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LA GASCROMATOGRAFIA 1. Il gascromatografo Schema a blocchi di un gascromatografo 3 1) Sistema di alimentazione del carrier 2) Sistema di alimentazione.

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1 LA GASCROMATOGRAFIA 1

2 Il gascromatografo

3 Schema a blocchi di un gascromatografo 3 1) Sistema di alimentazione del carrier 2) Sistema di alimentazione dei gas per il rivelatore (bombola) 3) Iniettore 4) Colonna 5) Rivelatore 6) Camera termostatatica 7) Dispositivo per la programmazione della temperatura durante l’analisi 8) Raccolta ed elaborazione dati

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5 Caratteristiche della separazione mediante gascromatografia In gascromatografia la fase mobile è un gas che fluisce in una colonna in cui è posta la fase stazionaria. I meccanismi di separazione dei componenti la miscela sono determinati dalla fase stazionaria, poiché quella mobile funziona solamente da gas di trasporto (carrier). Condizione indispensabile per operare un’analisi gascromatografica su una miscela, è che essa sia in grado di passare in fase vapore alla temperatura di lavoro. 5

6 Colonne tubolari (capillari) Le colonne capillari sono sicuramente le più diffuse, la loro lunghezza è nell’ordine della decina di metri, (non mancano tuttavia colonne che arrivano anche ai 100 metri) il diametro si riduce a qualche decimo di millimetro. Grazie alla loro particolare struttura e lunghezza, esse consentono una più efficiente separazione dei componenti della miscela 6

7 Scelta della fase mobile 7 Ricordiamo la dipendenza di H da B, C m e C s H = B/u + C m u + C s u B dipende solo da D m ed è direttamente proporzionale ad esso. Il suo peso è elevato per valori piccoli di u, ma tende ad essere trascurabile per valori più elevati, vista la dipendenza da b/u, mentre il contributo di C m e C s diventa preponderante per valori di u più elevati, ma spesso non hanno lo stesso peso nel determinare C. C m = k 1 d t 2 /D m C s =k 2 d f 2 /D s Se d f è grande, C s pesa molto, e diminuire D m non migliora l’efficienza specifica, quindi diminuirlo serve solo ad aumentare B. Viceversa, Se d f è piccolo, C s pesa poco, e diminuire D m migliora l’efficienza specifica agli alti valori di u.

8 EFFETTO DELLO SPESSORE DELLA FASE STAZIONARIA SUL VALORE DI H 8

9 EFFETTO DELLA FASE MOBILE 1 Films sottili di fase stazionaria 9

10 EFFETTO DEL GAS VETTORE 2 Films spessi di fase stazionaria 10

11 Effetto della compressibilità del carrier gas Il V R effettivo di un soluto non può essere misurato direttamente dal t R in quanto il volume della fase mobile varia con la T e la P, mentre la portata viene misurata all’uscita della colonna, a T ambiente e P atmosferica. Bisogna quindi calcolare il valore della portata effettiva alle condizioni della colonna. Il fattore di correzione per la T può essere calcolato dalla seguente equazione F c = F a T c /T a La pressione lungo la colonna cromatografica varia in modo non lineare. La pressione media può essere calcolata dalla formula P med = 2/3[(P i 3 - P 0 3 )/ (P i 2 - P 0 2 )] V 0 R = p 0 /p med V R P 0 /P med viene anche indicato con j V R corr =j V r F c t r 11

12 12 Il fatto di poter fare le correzioni non ci deve far pensare che l’effetto della temperatura e della pressione possa essere compensato anche fisicamente all’interno della colonna. La pressione continua ad essere variabile lungo la colonna, ed il volume del gas vettore si espande lungo la colonna. Ciò vuol dire che all’0inizio della colonna avremo gas compresso di piccolo volume e basse u, mentre in uscita u aumenta in proporzione a ΔP ed avremo u elevate, quindi non avremo che per un minimo tratto u ottimale ed in generale bassa efficienza.

13 FASI LIQUIDE PER CROMATOGRAFIA La fase liquida per CGL deve essere caratterizzata da Bassa volatilità Stabilità termica Inerzia chimica Caratteristiche solventi (valori ottimali di k’ e  13

14 TIPOLOGIE DI FASI STAZIONARIE : POLISILOSSANI 14

15 POLISILOSSANI SOSTITUITI 15

16 FASI STAZIONARIE POLARI CON STRUTTURA POLIETILEN GLICOL 16

17 Una fase stazionaria chirale: α - Cyclodextrin 17

18 STRUTTURA DI UNA COLONNA CAPILLARE 18

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20 PLOT column (adsorption) 20

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22 Dynamic Coating 22 a 5% w/w of stationary phase in the solvent will produce a film thickness of about 0.5 mm. However, this is only approximate, as the film thickness is also determined by the physical properties of the surface, the solvent and the stationary phase. After the plug has been run into the front of the column (sufficient to fill about 10% of the column length), pressure is applied to the front of the column to force the plug through the column at 2-4 mm per second

23 Static Coating 23 After filling, one end of the column is sealed, and the other end is connected to a high vacuum pump and placed in an oven and the solvent slowly evaporates and the front retreats leaving a film of solution on the walls. The solvent then evaporates from this film and the stationary phase remains as a thin coating on the wall.

24 AUMENTO DELLA STABILITA’ TERMICA Fasi chimicamente legate “Cross linking” Carrier gas privo di ossigeno Evitare la presenza di acqua nel campione 24

25 FASE STABILE FINO A 400 °C SILANO-CARBORANO 25

26 Camera termostatica In gascromatografia la temperatura della colonna rappresenta un parametro fondamentale per ottenere una buona separazione dei picchi. Le colonne vanno quindi termostatate in apposite camere entro le quali la temperatura resti il più possibile costante. Nel caso contrario la riproducibilità dell’analisi viene sensibilmente alterata. 26

27 Dispositivo per la programmazione della temperatura durante l’analisi Normalmente la temperatura della colonna è regolata sul valore corrispondente alla media dei punti di ebollizione dei componenti della miscela. Per miscele complesse con punti di ebollizione troppo distanti tra di loro la scelta della temperatura è problematica. La funzione “programma”permette di variare la temperatura d’analisi. La temperatura viene mantenuta bassa per le sostanze più volatili e poi innalzata per consentire la risoluzione delle sostanze altobollenti. Il tempo di riscaldamento e le diverse temperature vengono trovate per tentativi. 27

28 EFFETTO DELLA TEMPERATURA PROGRAMMATA 28 45° 145° programma di T

29 Pressure control 29

30 The Mass Flow Controller 30

31 INIETTORE PER COLONNE IMPACCATE Il setto di materiale polimerico si buca con facilità e il foro si richiude dopo l’estrazione dell’ago. Il setto va cambiato dopo un certo numero di iniezioni. 31

32 Iniettore split- splitless aspetto esterno

33 33 Le colonne capillari possono accettare solo una piccola quantità di sostanza prima di sovraccaricarsi. Per iniettare la quantità ottimale si ricorre a differenti soluzioni. Iniettori per capillari, tecnica split

34 The Solute Focusing Method sampling 34

35 The Retention Gap Method of Sampling 35

36 36 In questa tecnica la miscela è contenuta in un solvente con temperatura di ebollizione almeno 50°C più basso di quello del componente più volatile. Subito prima dell’iniezione, la valvola splitter viene chiusa e il flusso del carrier si dirige solo nella colonna. Fino a che lo splitter rimane chiuso si ha ingresso in colonna prevalente- mente della miscela con solo una porzione del solvente che, più facilmente volatilizzabile, tende a diffondere in tutto lo spazio disponibile. Dopo un tempo prestabilito la valvola si apre ed Il carrier “pulisce” l’iniettore dal solvente residuo. tecnica splitless

37 EFFETTO DEL TEMPO DI CHIUSURA DELLE VALVOLE NELL’INIETTORE SPLIT- SPLITLESS 37

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40 Iniettori per capillari on column La costruzione di siringhe con aghi di diametro = 0,3 mm consente la costruzione di iniettori che immettano il campione direttamente in colonna. Gli iniettori On-Column non presentano la guarnizione di protezione (sarebbe troppo difficile bucarla con l’ago) ma bensì una valvola che si apre all’istante quando l’ago sta per toccarla, e si richiude subito dopo la sua uscita. 40

41 BIODIESEL Colonna 10 m x 0,32 mm. met sil., Carrier elio. Iniezione on column. Prog. :50 °, 1 min a 100°, 15°/ min a 370. Rivelatore FID 41 La glicerina può dare origine durante la combustione a prodotti tossici

42 INIETTORE PTV 42

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44 LARGE VOLUME INJECTION 44

45 LARGE VOLUME INJECTION 45

46 Per mantenere le prestazioni della colonna 46

47 Rivelatore Il rivelatore (o detector) è un dispositivo posto subito dopo il termine della colonna con la funzione di indicare la presenza del componente all’uscita della colonna, e di fornire la misura della concentrazione di esso nel gas di trasporto. 47

48 48 Segnale o risposta: ogni rivelatore traduce in un segnale elettrico, espresso in mV o  V, la presenza di una sostanza. Il segnale elettrico, che può essere proporzionale alla concentrazione del componente rivelato o alla sua massa, viene trasformato generalmente in un grafico. Sensibilità: la minima differenza (concentrazione o massa) che lo strumento è in grado di evidenziare.

49 CARATTERISTICHE DI UN RIVELATORE 49 Intervallo di linearità; range di concentrazioni compresa tra il limite di rivelabilità e il limite di linearità. Limite di rivelabilità; è la concentrazione minima che dà una risposta tre volte il semirumore di fondo Intervallo di risposta dinamico; intervallo di concentrazioni entro il quale il rivelatore risponde, anche se non in maniera lineare Sensibilità. Spesso varia al variare della concentrazione e dipende dall’errore della misura

50 Rivelatore a conducibilità termica: si basa sul principio del ponte di Wheatstone. 50 Le resistenze si sbilanciano quando passa un gas con diversa conducibilità termica. La dispersione di calore varia e varia, di conseguenza, anche la resistenza e il ponte si sbilancia dando origine al segnale 4 filamenti: 2 sono circondati da gas di trasporto che fluisce (corrente di riferimento), l’altra coppia è circondata da gas di trasporto che proviene dalla colonna. Quando il ponte è in equilibrio non appare alcun segnale. Una variazione della conducibilità termica del gas (dovuta all’eluizione di analiti con il gas) produce un segnale tra 1 e 2.

51 Rivelatore a ionizzazione di fiamma, FID In questo rivelatore le sostanze eluite contenute nel gas di trasporto vengono bruciate in una microfiamma di idrogeno e aria che si estende fra due elettrodi tra i quali è applicata una differenza di potenziale di 300 V. Per effetto della combustione si originano ioni e pertanto tra gli elettrodi si manifesta un passaggio di corrente elettrica di intensità proporzionale alla quantità delle sostanze bruciate. 51

52 MECCANISMO DI RISPOSTA PARTE RIDUCENTE DELLA FIAMMA: FORMAZIONE DI RADICALI ECCITATI PARTE OSSIDANTE: FORMAZIONE DI IONI POSITIVI CH. * + O. * CHO + CHO + + H 2 O CHO + H 3 O

53 53 In presenza del solo carrier la corrente è quasi nulla, dovuta a impurezze presenti nel gas di trasporto o, più spesso, a tracce di fase stazionaria che sono trascinate via. Quando nella fiamma bruciano, oltre ad idrogeno, anche altre sostanze, aumenta notevolmente la ionizzazione, e di conseguenza anche la corrente. Questo rivelatore è poco selettivo perché sensibile a tutte le sostanze organiche, ha limite di rivelabilità da a g, ha linearità di risposta da 10 6 a E’ insensibile solo ai gas permanenti, ad H 2 S, NH 3, SO 2, CO 2, CO, H 2 O. Può lavorare fino a temperature di 400°C e con qualsiasi gas di trasporto.

54 54 ALDITOL ACETATI Spesso in gas cromatografia vengono formati derivati volatili per aumentare il numero delle sostanze analizzabili

55 The Nitrogen Phosphorus Detector 55

56 Electron capture detector (ECD) 56

57 RIVELATORE A CATTURA DI ELETTRONI DISEGNO ORIGINALE 57

58 VERSIONE MODERNA SENZA SORGENTE RADIOATTIVA 58 Bias voltage is the amount of voltage that an electronic device needs in order to power on and function

59 Chlorinated pesticides 59

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61 Organophosphorous pesticides 61

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63 SPETTROMETRIA DI MASSA La spettrometria di massa è una tecnica che studia la materia attraverso la determinazione dell’abbondanza relativa e del rapporto massa/carica (m/z) di ioni in fase gassosa. Nello spettro di massa si riporta l’intensità del segnale vs m/z e il valore dell’intensità è espresso in unità arbitrarie. Lo spettro è normalizzato rispetto al segnale più intenso detto picco base.

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65 Caratteristiche operative ed efficienza delle colonne tubulari 65 Le colonne di diametro più piccolo hanno la maggiore efficienza specifica, ma una capacità di carico molto bassa. La portata può essere un fattore limitante per l’uso di alcuni iniettori e rivelatori

66 Effetto dello spessore di film liquido Benefits 0.1 to 0.25µm film 1 to 5µm film May increase resolution Decreased column bleed Increased signal-to- noise Increased max. temp Sharper peak shape Reduced interaction w/tubing

67 Other charateristics Increased interaction w/tubing Decreased analyte capacity Decreased retention Decreased elution temperature May decrease resolution Increased column bleed Decreased max. temp. Increased retention May increase resolution Increased elution temperature

68 Selection of Capillary Column Choose the proper phase for the compounds being chromatographed Select column ID, film thickness, and length Set optimum parameters for your analysis a. Optimize column flow (mL/min.) b. Choose appropriate carrier gas (hydrogen, helium, or nitrogen) c. Optimize oven temperature program 68

69 Instrument Preparation & Column Installation 1. Cool all heated zones. 2. Visually inspect indicating oxygen and moisture traps. Replace saturated traps. 3. Examine the inlet and the detector. Clean or replace all dirty or corroded parts. 4. Replace the inlet liner and septum, and the injector seals (O-rings, inlet seals, ferrules, etc.). 5. Mount the column in the oven with a support that protects it from scratches. Center the column in the oven. This ensures uniform heat exposure generating consistent retention times. 69

70 70 6. Uncoil the ends to make sure the ends are long enough to reach the injector and detector. Cut 10cm from each end of the column. To cut a fused silica column, use the smooth edge of a ceramic scoring wafer. 7. While pointing the inlet end of the column downward (to prevent shards from falling into the column), slide the nut and appropriate size ferrule onto the inlet end of the column. Cut an additional 2cm from the end of the column to remove any material scraped from the ferrule onto the edge of the column. 8. Install the column the appropriate distance in the injector, as indicated in your instrument manual. 9. Set the carrier gas to the flow rate or inlet pressure recommended for the column or to your method flow rate/pressure. Confirm presence of column flow by immersing the column outlet in a vial of solvent.

71 Flush the column at ambient temperature with carrier gas: at least 5 minutes for a 25-30m column and 10 minutes for a 50-60m column. 11. Set the injector temperatures. Do not exceed the column’s maximum operating temperature (listed on the column tag). Check inlet for leaks. 12. Install the column into the detector as described in the instrument manual. Set the detector gases and temperatures to proper settings. 13. Check the detection connections for leaks, using a thermal conductivity leak detector. 14. Verify the carrier gas flow is at the rate you intend to use for your analysis. Set the split vent, septum purge, and any other applicable gas rates as appropriate.

72 Inject an unretained compound, to verify the column is installed correctly and to determine the dead volume time for checking column flow. A symmetric peak indicates the column is installed correctly. Adjust the carrier gas flow as necessary. 16. Condition the column 20°C above the final analysis temperature of your method. Do not exceed the column’s maximum operating temperature. For most applications, 1 hour of conditioning is sufficient. For sensitive detectors or trace analysis, longer conditioning times or conditioning the column at the maximum T may be beneficial. Extended time at high temperatures will not adversely affect column performance as long as precautions are taken to make sure the carrier gas is clean and is filtered for oxygen and water. 17. To check for instrument performance, analyze a column test mix for a new method, or a known standard to confirm proper column and system performance.

73 Per veri specialisti: comprehensive GC x GC Due colonne connesse in serie di differente polarità, in due camere termostatiche separate. La prima colonna è lunga e con diametro normale. La seconda è corta e con diametro molto stretto in modo di avere ugualmente elevata efficienza. L’ottimizzazione ed il controllo delle condizioni di analisi sono di fondamentale importanza. 73

74 74 Columns: 1, 30m, 0.25mm ID, 0.25μm non polar 2, 1m, 0.10mm ID, 0.10μm polar Sample: fragrance allergens in MTBE Instrument: LECO Corporation GCxGC/FID with quad-jet, dual-stage modulator and secondary oven Inj.: 0.2μL split (split ratio 1:200), 4mm laminar cup splitter Inj. temp.: 250°C Carrier gas: helium, corrected constant flow via pressure ramps Flow rate: 2mL/min. Oven temp.: c.1: 40°C (hold 1 min.) to 240°C at 4°C/min. C.2: 45°C (hold 1 min.) to 245°C at 4°C/min. Modulation: modulator temperature offset: 20°C second dimension separation time: 3 sec. hot pulse time: 0.8 sec. cool time between stages: 0.7 sec. Det.: FID at 300°C makeup flow + column flow: 50mL/min. hydrogen: 40mL/min. air: 450mL/min. data collection rate: 200 Hz

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77 ANALISI QUALITATIVA Non è certo il campo più adatto dell’analisi gas-cromatografica. Il t R ’ può dare delle indicazioni significative ma non probanti. Le serie omologhe presentano valori dei t R ’ i cui log sono funzione lineare del numero di atomi di carbonio che ne compongono la catena. 77

78 Kovats retention index 78 Kovats retention index is a concept used in gas chromatography to convert retention times into system-independent constants. The index is named after the Hungarian born Swiss chemist, Ervin Kováts who outlined this concept during the 1950s.gas chromatography retention timesErvin Kováts The retention indices of a certain compound is its t R normalised to the t R of adjacently eluting n-alkanes. While retention times vary with the individual chromatographic system (e.g. with regards to column length, film thickness, diameter, carrier gas u and P, V m ), the derived retention indices are quite independent of these parameters and allow comparing values measured by different analytical laboratories under varying conditions. Tables of retention indices can help identify components by comparing experimentally found retention indices with known values. chromatographic The method takes advantage of the linear relationship between the values of log(t r ') and the number of carbon atoms in a molecule. The value of Kovats index is usually represented by I in matematical expressions. Its applicability is restricted to organic compounds

79 79 For isothermal chromatography, the Kovats index is given by the equation Where; I = Kovats retention index, n = the number of carbon atoms in the smaller n-alkane, N = the number of carbon atoms in the larger n-alkane, t r ' = the adjusted retention time. For temperature programmed chromatography, the Kovats index is given by the equation

80 80

81 81

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83 Schema di una strumentazione GC-MS

84 MASS SPECTRUM 84

85 L’analisi quantitativa cromatografica è basata sulla misura delle aree dei picchi, dalle quali, dopo opportuna elaborazione, si risale alle concentrazioni percentuali dei componenti. Metodo della calibrazione diretta Non si può eseguire perché il volume di campione iniettato è variabile. Metodo dello calibrazione con standard interno E’ il metodo comunemente seguito. 85 ANALISI QUANTITATIVA

86 Si riportano in un grafico i valori trovati per i rapporti tra le aree in funzione del peso o della concentrazione di A. Si procede poi aggiungendo una quantità costante dello standard interno (Q IS ) al campione. Dal cromatogramma della miscela così ottenuta si misura il rapporto A A /A IS e attraverso il grafico si risale al valore di P X o di A X. 86 A A /A I P A (C A )

87 chlorodibenzodioxines 87 inj.: 250 °C. injection: 1 μL, splitless (1 min.) oven: 150 °C (1 min.), 5 °C/min. to 325 °C. Detector MS, SIM acquisition. column: Me, 5% Phe Sil, 30 m x 0.25 mm I.D., 0.25 μm (low bleed) carrier gas: helium, 37 cm/sec

88 88 highly polar phase; biscyanropopyl polysiloxane—not bonded

89 Fatty acid methyl esters 89 column: Carbowax, 15 m × 0.10 mm I.D., 0.10 μm; carrier gas: hydrogen, 50 cm/sec; inj.: 250 °C; injection: 0.2 μL, 200:1 split; oven: 140 °C, 40 °C/min. to 280 °C; det.: FID, 280 °C. Animal origin.

90 90 column: Bonded; poly(dimethyl siloxane), 15 m × 0.10 mm I.D., 0.10 μm carrier gas: hydrogen, 45 cm/sec; injection: 0.5 μL, 200:1 split; oven: 175 °C, 30 °C/min. to 275 °C det.: FID. Bacterial origin

91 91 column: Carbowax, 15 m × 0.10 mm I.D., 0.10 μm; carrier gas: hydrogen, 50 cm/sec; injection: 0.2 μL, 200:1 split; oven: 140 °C, 40 °C/min. to 280 °C; det.: FID. Marine origin

92 92 CN-Propyl silicon

93 93 column: SP-2560, 75 m x 0.18 mm I.D., 0.14 μm column: CN-sil, 75 m x 0.18 mm I.D., 0.14 μm; carrier gas: hydrogen, 25 cm/sec; injection: 0.5 μL, split 100:1; detector FID. Sep. isomers

94 94 Apolar stationary phase

95 95 Polar stationary phase

96 96 Very polar stationary phase

97 97 Triglycerides are often injected via on-column injection. Use 0.53mm retention gaps and appropriate connectors.

98 98

99 99 Crossbond® 5% diphenyl/5% dimethyl polysiloxane)


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