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Facoltà di Scienze Matematiche Fisiche e Naturali Laurea in Biologia e Tecnologie Cellulari IL RUOLO DI UNA FAMIGLIA DI MAP CHINASI CHINASI CHINASI DI.

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Presentazione sul tema: "Facoltà di Scienze Matematiche Fisiche e Naturali Laurea in Biologia e Tecnologie Cellulari IL RUOLO DI UNA FAMIGLIA DI MAP CHINASI CHINASI CHINASI DI."— Transcript della presentazione:

1 Facoltà di Scienze Matematiche Fisiche e Naturali Laurea in Biologia e Tecnologie Cellulari IL RUOLO DI UNA FAMIGLIA DI MAP CHINASI CHINASI CHINASI DI ARABIDOPSIS THALIANA NELLO SVILUPPO Mario Larosa a.a. 2013/2014

2 LA TRASDUZIONE DEL SEGNALE MEDIATA DALLA CASCATA DELLE CHINASI ATTIVATE DA MITOGENO (MAPK) È UN MECCANISMO ALTAMENTE CONSERVATO NEGLI EUCARIOTI Stimolo MAPKKK MAPKK MAPK Crescita e Sviluppo Immunità 20 MAPK Nel genoma di Arabidopsis 80 MAPKKK 10 MAPKK

3 LE MAP CHINASI CHINASI CHINASI DI ARABIDOPSIS (Adattata da Champion et al., 2004)

4 La famiglia genica ANP è costituita da tre membri: ANP1, ANP2 ed ANP3 Sono ridondanti funzionalmente: singoli mutanti knockout (KO) non differiscono dal WT, mentre solo il doppio KO anp2 anp3 mostra evidenti difetti nello sviluppo e nella citochinesi Il triplo mutante KO è letale: le ANP sono COLLETTIVAMENTE ESSENZIALI nello sviluppo della pianta Sono stati identificati per la loro omologia con NUCLEUS– AND PHRAGMOPLAST-ASSOCIATED PROTEIN KINASE1 (NPK1) di tabacco LA FAMIGLIA DELLE “ARABIDOPSIS NPK1-RELATED PROTEIN KINASE” (ANP) (Adattata da Krysan et al., 2002)

5 amiR WtWt DMSO β-estradiolo (nM) amiR3 DMSOβ-estradiolo (µM) TRIPLI MUTANTI CONDIZIONALI anp pri-amiRANP1 espresso nel doppio KO anp2 anp3 (fenotipo alterato nello sviluppo) (fenotipo normale) Silenziamento genico mediato da microRNA artificiali (amiR) inducibili da β-estradiolo pri-amiRANP3 espresso nel doppio KO anp1 anp2

6 LA PARETE CELLULARE VEGETALE (Adattata da Malinovsky et al., 2014b) La parete primaria è costituita da: Componenti microfibrillari Componenti matriciali Cellulosa Emicellulose Pectine

7 (Adattata da Bellincampi et al., 2014) (Adattata da Szymanski e Cosgrove, 2014) Un danno alla parete cellulare (Cell Wall Damage, CWD) può essere causato da: Enzimi litici rilasciati da un patogeno durante l’infezione Stress fisici Agenti chimici STRESS BIOTICI E ABIOTICI POSSONO ALTERARE L’INTEGRITÀ DELLA PARETE CELLULARE IN ARABIDOPSIS THALIANA

8 (Adattata da Levin, 2011) La cascata delle MAPK media la segnalazione attivata dalla percezione del danno alla parete nel lievito IL MECCANISMO DI MANTENIMENTO DELL’INTEGRITÀ DELLA PARETE CELLULARE IN SACCHAROMYCES CEREVISIAE

9 OBIETTIVO DELLA TESI Caratterizzazione del ruolo delle ANP nello sviluppo della radice e nel mantenimento dell’integrità della parete cellulare di Arabidopsis thaliana

10 Plantule di sette giorni LA MANCANZA DELLE ANP PROVOCA L’ESPANSIONE CELLULARE RADIALE NELLA RADICE Wt 1 μM β amiR3 20 nM β amiR1 1 µM β amiR3 DMSO

11 LE RADICI DEI TRIPLI MUTANTI RISULTANO SIMILI A QUELLE DI PLANTULE WT TRATTATE CON L’ERBICIDA ISOXABEN (IXB) Wt 20 nM IXB amiR3 1 μM β Plantule di sette giorni

12 (N-[3-(1-Etil-1-metilpropil)-5-isoxazolil]-2,6-dimetossibenzamide) L’ISOXABEN È UN AGENTE MODELLO PER LO STUDIO DEL DANNO ALLA PARETE CELLULARE VEGETALE (Adattata da De Bolt, 2007) Piante trattate con IXB presentano un minore contenuto di cellulosa L’IXB induce il danno alla parete cellulare vegetale Differenti Cellulosa Sintasi A (CESA) sono bersagli dell’azione dell’IXB E’ un potente inibitore della biosintesi di cellulosa (Paredez et al., 2006) (Bischoff et al., 2009)

13 Alcohol-Insoluble Solid (AIS) AIS de-amilato Radici di plantule di dodici giorni Estrazione Chelating Agent-Soluble Solid (ChASS) Analisi emicellulose Residuo Estrazione con 0.1 M KOH e 4 M KOH Analisi degli zuccheri totali Trattamento con acido trifluoroacetico e soluzione di Updegraff Analisi Cellulosa cristallina ANALISI DELLA COMPOSIZIONE POLISACCARIDICA DELLE PARETI CELLULARI DEI TRIPLI MUTANTI E DEL WT TRATTATO CON ISOXABEN Wt Wt β-estradiolo (1 μM) Wt IXB (20 nM) amiR1 β-estradiolo (1 μM) amiR3 β-estradiolo (1 μM) Analisi Pectine

14 LE RADICI DEI TRIPLI MUTANTI, COME LE PLANTULE WT TRATTATE CON IXB, CONTENGONO MENO ZUCCHERI TOTALI Wt IXB β amiR1 amiR3  g Zuccheri totali/mg AIS de-amilato * **

15 Alcohol-Insoluble Solid (AIS) AIS de-amilato Radici di plantule di dodici giorni Estrazione Chelating Agent-Soluble Solid (ChASS) Analisi emicellulose Residuo Estrazione con 0.1 M KOH e 4 M KOH Analisi degli zuccheri totali Trattamento con acido trifluoroacetico e soluzione di Updegraff Analisi Cellulosa cristallina ANALISI DELLA COMPOSIZIONE POLISACCARIDICA DELLE PARETI CELLULARI DEI TRIPLI MUTANTI E DEL WT TRATTATO CON ISOXABEN Wt Wt β-estradiolo (1 μM) Wt IXB (20 nM) amiR1 β-estradiolo (1 μM) amiR3 β-estradiolo (1 μM) Analisi Pectine

16 LE RADICI DEI TRIPLI MUTANTI, COME LE PLANTULE WT TRATTATE CON IXB, CONTENGONO MENO CELLULOSA CRISTALLINA RISPETTO AL WT WtamiR1amiR3 Cellulosa cristallina (  g glucosio mg -1 AIS de-amilato) β IXB ** * *

17 Alcohol-Insoluble Solid (AIS) AIS de-amilato Radici di plantule di dodici giorni Estrazione Chelating Agent-Soluble Solid (ChASS) Analisi emicellulose Residuo Estrazione con 0.1 M KOH e 4 M KOH Analisi degli zuccheri totali Trattamento con acido trifluoroacetico e soluzione di Updegraff Analisi Cellulosa cristallina ANALISI DELLA COMPOSIZIONE POLISACCARIDICA DELLE PARETI CELLULARI DEI TRIPLI MUTANTI E DEL WT TRATTATO CON ISOXABEN Wt Wt β-estradiolo (1 μM) Wt IXB (20 nM) amiR1 β-estradiolo (1 μM) amiR3 β-estradiolo (1 μM) Analisi Pectine

18 * **  g Zuccheri 0.1M KOH/zuccheri totali Wt amiR1amiR  g Zuccheri 4M KOH/ zuccheri totali Wt amiR1amiR3 Frazione pectica Frazione emicellulosica - Nella frazione emicellulosica estratta con KOH 4 M non ci sono differenze significative * **  g Zuccheri ChASS/zuccheri totali Wt IXB β amiR1amiR3 - LE RADICI DEI TRIPLI MUTANTI, COME LE PLANTULE WT TRATTATE CON IXB, CONTENGONO MENO PECTINE MA POSSIEDONO PIÙ EMICELLULOSE ESTRAIBILI CON KOH 0.1 M RISPETTO AL WT

19 LA SINDROME DA DANNO ALLA PARETE CELLULARE (CELL WALL DAMAGE SYNDROME - CWDS) IN ARABIDOPSIS (Adattate da Denness et al., 2011) La percezione del danno alla parete porta ad una serie di risposte come l’aumento di specie reattive dell’ossigeno (ROS), la deposizione ectopica di lignina e l’accumulo del fitormone acido jasmonico. Lignina IXB Cell Wall Damage ROS Acido jasmonico

20 WtamiR3amiR1 1 µM β nmolH /mg peso fresco /ml I TRIPLI MUTANTI MOSTRANO UN MAGGIORE ACCUMULO DI ROS EXTRACELLULARE ED UNA DEPOSIZIONE ECTOPICA DI LIGNINA 10 nM β DMSO WtamiR3 20 nM IXB 10 nM β

21 Unità Arbitrarie (x10 -3 ) PDF1.2 ERF1THI nM β amiR3WtWt WtamiR3Wt I TRIPLI MUTANTI MOSTRANO UNA MAGGIOR ESPRESSIONE BASALE DEI GENI REGOLATI POSITIVAMENTE DALL’ACIDO JASMONICO

22 LA FAMIGLIA GENICA ANP È RICHIESTA PER IL MANTENIMENTO DELL’INTEGRITÀ STRUTTURALE DELLA PARETE IN ARABIDOPSIS ANP Cellulosa cristallina Pectine Emicellulose Alterazione nella composizione della parete cellulare ROS JA Lignina nella radice CWDS

23 Cellulosa cristallina Pectine Emicellulose Alterazione nella composizione della parete cellulare ROS JA Lignina nella radice CWDS IXB TALI ALTERAZIONI SONO MOLTO SIMILI AL TRATTAMENTO DEL WT CON L’ERBICIDA ISOXABEN

24 LE ANP SONO IMPLICATE NELLA RISPOSTA ALL’ISOXABEN Wtanp1 anp2 anp1 anp3 anp2 anp3 % inibizione dell’allungamento della radice * * * Wt ANP1 SE ANP3 SE % inibizione dell’allungamento della radice * * I doppi mutanti mostrano una minore sensibilità all’IXB al contrario dei mutanti sovraesprimenti le ANP, che risultano maggiormente sensibili all’erbicida

25 CONCLUSIONI La famiglia genica ANP è richiesta per il mantenimento dell’integrità strutturale della parete in Arabidopsis I tripli mutanti anp, al pari delle piante WT trattate con IXB, mostrano la sindrome da danno alla parete Le ANP sono richieste per la risposta al trattamento con l’IXB Le ANP sono le prime MAPKKK note per esser coinvolte nel mantenimento dell’integrità della parete cellulare vegetale

26 Tra i futuri obiettivi dello studio di questa famiglia genica figurano: Caratterizzazione della localizzazione subcellulare Identificazione dei loro diretti interattori PROSPETTIVE


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