterici Es. Cellule dendritiche plasmacitoidi pDC: natural interferon-producing cell. 2.Cellule dendritiche infiammatorie Rientrano in questa classe quelle popolazioni di DC che non si ritrovano in condizioni di steady-state ma solo in seguito all’instaurarsi di processi infettivi/infiammatori. Es. Tip DC

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20 Ancora qualche dettaglio Le DC possono trovarsi in due stati funzionalmente distinti: 1.Immature Tessuti periferici; sono cellule con una spiccata attività fagocitica Organi linfoidi 2.Mature Organi linfoidi; cellule specializzate nella presentazione antigenica Possiedono un’elevata espressione delle molecole co-stimolatorie (CD80, CD86) N.B. Processo di migrazione costante (anche se a un tasso relativamente basso) di DC immature/semimature dai tessuti periferici ai linfonodi drenanti (DC coinvolte nella tolleranza)

21 [..In the steady state, DCs reside in both peripheral tissues and lymphoid organs. DC subsets also circulate in the blood. To elicit anti- microbial immunity, DCs undergo a complex process of maturation, a ‘metamorphosis’ from an antigen-capturing cell into an antigen-presenting cell (APC)…]. Il processo di “maturazione” Ueno et al., Immunol. Reviews, 2007

22 Il processo di “maturazione” Combina una serie di cambiamenti morfologici e funzionali 1.Perdita delle strutture di adesione 2.Riorganizzazione del citoscheletro 3.Acquisizione delle capacità migratorie (cambiamento nell’espressione dei recettori per le citochine e chemochine) 4.Perdita dell’attività fagocitica 5.Up-regolazione delle molecole costimolatorie CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD40, CD83, CD38 e dell’MHCII 6.Secrezione di chemochine 7.Secrezione di citochine che differenziano e polarizzano gli effettori della risposta adattativa

23 (modificata da Hackstein e Thomson, 2004)

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25 Il processo di “maturazione” Banchereau and Palucka, Nat. Rev. Immunol. 5, (2005)

26 Subsets di cDCs murine (organi linfoidi) Le cellule dendritiche vengono continuamente prodotte all’interno del midollo osseo a partire da cellule staminali ematopoietiche (HSC). Si ritrovano in organi linfoidi e non linfoidi. Si ritrovano in almeno tre compartimenti: tessuti periferici, organi linfoidi secondari e circolanti nel sangue Tutte le sottopopolazioni esprimono livelli più o meno elevati dell’integrina-  CD11c, MHCII e molecole costimolatorie (CD86 e CD80) MILZA: 3 sottopopolazioni CD8  + CD11b - DEC205 + (CD8  + “lymphoid” DC) CD8  - CD11b + DEC205 - CD4 + (CD8  - CD4 + “myeloid” DC) CD8  - CD11b + DEC205 - CD4 - (CD8  - CD4 - “myeloid” DC) LINFONODI: altre due sottopopolazioni CD8  dull CD11b + DEC205 + CD4 - Langerine + (LCDC) CD8  - CD11b + DEC205 + CD4 - Langerine - (dermal DC) E come ultima popolazione… pDC: CD11b dull MHCII dull B220 + CD8  + CD4 + (B220 + DC)

27 Bali Pulendran Immunol. Reviews, 199: (2004)

28 Subsets di DC umane [1] 2 Principali pathway di ontogenesi a partire dal progenitore ematopoietico CD34 Flt3-ligand (FLT3L) sembra essere il principale fattore che governa l’omeostasi delle DC in condizioni di “steady-state”. Banchereau and Palucka, Nat. Rev. Immunol. 5, (2005) Bali Pulendran Immunol. Reviews, 199: (2004)

29 Subsets di DC umane [2] Tutte le cellule dendritiche umane esprimono elevati livelli delle molecole dell’MCHII (HLA-DR) Mancano però dei marcatori tipici della linea linfoide, quali il CD3 (linfociti T), il CD19/20 (linfociti B) e il CD56 (NK) Cellule dendritiche mieloidi. Rappresentano la controparte murina delle DCs convenzionali CD11c. Si caratterizzano per l’espressione del CD11c, CD11b, CD13… Cellule dendritiche plasmacitoidi. Mancano dei marker tipici della differenziazione mieloide e possono essere distinte per l’espressione del CD123, CD303…. Cellule di Langherans. Sono cellule dendritiche presenti negli strati più interni dell’epidermide. Hanno capacità migratorie. Si distinguono per l’espressione della langherina Cellule dendritiche CD14. Sono le DCs inizialmente indicate come interstiziali. Si ritrovano sia nei tessuti periferici, sia nei linfonodi. Anche questo subset mostra positività per il CD11c

30 La maggiorparte delle conoscenze deriva da studi condotti sulle DC circolanti o da sistemi cellulari in vitro Subsets di DC umane [3] Bali Pulendran Immunol. Reviews, 199: (2004)

31 Mucosal DC

32 L’epitelio intestinale Epitelio gastrointestinale: epitelio semplice più vulnerabile all’invasione microbica  Versante luminale  Versante basale pH: 7/7.5 Temperatura: 37°C Epitelio bagnato da fluidi

33 Le difese dell’epitelio intestinale [1] Mucina Mistura di glicoproteine prodotte dalle cellule “goblet”, che intrappola i batteri prevenendone l’accesso al versante luminale LATTOFERRINALISOZIMA Proteina di legame al ferro che depriva i batteri di un importante fattore nutritivo Enzima che scinde il legame β,1-4 del peptidoglicano (PGN) sIgA Aumentano la viscosità della mucina

34 Le difese dell’epitelio intestinale [2] Cellule ciliate Produzione di DEFENSINE (cripte del piccolo e largo intestino) “Killing” dei batteriProtezione delle cellule staminali epiteliali Microflora residente: prevalenza di batteri Gram-positivi (Lactobacilli, Bifidobatteri) MALT (mucosa-associated lymphoid tissue) o GALT (gastrointestinal-associated lymphoid tissue )

35 Il tessuto linfoide associato all’intestino (GALT) - Lamina propria del piccolo e grande intestino (SITI EFFETTORI) - Placche del Peyer (SITI INDUTTORI) - Linfonodi mesenterici (MLN) (SITI INDUTTORI) GALT - Follicoli linfoidi isolati

36 Mucosal DCs A livello del tratto gastro-intestinale le DCs si ritrovano in almeno tre compartimenti: 1.Peyer’s patches (PPs) 2.Lamina propria (LP) 3.Linfonodi mesenterici (MLNs) Perchè analizziamo le cellule dendritiche intestinali? Il sistema immunitario intestinale deve essere in grado di discriminare tra patogeni e antigeni safe come quelli appartenenti al microbiota derivanti dalla dieta Le DCs della mucosa intestinale hanno sviluppato funzioni uniche: - Induzione dei linfociti T regolatori - Guidano lo switching isotipico (IgA) - Consentono ai linfociti T e B di acquisire i recettori essenziali per l’indirizzamento verso la mucosa intestinale (gut- homing receptors)

37 DCs delle Placche del Peyer Rescigno, Adv Immunol (2010) M cell

38 PPs: almeno 6 sottopopolazioni CX3CR1 + CD8  - CD11b - CCR6 + CD8  - CD11b + CCR6 - CD8  + CD11b - CCR6 - pDCs (non sembrano produrre interferoni) CCR7 + PPsDC

39 Lamina Propria DCs LP DCs: nel topo sono stati descritti numerosi subsets di DC. 1.Possono trovarsi negli strati più profondi della LP o in stretto contatto con l’epitelio associato al follicolo (FAE) 2.Da un punto di vista fenotipico i diversi subsets possono essere distinti sulla base dell’espressione di diversi marcatori: CD11c (alta o bassa espressione), CD11b, CD103, CX3CR1 e CD70. 3.Da un punto di vista funzionale si distinguono sulla base dell’espressione dell’integrina  E, CD103 (recettore per l’E-caderina): CD103 -, CD103 +

40 Le cellule DCs della LP: le CX3CR1 + 1.Le DCs CX3CR1 + formano delle strutture simili alle tight-junctions con le cellule dell’epitelio intestinale ed emettono i loro dendriti direttamente nel compartimento luminale, dove possono campionare e catturare i diversi antigeni presenti 2.Chemochina CX3CL1 (fractalchina): fattore delle cellule epiteliali essenziale per il reclutamento delle DCs, linfociti T, NK 3.Il numero di queste estensioni (TEDs: trans-epithelial dendrites) varia considerevolmente in relazione al segmento di intestino analizzato 4.La formazione di queste protrusioni è dipendente dal microbiota e dall’interazione con i recettori TLRs (modelli murini germ free e trattati con antibiotici) 5.In condizioni di steady state l’ileo presenta un numero inferiore di TEDs rispetto alla porzione del piccolo intestino 6.In seguito a infezione con Salmonella si assiste a un aumento del numero dei TEDs

41 Le cellule DCs della LP: le CX3CR1 + Chieppa et al., JEM, 2006

42 Campionamento degli Ag Cattura degli antigeni Dipendente dalle cellule M Dipendente dalle DC Dipendente dall frammento Fc Kelsall, B. L., and M. Rescigno Nat. Immunol. 5:

43 Le cellule DCs della LP: le CD103 Da un punto di vista funzionale si distinguono sulla base dell’espressione dell’integrina  E, CD103 (recettore per l’E-caderina): CD103 -, CD103 + Pathway ontogenetico diverso: CD103 + derivano da pre-DCs. CD103 - da precursori monocitari Diversità nella richiesta di fattori di crescita e di differenziamento: Flt3 per le CD103 +, GMCSF per le CD103 - Capacità migratorie Presentazione antigenica Diversità nell’assetto genico: le DCs CD103 + esprimono livelli più elevati di CCR6, CCR7, TLR5 e TLR9 e più bassi livelli di molecole costimolatorie e degli altri TLRs rispetto alle CD103 -

44 Rescigno, Adv Immunol (2010) Inducono la differenziazione dei Th17

45 Le cellule DCs CD103 + Possiedono caratteristiche uniche Sono in grado di promuovere l’espressione dei recettori gut-homing, CCR9 e  4  7 sui linfociti B e T naive Sono cellule dendritiche con funzione tolerogenica in grado di promuovere il differenziamento dei linfociti Treg Il differenziamento dei Treg avviene a livello dei MLNs Due sono i principali fattori responsabili del differenziamento dei Treg: l’acido retinoico (RA) e il TGF-  La produzione diacido retinoico (RA) e di TGF-  guida anche la produzione di IgA ad opera dei linfociti B (Microbiota e Treg e IgA)

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47 Le cellule DCs CD103 + Le cellule CD103 + esprimono l’enzima indoleamina 2,3 diossigenasi (IDO), anch’esso richiesto per la funzione tolerogenica IDO è coivolto nel patway catabolico del triptofano La generazione di metaboliti tossici, quali le chinurenine, da un lato inibisce la generazione di cellule T effettrici, dall’altro promuove la differenziazione di cellule T regolatorie. L’inibizione in vivo dell’enzima IDO determina nei modelli murini di colite (DSS) una perdita della tolleranza orale accompagnata da una manifestazione più violenta della patologia

48 Le cellule DCs CD103 + Studi molto recenti sembrano indicare che le cellule dendritiche CD103 + possano agire in sinergia con uno specifico subset di macrofagi nell’induzione della tolleranza orale e nella differenziazione dei Treg Rescigno, Adv Immunol (2010)

49 Le cellule DCs della LP e i linfociti Th17 Rescigno e Dii Sabatino, 2009 Science Medicine Due subsets di DCs: CD11b + TLR5 CD11c low CX3CR1 + CD70 Le cellule CX3CR1 CD70 esprimono una serie di recettori per l’ATP Inducono la differenziazione dei linfociti Th17 in presenza di ATP ma indipendentemente dalla stimolazione del TLR5

50 Uematzu and Akira, J. Gastroenterol (2009)

51 Le DCs della LP e il commitment Le cellule dendritiche CD103 + hanno funzione tolerogenica Esiste un “commitment” delle DCs e conseguentemente esistono subsets spcifici di DCs Condizionamento in seguito all’interazione con le IEC e/o con fattori rilasciati dalle IEC

52 Scott et al, 2011 Trends Immunol.

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56 La famiglia delle poietine e l’espansione delle DC

57 BMDC Shigella-infected BMDC

58 hDC Shigella-infected hDC

59 Shigella-infected D1 D1


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