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Il Progetto BUDGET Ricerca Industriale: 5.901.965 € Sviluppo Sperimentale: 1.337.462 € Formazione: 1.037.175 €

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2 Il Progetto BUDGET Ricerca Industriale: € Sviluppo Sperimentale: € Formazione: €

3 Obiettivo Generale L’obiettivo generale del progetto è la messa a punto di strumenti innovativi e affidabili per intervenire a livello di: PREVENZIONE – CONTROLLO – CORREZIONE della contaminazione al fine di contribuire alla realizzazione di un sistema integrato di sicurezza lungo tutta la filiera. L’obiettivo generale del progetto è la messa a punto di strumenti innovativi e affidabili per intervenire a livello di: PREVENZIONE – CONTROLLO – CORREZIONE della contaminazione al fine di contribuire alla realizzazione di un sistema integrato di sicurezza lungo tutta la filiera. Key foods pugliesi: uva e vino, frumento e altri cereali e derivati, ed un insieme di prodotti freschi quali molluschi bivalvi, carni bovine, mozzarella e prodotti ortofrutticoli. Selezionati in base a: rischio di contaminazione da differenti classi di contaminanti, valenza economica e territoriale, livello di interesse scientifico in termini di applicazione di tecnologie innovative.

4 Problematiche Tecnico-scientifiche FILIERA VITI-VINICOLA FILIERA CEREALICOLA PRODOTTI FRESCHI Ocratossina A Fitofarmaci Allergeni Brettanomyces bruxellensis Micotossine Fitofarmaci Funghi tossigeni Bacilli Insetti Metalli pesanti Pseudomonas spp. Patogeni emergenti Listeria Salmonella RISULTATI ATTESI: Metodi rapidi e avanzati per la rivelazione di contaminanti chimici. Nuovi metodi per il rilevamento di microrganismi patogeni e alteranti. Acquisizione di nuove conoscenze Trasferimento tecnologico – Scale up industriale Limiti imposti dalle normative – Esigenze reali delle imprese

5 Struttura del Progetto di Ricerca

6 % Avanzamento Rendicontazione per OR SAL I - II - III

7 % Avanzamento Rendicontazione per OS SAL I - II - III

8 Attività preliminari OS 2.1: Messa a punto di metodiche di controllo per la selezione delle uve per la vinificazione e per la determinazione di ocratossina A in uva e vino Università degli Studi di Foggia - DiSA OS 4.1: Messa a punto di metodiche per il trattamento di cariossidi di frumento con ozono gassoso e/o acqua ozonizzata per prevenire la contaminazione da microrganismi indesiderati e l'infestazione da insetti ISPA-CNR (Bari) CDP srl OS 6.1: Messa a punto di un protocollo biotecnologico per ridurre i rischi di alterazione da Pseudomonas spp. nelle mozzarelle  Università degli Studi di Bari, Dipartimento di Scienze del Suolo, della Pianta e degli Alimenti (DISSPA)  Centro Latte Stasi (a cui, a breve, subentrerà Sanguedolce, Andria)  Agriplan, Bari OS7.2: Messa a punto di un prototipo per la diagnosi rapida di patogeni emergenti in molluschi bivalvi Università degli Studi di Foggia, SAFE Università degli Studi di Bari, Dipartimento di Medicina Veterinaria BonassisaLab srl Soggetto attuatore: D.A.Re. scrl

9 Avanzamento OS 2.1/ OS 4.1

10 Avanzamento OS 6.1//7.2

11 OR 1 – Strumenti Preventivi Innovativi per la Riduzione del Rischio di Microrganismi Alteranti in Vino OS 1.1: Messa a punto di un protocollo biotecnologico per minimizzare lo sviluppo di lieviti del genere Brettanomyces e per ridurre la produzione e la presenza di etilfenoli nel vino Partner:  Università degli Studi di Foggia - Dipartimento Di Scienze Agrarie, degli Alimenti e dell’Ambiente (SAFE)  ISPA-CNR (Lecce) Soggetto attuatore:  D.A.Re. scrl

12 Avanzamento OS 1.1

13 Stato di avanzamento delle attività (al 30/04/2013)  Task 1.1.1: Sviluppo di metodiche biotecnologiche e cromatografiche per l'analisi delle dinamiche microbiche di Brettanomyces bruxellensis (M1-12) - stato: completato  Task 1.1.2: Studio dell’influenza dei parametri fisico-chimici relativi alle vinificazioni aziendali sullo sviluppo di diversi ceppi di Brettanomyces bruxellensis isolati da vini pugliesi e sulla connessa produzione di etil-derivati (M5-25) - stato: in corso (50% completamento)  Task 1.1.3: Studio di strategie di riduzione del rischio da Brettanomyces bruxellensis e definizione di un protocollo di prevenzione (M9-27) - stato: in corso (35% completamento) OR Mesi Attività OR1 OS 1.1 A1.1.1.aXXXXX A1.1.1.b XXXXX A1.1.2.a XXXXXX A1.1.2.b XXXXXX A1.1.2.c XXXXXX A1.1.2.d XXXXXXX A1.1.3.a XXXXXXXX A1.1.3.b XXXXXX A1.1.3.c XXXXXXXXXXX

14 Risultati Principali – Task (UNIFG, CNR)  Task 1.1.1: Sviluppo di metodiche biotecnologiche e cromatografiche per l'analisi delle dinamiche microbiche di Brettanomyces bruxellensis  Selezione di ceppi di Brettanomyces bruxellensis in vini pugliesi e validazione della metodica molecolare per l’identificazione e quantificazione rapida di B. bruxellensis in vino  Ottimizzazione di un metodo basato sull’applicazione dell’ HPLC per la quantificazione degli acidi idrossicinnamici e dei corrispondenti vinil- ed etil-derivati in vino

15 Risultati Principali – Task (UNIFG, CNR)  Task 1.1.2: Studio dell’influenza dei parametri fisico-chimici relativi alle vinificazioni aziendali sullo sviluppo di diversi ceppi di Brettanomyces bruxellensis isolati da vini pugliesi e sulla connessa produzione di etil-derivati  Studio sulla relazione tra sviluppo di B. bruxellensis, produzione di etilderivati, e diversi parametri chimico-fisici specifici delle vinificazioni svolte presso le aziende proponenti  Analisi del trascrittoma di un ceppo di B. bruxellensis accresciuto in mosto-vino

16 Risultati Principali – Task (UNIFG, CNR)  Task 1.1.3: Studio di strategie di riduzione del rischio da Brettanomyces bruxellensis e definizione di un protocollo di prevenzione  Protocollo di gestione delle risorse microbiche per la riduzione di B. bruxellensis e di fenoli volatili (etil-derivati) da esso prodotti.  Protocollo di utilizzo delle scorze cellulari di lieviti per la riduzione dei fenoli volatili (etilderivati) prodotti da B. bruxellensis in vino.

17 OR 2 – Strumenti di Controllo Innovativi per la Determinazione di Contaminanti in Uva e Vino OS 2.2: Messa a punto di una metodica multi-analita LC-MS(MS) e sviluppo di metodi rapidi per la determinazione di allergeni nel vino OS 2.2: Messa a punto di una metodica multi-analita LC-MS(MS) e sviluppo di metodi rapidi per la determinazione di allergeni nel vino Partner:  ISPA-CNR (Bari) Soggetto attuatore:  D.A.Re. scrl

18 Avanzamento OS 2.2

19 Stato di avanzamento delle attività (al 30/04/2013) OR Mesi Attività OR 2 OS 2.2 A2.2.1.aXXXX A2.2.1.b XXXXXXXX A2.2.1.c XXXXXXXXXXXXXXXXXXXX A2.2.1.d XXXXXXXXXXXX A2.2.2.aXXXXXXXXXXXX A2.2.2.b XXXXXXXXXXXX A2.2.2.c XXXXXXXXXXXX  Task 2.2.1: Messa a punto di una metodica multi-analita LC-MS(MS) e sviluppo di metodi rapidi per la determinazione di allergeni in vini chiarificati (M1-36) - stato: in corso (60% di completamento)  Task 2.2.2: Sviluppo di un immunosaggio basato su SPR per la determinazione di allergeni di latte e uova in vini chiarificati (M7-36) - stato: in corso (20% di avanzamento)

20 Risultati Principali - Task (ISPA-CNR)  Task 2.2.1: Messa a punto di una metodica multi-analita LC-MS(MS) e sviluppo di metodi rapidi per la determinazione di allergeni in vini chiarificati Attività a - Sviluppata con successo una metodica sensibile e affidabile per la simultanea estrazione e purificazione di allergeni di latte e uovo in vini bianchi chiarificati con caseinati (chiarificante A) e bianco d’uovo (chiarificante B) Attività b - Ottimizzate le condizioni di separazione ed analisi dei peptidi derivanti dall’idrolisi enzimatica della componente allergenica tramite HPLC-spettrometria di massa ad alta risoluzione Attività 2.2.1c - Almeno due proteine allergeniche rivelate (alfa caseina e beta caseina per agente A; ovalbumina e lisozima per agente B) ed almeno due peptidi identificati per ciascun allergene in campioni di vino chiarificato. Limiti di rivelabilità raggiunti con il metodo HPLC-MS/MS sviluppato: < 1 µg/mL Monaci et al, Multiallergen quintification of fining-related egg and milk proteins in white wines by high- resolution-mass-spectrometry. Rapid Commun. Mass. Spec. 2013,27, Vino chiarificato Pretrattamento Allergene Idrolisi enzimatica Trattamento bioinformatico Analisi HPLC-HRMS

21  Task 2.2.2: Sviluppo di un immunosaggio basato su SPR per la determinazione di allergeni di latte e uova in vini chiarificati  Valutazione di chip diversamente modificati e di diverse tipologie di anticorpi (mono e policlonali) mirati alla messa a punto di un immunosensore SPR per la rivelazione di allergeni di uovo  Ottimizzazione delle condizioni d’immobilizzazione (pH, forza ionica) dell’anticorpo biotinilato prescelto per la sua immobilizzazione indiretta su biochip di oro modificati con streptavidina. Risultati Principali - Task (ISPA-CNR) Immunosensore SPR

22 OR 2 – Strumenti di Controllo Innovativi per la Determinazione di Contaminanti in Uva e Vino OS 2.3: Messa a punto di una metodica analitica per la determinazione di fitofarmaci in uva e vino e produzione di materiali di riferimento OS 5.1: Messa a punto di una metodica analitica per la determinazione di fitofarmaci in cereali, produzione di miscele standard e materiali di riferimento Partner:  Lab. Instruments srl  ISPA-CNR (Bari) Soggetto attuatore:  D.A.Re. scrl LE ATTIVITA’ DELL’OS 2.3 SONO SVOLTE CONGIUNTAMENTE A QUELLE DELL’OS 5.1

23 OR 3 – Strumenti Correttivi Innovativi per la Rimozione di Metaboliti Microbici Indesiderati nel Vino OS 3.1: Messa a punto di un prototipo per la rimozione dell’ocratossina A (OTA) nel vino mediante la tecnica del ripasso continuo su vinacce/buccette Partner:  ISPA-CNR (Bari)  Industrie Fracchiolla srl Soggetto attuatore:  D.A.Re. scrl

24 Avanzamento OS 3.1

25 Stato di avanzamento delle attività (al 30/04/2013)  Task – Reperimento di vinacce esenti da OTA e di partite di mosti/vini naturalmente contaminati da OTA - stato: in corso (10% completamento)  Task – Stabilizzazione delle vinacce - stato: in corso (20% completamento)  Task – Sviluppo di un prototipo per il ripasso in continuo su vinacce e/o loro componenti - stato: in corso (20% completamento) OR Mesi Attività OR 3 OS 3.1 A3.1.1.a XXXXXX XXXXXXXX XX A3.1.1.b XXXXXX XXXXXXXX XX A3.1.1.c XXXXXX XXXXXXXX XX A3.1.2.aXXXXXXXXXXXX A3.1.2.b XXXXXXXXX A3.1.3.a XXXXXXX XXXXXXXXXXXXXX A3.1.3.b XXXXXXXX A3.1.4.a XXXXXXXX A3.1.4.b XXXXXXX

26 Risultati Principali  Task 3.1.1: Reperimento di vinacce esenti da OTA e di partite di mosti/vini naturalmente contaminati da OTA  Task 3.1.2: Stabilizzazione delle vinacce  Task 3.1.4: Sviluppo di un prototipo per il ripasso in continuo su vinacce Le vinacce (cv amarone) sono state reperite presso il centro di ricerca per la viticoltura di Conegliano (CRA). È stata stimata la carica microbica batterica e fungina iniziale mediante conta in piastra: 3,2·10 5 UFC/g (concentrazione batterica) 2,2·10 6 UFC/g (concentrazione fungina) È stato valutato l’effetto delle diverse condizioni di stabilizzazione (°C, SO 2, tempo) sulla carica batterica e fungina È stata misurata la concentrazione di OTA: 3,1 ± 0,2 µg/kg OTA È stato ideato (ISPA, Ind. Fracchiolla e consulente enologo) e realizzato (Ind. Fracchiolla) il primo prototipo per le prove di ripasso

27 Risultati Principali – Task (ISPA-CNR) Popolazione batterica presente nelle vinacce conservate a differenti temperature ed in presenza o assenza di SO 2

28 Risultati Principali – Task (ISPA-CNR) Popolazione fungina nelle vinacce conservate a differenti temperature ed in presenza o assenza di SO 2

29 Risultati Principali – Task (Industrie Fracchiolla, ISPA- CNR) Sono stati condotti incontri di lavoro tra personale dell’ISPA-CNR, dell’Industrie Fracchiolla e dell’enologo coinvolto nell’attività progettuale per l’ideazione, la progettazione e la realizzazione di un miniprototipo da laboratorio per le prove di ottimizzazione delle condizioni e modalità di ripasso di vino contaminato da OTA su vinacce incontaminate

30 OR 3 – Strumenti Correttivi Innovativi per la Rimozione di Metaboliti Microbici Indesiderati nel Vino OS 3.2: Sviluppo di metodologie bio-molecolari per la decontaminazione/degradazione dell’ocratossina A (OTA) nei mosti-vini Partner:  ISPA-CNR (Bari)  ISPA-CNR (Lecce)  IBBE-CNR Soggetto attuatore:  D.A.Re. scrl

31 Avanzamento OS 3.2

32 Stato di avanzamento delle attività (al 30/04/2013)  Task 3.2.1: Isolamento e caratterizzazione di popolazioni microbiche in grado di degradare l'OTA (M1-24)  stato: in corso (65 % completamento)  Task 3.2.2: Identificazione di geni codificanti gli enzimi correlati alla degradazione di OTA in isolati microbici naturali (M7-34)  stato: in corso (40 % completamento) OR Mesi Attività OR 3 OS 3.2 A3.2.1.aXXXXXXXXXXXX A3.2.1.b XXXXXXXXX A3.2.1.c XXXXXXXXX A3.2.2.a XXXXXX A3.2.2.b XXXXXXXXXXXXXXX A3.2.2.c XXXXXXXXXXXXXXXXX A3.2.3.a XXXXXXXXXXXX A3.2.3.b XXXXXXXXXXXX

33 Risultati Principali - Task (ISPA CNR)  Attività a - Individuazione dei campi e campionamento Sono stati individuati 4 vigneti rappresentativi dell’areale di coltivazione delle varietà Negroamaro e Primitivo. Sono stati effettuati campionamenti di terreno, tralci e grappoli.  Attività b - Analisi chimica E’ stata messa a punto una metodica analitica per la determinazione simultanea di OTA e OTalpha nei diversi substrati liquidi mediante HPLC/FLD.  Attività c - Analisi microbiologica Due fermentazioni spontanee, effettuate utilizzando le uve Negroamaro e Primitivo sono state campionate durante 5 fasi del processo. E’ stata studiata la dinamica di popolazione di lieviti in vinificazione spontanee. Sono stati isolati e identificati 35 ceppi di lievito per ciascuna delle 5 fasi E’ stata indagata la capacità di degradare OTA da parte di 96 ceppi di batteri malolattici.

34 Risultati Principali - Task (ISPA CNR, IBBE CNR)  Attività a - Messa a punto di metodiche estrazione di DNA e RNA dai campioni di mosto Il metodo di estrazione di DNA messo a punto consente, partendo da matrici complesse derivate dalla filiera vitivinicola, di ottenere materiale genetico appartenente a microrganismi anche molto distanti dal punto di vista tassonomico (procarioti ed eucarioti). Sequenziamento su vasta scala dell’intero metagenoma o metatrascrittoma Estrazione del DNA appartenente all’intera comunità microbica Screening di particolari marcatori genetici di specie che sono selettivamente sequenziati CAMPIONE Caratterizzazione bioinformatica della complessità genetica e tassonomica della comunità microbica Il metodo sviluppato prevede l’associazione di un kit commerciale di estrazione del DNA da suolo (FAST DNA kit for soil della DBA Italia) con una serie di trattamenti sviluppati per eliminare le impurità e, quindi, aumentare la resa di estrazione e successiva amplificazione di marcatori genetici per la creazione di librerie di sequenziamento NGS.

35 Risultati Principali - Task (ISPA CNR, IBBE CNR) Mosto ad inizio fermentazione Acqua di lavaggio dei grappoli CampioneResa DNA (ng/μl) Purezza A 260 /A bp Estrazione del metagenoma Acqua di lavaggio dei grappoli Mosto  Attività a - Messa a punto di metodiche estrazione di DNA e RNA dai campioni di mosto : RISULTATI

36 28S rDNA its1 its4 5.8S rDNA ITS1ITS2 18S rDNA pb (variabile in relazione alla specie) Amplificazione del marcatore tassonomico fungino: rDNA ITS1-5.8S-ITS2 M bo Dimensione attesa dell’amplicone Amplificazione del marcatore tassonomico batterico: Gene codificante per l’rRNA 16S 1500 pb Dimensione attesa dell’amplicone M 11 16Sd 16Sr Primers ITS1/ITS4: 5’-GTTTCCGTAGGTGAACCTGC-3’/5’ TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ Cavalieri, D. et al (2003). J. Mol. Evol., 57, S226–S232. Primers 16Sd/16Sr: 5’-GCTGGCGGCATGCTTAACACAT-3’/5’-GGAGGTGATCCAGCCGCAGGT-3’ Ruiz, A. et al (2000 Int. J. Syst. Evol. Micr., 50,

37 OR 5 – Strumenti di Controllo Innovativi per la Determinazione di Contaminanti in Cereali e Derivati OS 2.3: Messa a punto di una metodica analitica per la determinazione di fitofarmaci in uva e vino e produzione di materiali di riferimento OS 5.1: Messa a punto di una metodica analitica per la determinazione di fitofarmaci in cereali, produzione di miscele standard e materiali di riferimento Partner:  Lab. Instruments srl  ISPA-CNR (Bari) Soggetto attuatore:  D.A.Re. scrl

38 Avanzamento OS 2.3

39 Avanzamento OS 5.1

40 Stato di avanzamento delle attività (al 30/04/2013)  Task Studio di fattibilità, sviluppo di materiali di riferimento (RM) e loro certificabilità per l’analisi multi residuale di fitofarmaci nella matrice vino mediante strumenti di controllo innovativi (M1-36)  stato: in corso (50% completamento)  Task Sviluppo e validazione di metodiche multiresiduali in alta risoluzione (LC-HRMS) per la determinazione di fitofarmaci untargeted nel vino (M7-36)  stato: in corso (20% completamento) OR Mesi Attività OR 2 OS 2.3 A2.3.1.aXXXXXXXXXXXX A2.3.1.bXXXXXXXXXXXXXXXXXX A2.3.1.c XXXXXXXXXXXX A2.3.1.d XXXXXXXXXXXX A2.3.1.eXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX A2.3.1.f XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX A2.3.1.g XXXXXXXXXXXXXXXXXX A2.3.2.a XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX A2.3.2.b XXXXXXXXXXXX A2.3.2.c XX

41 Stato di avanzamento delle attività (al 30/04/2013)  Task 5.1.1: Individuazione delle sottoclassi di fitofarmaci, studio dell’effetto matrice (frumento) sull’analisi strumentale di fitofarmaci, di solubilità, stabilità ed allestimento delle aliquote da destinare al proficiency test (M1-30)  stato: in corso (50% completamento)  Task 5.1.2: Sviluppo e confronto di metodiche di rivelazione basate sull’uso di spettrometri di massa ad alta risoluzione (untargeted analysis) e spettrometri a triplo quadrupolo (targeted analysis) (M7-36)  stato: in corso (20% completamento) OR Mesi Attività OR 5 OS 5.1 A5.1.1.aXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX A5.1.1.b XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX A5.1.2.a XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX A5.1.2.b XXXXXXXXXXXX

42 Risultati Principali – Task e (Lab.Instruments)  Task e Task 5.1.1: studio di fattibilità e sviluppo di materiali di riferimento Materiali di riferimento in soluzione standard -Approvvigionamento -Allestimento di soluzioni di singoli fitofarmaci e caratterizzazione delle caratteristiche chimico-fisiche e redazione di “schede prodotto” (circa 220) -Individuazione di sottoclassi da raggruppare in miscele -Allestimento di miscele -Avviamento dell studio di stabilità delle miscele

43 Risultati Principali - Task e (Lab.Instruments)  Task e Task 5.1.2: studio di fattibilità e sviluppo di materiali di riferimento Materiali di riferimento in matrice -Raccolta di informazioni in merito all’utilizzo cultivar-specifico di fitofarmaci -Screening e caratterizzazione delle matrici “bianche” per l’allestimento di materiali di riferimento  Da un set di 20 campioni di VINO BIANCO (circa 2 L per campione) raccolti da produttori privati sono stati selezionati 8 campioni con tenore di fitofarmaci inferiore al limite di rivelabilità  E’ un corso la caratterizzazione di un set di 20 campioni di FRUMENTO (duro e tenero) provenienti dal mercato locale

44 Risultati Principali MISCELA ORGANOTIOFOSFORATI/ N-CARBAMOIL-OSSIME Aldicarb Aldicarb sulfossido Aldicarb sulfone Valutazione di N-carbamoil-ossime in solvente organico, monitoraggio delle potenziali variazioni temporali dei rapporti tra segnali relativi a differenti “metaboliti”, studio della sensitività della classe, valutazione della stabilità accelerata e temporale in matrice Dimethoate Omethoate Studio degli isosteri, eventuale interconversione in solvente Formetanate hydrocloride Methamidophos Methomyl Oxamyl Phosdrin Monocrotophos Vamidothion Fenthion o sulfossido Demeton-s-methyl sulfossido Demeton-s-methyl sulfone Incusione di differenti organofosforati e di analoghi al fine di caratterizzare sul sistema analitico di riferimento le posizioni relative dei segnali (ottimizzazione della fase cromatografica), valutazione degli eventuali isomeri strutturali, scelta delle condizioni di ionizzazione ottimali che permettano un sufficiente grado di sensitività della miscela. ESEMPIO: miscela formulata per essere inclusa nella matrice VINO

45 Risultati Principali - Task e (Lab.Instruments)  Task e Task 5.1.2: sviluppo di metodiche multiresiduali basate sulla spettrometria di massa ad alta risoluzione (LC-HRMS) Ottimizzazione delle condizioni strumentali (rivelazione in HRMS e MS/MS) mediante analisi delle soluzioni di fitofarmaci allestite nell’ambito delle Tasks e Sviluppo di procedure di preparazione del campione (QuEChERs sviluppati dalla Lab Instrument s.r.l.)

46 OR 5 – Strumenti di Controllo Innovativi per la Determinazione di Contaminanti in Cereali e Derivati OS 5.2: Messa a punto di una metodica multi-micotossina in cereali e derivati e produzione di materiali di riferimento Partner:  ISPA-CNR (Bari)  Lab. Instruments srl Soggetto attuatore:  D.A.Re. scrl

47 Avanzamento OS 5.2

48 Stato di avanzamento delle attività (al 30/04/2013)  Task 5.2.1: Produzione di materiali di riferimento (farine di frumento e mais) multi-micotossina (M1-36)  stato: in corso (50% completamento)  Task 5.2.2: Sviluppo di metodiche multianalita LC-MS(MS) per micotossine in cereali e prodotti derivati (M1-36)  stato: in corso (50% completamento) OR Mesi Attività OR 5 OS 5.2 A5.2.1.aXXXXXX A5.2.1.bXXXXXX A5.2.1.c XXXXXX A5.2.1.d XXXXXX A5.2.1.e XXXXXXXXXXXX A5.2.1.f XXXXXXXXXXXX A5.2.2.aXXXXXX A5.2.2.b XXXXXXXXX A5.2.2.c XXXXXXXXXXXX A5.2.2.d XXXXXX A5.2.2.eXXXXXXXXXXXX

49 Risultati Principali- Task (ISPA-CNR) Livelli desiderati (µg/kg) MAISFRUMENTO DON750 ZEA10075 FB 1 + FB n.a. T-2 + HT Aflatossine totali44 OTA33 Per i livelli target ci si è riferiti ai regolamenti 1881/2006/EC (aflatossine e OTA), 1126/2007/EC (DON, ZEA, fumonisine) e alla raccomandazione 2013/165/EU (somma di T-2 e HT-2) delle quali sono stati considerati i limiti massimi stabiliti per frumento e mais destinati al consumo umano diretto.  Task 5.2.1: Produzione di materiali di riferimento (farine di frumento e mais) multi-micotossina

50 Risultati Principali – Task (ISPA-CNR) MAIS naturalmente contaminato da DON, FB 1, FB 2 (30 kg) Estratti da colture di F. sporotrichioides (T2-HT2) F. gramienarum (DON-ZEA) A.flavus (AFs) A. parasiticus (AFs) A. ochraceous (OTA) Miscelazione e omogeneizzazione Suddivisione in aliquote da 80 g Studio di OMOGENEITA’ STABILITA’  La stessa strategia è stata utilizzata per la produzione del FRUMENTO contaminato da tossine di Fusarium e OTA

51 Risultati Principali – Task (ISPA-CNR) Micotossine sottoposte a regolamentazione Riferimento normativo Deossinivalenono (DON)Regolamento 1126/2007/EC Zearalenone (ZEA)Regolamento 1126/2007/EC Fumonisine(FB 1 + FB 2 )Regolamento 1126/2007/EC Tossine T-2 e HT-2Raccomandazione 2013/165/EU Aflatossine totali (AFB 1 + AFB 2 AFG 1 + AFG 2 )Regolamento 1881/2006/EC Ocratossina A (OTA)Regolamento 1881/2006/EC Micotossine emergentiMotivazione Nivalenolo (NIV)Opinione EFSA (EFSA Journal 2013;11(6):3262) 3 e 15-acetil DONInclusi dal JECFA nel PMTDI insieme al DON (JECFA/72/SC) DON-3-glucosideContaminante naturale insieme al DON, richiesti dati di incidenza (JECFA/72/SC) T-2 e HT-2 glucoside Contaminante naturale insieme a T-2 e HT-2, richiesti dati di incidenza (Raccomandazione 2013/165/EU) Fumonisine idrolizzateContaminanti naturali del mais e/o prodotte durante il processamento del mais  Task 5.2.2: Sviluppo di metodiche multianalita LC-MS(MS) per micotossine in cereali e prodotti derivati

52 Risultati Principali – Task (ISPA-CNR) Estrazione sequenziale acqua e metanolo (4 min) Purificazione su IAC MULTI-ANTICORPO Frumento Mais Snack a base di mais Cereali per colazione Analisi LC-MS/MS NIV DON AFB 1, B 2, G 1, G 2 OTA FB 1, FB 2 OTA ZEA T-2, HT-2 3-/15-AcDON DON-3-glucoside HT-2/T-2-glucoside PHFBs, HFBs …altri metaboliti…. Analisi LC-HRMS Purificazione su colonnine SPE APPROCCIO ALTERNATIVO

53 OR 5 – Strumenti di Controllo Innovativi per la Determinazione di Contaminanti in Cereali e Derivati OS 5.3: Messa a punto di una metodica analitica unica per la determinazione di fitofarmaci e micotossine in cereali e derivati Partner:  BonassisaLab srl  Università degli Studi di Foggia, Dipartimento Di Scienze Agrarie, degli Alimenti e dell’Ambiente (SAFE) Soggetto attuatore:  D.A.Re. scrl

54 Avanzamento OS 5.3

55 Stato di avanzamento delle attività (al 30/04/2013) OR Mesi Attività OR 5 OS 5.3 A5.3.1.aXXXX A5.3.1.b XXXXXXXXXX A5.3.1.c XXXX A5.3.1.dXXXX XXXXXXXXXXXXXX  Task 5.3.1: Sviluppo di una metodica unica per la determinazione di fitofarmaci e micotossine in cereali e derivati (M3-36)  stato: in corso (42% completamento)

56 Risultati Principali – Task (BonassisaLab) I principali risultati scientifici:  Implementazione, validazione e accreditamento di un metodo per la determinazione di micotossine su filiera cerealicola: 10 g campione – estrazione con miscela acetonitrile/acqua/acido acetico in rapporto 1:2– nessuna fase di purificazione – analisi in LCMSMS  Implementazione, validazione di un metodo per la determinazione di residui di fitofarmaci in cereali e derivati: 10 g campione – estrazione con acetonitrile acqua – purificazione con SPE – analisi LCMSMS e GCMSMS  Sviluppo di una metodica unica per la determinazione di micotossine e pesticidi 10 g campione estrazione con miscela acetonitrile/acqua formiata (5mMol ) – analisi LCMSMS e GCMSMS

57 Risultati Principali – Task (BonassisaLab)  Metodo multi-micotossina LC/MSMS: Determinazione di tutte le 11 micotossine normate nel REG CE 1881/2006 (aflatossine, ocratossina A, deossinivalenolo, zearalenone, tossine T-2 e HT-2, fumonisine) RISULTATI DELLA VALIDAZIONE In conformità al Reg. CE 401/2006 sono stati valutati i criteri di rendimento del metodo per ciascuna micotossina, pertanto è stata calcolata sia la deviazione standard relativa (RSDr ), calcolata a partire dai risultati ottenuti in condizione di ripetibilità, sia il recupero attraverso un’aggiunta in matrice. CRITERIO DI IDONEITA’ ALLO SCOPO Il laboratorio ha verificato un’incertezza massima standard adeguata per tutte le micotossine

58 Risultati Principali – Task (BonassisaLab)  Metodo LC-MS/MS per la determinazione di 270 fitofarmaci Validazione del metodo in accordo con: Document No. SANCO/10684/2009 METHOD VALIDATION AND QUALITY CONTROL PROCEDURES FOR PESTICIDE RESIDUES ANALYSIS IN FOOD AND FEED

59 Risultati Principali – Task (BonassisaLab)  Multi GC/MSMS: metodo da 350 molecole

60 OR 5 – Strumenti di Controllo Innovativi per la Determinazione di Contaminanti in Cereali e Derivati OS5.4: Sviluppo di metodi rapidi per la determinazione di micotossine in cereali e derivati Partner:  ISPA-CNR (Bari)  Molini Tandoi Spa Soggetto attuatore:  D.A.Re. scrl

61 Avanzamento OS 5.4

62 Stato di avanzamento delle attività (al 30/04/2013)  Task 5.4.1: Messa a punto di immunosaggi a polarizzazione di fluorescenza (FP) per la determinazione di OTA, DON e tossine T-2 e HT-2 in cereali e prodotti derivati (M1-30)  stato: in corso (60% completamento)  Task 5.4.2: Messa a punto di un saggio lateral flow (LF) per la determinazione di OTA in cereali e prodotti derivati (M13-36)  stato: in corso (15% completamento)  Task 5.4.3: Messa a punto di metodi di spettroscopia nel vicino infrarosso (FT-NIR) per la determinazione semi-quantitativa/qualitativa di DON e OTA in cereali e prodotti derivati (M3-36)  stato: in corso (30% completamento)  Task 5.4.4: Messa a punto di un metodo basato sul naso elettronico con tecnologia MOS per la determinazione di DON e OTA in cereali e prodotti derivati (M5-36)  stato: in corso (40% completamento)

63 Risultati Principali – Task (ISPA-CNR)  Attività a – Sintesi e isolamento di derivati fluorescenti (traccianti) delle micotossine: Sono stati sintetizzati, isolati e caratterizzati i traccianti (1 per il DON, 4 per T-2 e HT-2 e 1 per OTA). Obiettivo intermedio a 12 mesi (almeno 1 tracciante per tossina): raggiunto  Attività b – Studio dell’interazione tracciante- anticorpo e messa a punto di un metodo competitivo in soluzione Sono stati sviluppati tre immunosaggi competitivi per la determinazione di DON, T-2+HT-2 e OTA in soluzione.

64 Risultati Principali – Task (ISPA-CNR)  Attività c – Sviluppo di un protocollo di estrazione compatibile con l’immunosaggio e valutazione delle performance analitiche dell’immunosaggio FP E’ stato sviluppato e validato un immunosaggio FP per la determinazione di OTA in frumento. Lippolis V., Pascale M., Valenzano S., Porricelli A.C.R., Suman M. and Visconti A. (2013), Food Analytical Methods, DOI /s Sensibilità (LOD; LOQ)0.8 µg/kg; 2.0 µg/kg Accuratezza (media)87% (range 3-10 µg/kg) Precisione (CV %)  6% Intervallo di linearità2 – 12.5 µg/kg Tempo di analisi  20 min

65 Risultati Principali – Task (ISPA-CNR)  Attività a - Messa a punto di un saggio LF basato sull’utilizzo dell’aptamero per la determinazione di OTA in soluzione E’ stata valutata l’affinità di 7 diversi aptameri per l’OTA.

66 Risultati Principali – Task (ISPA-CNR, Molini Tandoi)  Attività a - Selezione di campioni di cereali e prodotti derivati naturalmente contaminati previa analisi con metodo analitico di riferimento Sono stati analizzati mediante metodi HPLC di riferimento : 186 campioni di frumento duro naturalmente contaminati da DON (105 selezionati att a); 37 campioni di crusca di frumento duro naturalmente contaminati da DON; 9 campioni di farinaccio di frumento duro naturalmente contaminati da DON; 20 campioni di frumento duro naturalmente contaminati da OTA.  Attività b - Sviluppo di rette di calibrazione e di modelli discriminanti FT- NIR specifici per ciascuna micotossina e matrice selezionata Sono stati costruiti un modello quantitativo (retta PLS) e un modello qualitativo (modello discriminante) per la predizione del contenuto di DON in campioni di crusca di frumento duro.

67 Risultati Principali – Task (ISPA-CNR)  Attività a - Calibrazione del naso elettronico per la classificazione di campioni di cereali e prodotti derivati a differente contenuto di DON e OTA E’ stato sviluppato un modello di calibrazione per la discriminazione di campioni di frumento duro a differente contenuto di DON mediante naso elettronico a tecnologia MOS. Analisi (n=525) Analisi DFA* 105 campioni (macinato) Classe A ([DON, µg/kg]<1000) - Campioni conformi Classe B (1000 ≤ [DON, µg/kg] ≤ 2500) - Campioni all’analisi di conferma Classe C ([DON, µg/kg]>2500) - Campioni non conformi

68 OR 6 – Strumenti Innovativi per la Prevenzione del rischio di Contaminazione di Prodotti Freschi OS 6.2: Impiego di compost e strategie agronomiche innovative per ridurre il contenuto di metalli pesanti nelle produzioni orticole da consumo fresco Partner:  ISPA-CNR (Bari)  Università degli Studi di Bari – Dipartimento di Scienze del Suolo, della Pianta e degli Alimenti (DiSSPA) Soggetto attuatore:  D.A.Re. scrl

69 Avanzamento OS 6.2

70 Stato di avanzamento delle attività (al 30/04/2013)  Task 6.2.1: Individuazione e valutazione di differenti compost idonei all’impiego come substrati di coltivazione e/o ammendanti in orticoltura (M13-35)  stato: in corso (60% completamento) OR Mesi Attività OR 6 OS 6.2 A6.2.1.aXXXXXXX A6.2.2.a XXXXXXXXXXXX A6.2.2.b XXXXXXXXXXXX A6.2.3.a XXXXXXXXXXXX A6.2.3.b XXXXXXXXXXXX A6.2.4.a XXXXXXXXXXXX A6.2.4.b XXXXXXXXXXXX A6.2.4.c XXXXXXXXXXXX

71 Risultati Principali – Task (ISPA-CNR, UNIBA)  Task 6.2.1: Individuazione e valutazione di differenti compost idonei all’impiego come substrati di coltivazione e/o ammendanti in orticoltura Saggi di fitotossicità su compost: 4/10 – ISPA. I saggi di fitotossicità, al momento della presentazione del report, hanno presentato tutti valori > 60 % di germinabilità (valore imposto dalla legge). Analisi fisiche sui compost: 4/10 – ISPA.

72 Risultati Principali Task (ISPA-CNR, UNIBA) Compost Elementi Fe° Mn° Cu° Zn° Ti° Pb* Ni* Co* Cr* Cd*n.d. * Determinati mediante ICP-OES; °determinati mediante XRF; n.d.: non rilevabile Contenuto medio di metalli nei compost analizzati (mg kg -1 peso secco) Analisi chimiche dei metalli pesanti sui compost: 8/10 – DiSSPA

73 OR 7 – Strumenti di Controllo Innovativi per la Determinazione di Metalli Pesanti e Microrganismi Patogeni in Prodotti Freschi OS7.1: Sistemi innovativi per la diagnosi rapida di metalli pesanti in prodotti freschi Partner:  ISPA-CNR (Lecce)  Università del Salento, Dipartimento di Scienze e Tecnologie Biologiche e Ambientali (DiSTeBA)  Biotecgen s.r.l. Soggetto attuatore:  D.A.Re. scrl

74 Avanzamento OS 7.1

75 Stato di avanzamento delle attività (al 30/04/2013)  Task 7.1.1: Messa a punto di sistemi innovativi per la rivelazione di metalli pesanti in matrici alimentari mediante la spettroscopia ATR-FTIR e microbilance piezoelettriche (M1-36)  stato: in corso (50% completamento) OR Mesi Attività OR 7 OS 7.1 A7.1.1.aXXXXXXXXXXXXXXXXX A7.1.1.b XXXXXXXXXXXXXXXXXXX A7.1.1.c XXXXXXXXXXXXXXXXXX

76 Risultati Principali – Task (UNISALENTO, ISPA-CNR)  Attività a - Spettroscopia IR su prodotti freschi Sono state condotte misure atte a testare la validità del protocollo per l’estrazione di metalli pesanti da matrici alimentari messo a punto dall’unità di ricerca del CNR ISPA di Lecce al fine di effettuare le indagini mediante spettroscopia IR per lo studio dei segnali differenziali derivanti dalla decomplessazione dei gruppi ligandi. Sono stati testati diversi protocolli sperimentali per la definizione della composizione chimica, della temperatura e del pH delle soluzioni per il trattamento di alimenti da sottoporre ad analisi ATR-FTIR differenziale. Messa a punto di un dispositivo per le indagini mediante spettroscopia IR in modalità differenza sui campioni ottenuti. In questo modo è stato possibile ottenere ciclicamente la decomplessazione dei metalli e la contemporanea acquisizione di spettri differenza (legato meno non legato), in maniera tale da evidenziare i segnali IR associati ai cambiamenti di singoli gruppi funzionali coinvolti nel binding. AB

77 Risultati Principali – Task (UNISALENTO, ISPA-CNR)  Attività b - Spettroscopia IR su materiali idrofobici ad alta affinità per gli ioni metallici tossici : Le attività hanno riguardato lo studio di materiali ad alta affinità e selettività per ioni metallici tossici (nichel, cobalto, cromo, cadmio), idonei alla preparazione di strati attivi stabili e la definizione di parametri analitici (sensibilità, selettività, ecc.) di sensori chimici a trasduzione ottica nel range IR basati sugli strati attivi selezionati. Sono state eseguite indagini per l’identificazione degli strati attivi caratterizzati dai migliori parametri di sensibilità, stabilità, rapidità, riutilizzabilità e selettività. In particolare è stato visto che i leganti azotati, quali NH e CN piridinici, possono essere utilizzati nel binding specifico di nichel e cadmio, monitorato mediante spettroscopia IR. Sono in corso altre analisi per l’individuazione di ulteriori strati attivi per il legame con il piombo, il cromo e il cobalto.

78 Risultati Principali – Task (UNISALENTO, Biotecgen)  Attività c - Funzionalizzazione di cristalli di quarzo con specifici ligandi per l’analisi degli ioni metallici con microbilance piezoelettriche Le attività hanno riguardato lo studio e l’individuazione dei materiali, della tipologia di deposizione e dello spessore degli strati attivi scelti. Questi sono stati impiegati come sensori piezoelettrici mostrando risultati promettenti per la messa a punto definitiva. Sono state condotte prove sperimentali per la definizione della tipologia di deposizione su quarzo piezoelettrico e dello spessore dello strato attivo in grado di garantire le migliori prestazioni nell’analisi di metalli pesanti in mezzo acquoso. È stato possibile dimostrare che ligandi tiofenici mostrano buone potenzialità per il sensing del piombo e del cadmio. Struttura chimica del polimero tiofenico utilizzato nel sensore.

79 OR 7 – Strumenti di Controllo Innovativi per la Determinazione di Metalli Pesanti e Microrganismi Patogeni in Prodotti Freschi OS 7.3: Sviluppo di sistemi di allerta rapidi per la presenza di Listeria e Salmonella in tagli bovini prima della destinazione d’uso Partner:  ISPA-CNR Lecce  Biotecgen srl  Industria Ciullo Carni srl Soggetto attuatore:  D.A.Re. scrl

80 Avanzamento OS 7.3

81 Stato di avanzamento delle attività (al 30/04/2013)  Task 7.3.1: Analisi bioinformatica e progettazione e sperimentazione di DNA arrays (M1-18)  stato: in corso (100% completato)  Task 7.3.2: Analisi su matrice complessa (M1-22)  stato: in corso (65% completato)  Task 7.3.3: Messa a punto di sistemi di rilevamento dei patogeni tramite protein chip biosensori, DNA microarrays, e immunosensori lateral flow (M4-28)  stato: in corso (40% completato) OR Mesi Attività OR 7 OS 7.3 A7.3.1.aXXXX A7.3.1.b XXXXXX A7.3.1.c XXXXX A7.3.1.d XXXXXX A7.3.2.aXXXX A7.3.2.b XXXXXXXXXXX A7.3.2.c XXXXXXXXXX A7.3.2.d XXXXXXXXXXX A7.3.3.aXXXX A7.3.3.b XXXXXX A7.3.3.c XXXXXX XXXXXX A7.3.3.d XXXXXXXX A7.3.3.e XXXXXXXXXX

82 Risultati Principali  Messa a punto del protocollo per il Lateral Flow ImmunoAssay  Messa a punto del protocollo per i protein chip Immunoassay

83 Lateral Flow Immuno Assays: risultati Risultati preliminari mostrano l’attuale limite di detection del metodo è di UFC/ml di Salmonella HF240 HF 180 Alta Porosità ottima mobilità Lateral Flow Assay: complessi batteri-anticorpi-goldQD migrano per capillarità fino a incontrare l’anticorpo fissato alla membrana Scelta della membrana

84 Protein-chips per Salmonelle: risultati di ibridazione A: con anticorpi fluorescenti (anti-Salmonelle) B: colorante lipidico fluorescente, C: marcatore di membrana fluorescente Protein Chip Assays A B C Protein-chips per Listeria 1a, 1b: Campioni di Listeria catturati, rilevati in fluorescenza blu Limite di detection: 1000 UFC/ml Ab control Diluizioni scalari L L L L Ab control

85 OR 8 – Scale Up Industriale degli Strumenti Preventivi, di Controllo e Correttivi Messi a Punto nel Progetto

86 Avanzamento OS 8.1 – 8.2 – 8.3

87 % Rendicontato Progetto di Ricerca

88 Rendicontazione Ricerca Industriale

89 Rendicontazione Sviluppo Sperimentale

90 Rendicontazione Totale Progetto di Ricerca

91 Soggetti Partner coinvolti nei SAL I-II-III Enti di Ricerca  ISPA CNR  IBBE CNR  Università degli Studi di Foggia: - Dipartimento SAFE  Università degli Studi di Bari: - Dipartimento di Medicina Veterinaria - Dipartimento DISSPA  Università del Salento: - Dipartimento DiSTeBA Aziende  BonassisaLab srl  Lab.Instruments srl  Industrie Fracchiolla srl  Molini Tandoi spa  Biotecgen srl

92 % Avanzamento Rendicontazione per Partner SAL I – II - III

93 Conclusioni  I risultati scientifici fino ad ora conseguiti confermano la possibilità di perseguire gli obiettivi di ricerca ambiti in fase di progettazione iniziale.  Le difficoltà nell’espletamento di alcune attività progettuali sono dovute all’impossibilità, da parte di Amministrazioni di alcuni Partner, di effettuare anticipazioni. Per il buon esito del progetto si rendono, pertanto, necessarie: -Proroga -Rimodulazione dei costi e di alcune attività progettuali a causa di criticità emerse soprattutto alla luce della rinuncia, da parte di 3 aziende partner, alla partecipazione al progetto.

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95 Proposta di Rimodulazione Principali modifiche richieste:  Proroga al 30/06/2013 e aggiornamento GANTT  Riduzione/Azzeramento della voce di costo «Strumenti e Attrezzature» per taluni partner e ridistribuzione del budget tra le altre voci di costo  Rinuncia alla partecipazione di progetto da parte dell’azienda Centro Latte Stasi srl e sostituzione con l’azienda Sanguedolce srl  Rinuncia alla partecipazione di progetto da parte di Azienda Viti-vinicola Incoronata e Coop. Lavorazione Prodotti Agricoli e ri-attribuzione dei relativi budget a D.A.Re.  Sostituzione del task relativo alla messa a punto di biosensori per la determinazione simultanea di glucosio ed alcol nelle uve con un task di maggiore coerenza con l’obiettivo generale del progetto SIMISA. Tale task riguarderà lo sviluppo e validazione di una metodica analitica ICP-OES per la determinazione simultanea di potassio e metalli pesanti nelle uve e vino.

96

97 RAZIONALI DELLA RIMODULAZIONE La rimodulazione che si intende proporre rispetto al capitolato approvato deriva dall’esigenza di adeguare gli obiettivi inizialmente previsti rispetto alla nuova pianificazione temporale e ai vincoli formali conseguenti all’attivazione dei percorsi formativi. L’obiettivo formativo A (ricercatori) non prevede più che i destinatari siano inseriti in un programma di Dottorato di Ricerca, non essendoci le condizioni amministrative e regolamentari per l’inclusione di dottorati nei programmi universitari in corso nel periodo del progetto, ma che siano laureati selezionati in base procedure di evidenza pubblica, dove il titolo di Dottore di Ricerca verrà valutato con un punteggio aggiuntivo nella griglia di valutazione dei titoli prevista dalla procedura selettiva stessa; Sia l’obiettivo A che l’obiettivo B (tecnici) saranno esplicati mediante due corsi di formazione, senza titolo legale, banditi dal CNR in partenariato con i partner di progetto.

98 RAZIONALI DELLA RIMODULAZIONE E’ stato ridotto il numero di ore di didattica passando da ore della proposta iniziale approvata a 1888 ore dell’attuale. Tale riduzione è dovuta alla sopravvenuta esigenza di non effettuare due edizioni del corso dell’obiettivo A. Si prevede infatti di realizzare solo una edizione di tale percorso didattico, non essendo possibile rispettare la tempistica inizialmente prevista, a causa dell’allungamento dei tempi di finanziamento del progetto e della conclusione delle procedure burocratiche di avvio dello stesso Il numero dei formandi è rimasto invariato per entrambi i corsi (10 per corso) Il valore della borsa di studio nell’obiettivo A è stato diminuito in modo tale da veicolare le risorse ottenute all’aumento del valore della borsa nell’obiettivo B È stato innalzato il limite di età per i formandi portandolo ai 32 anni o 35 anni se in possesso di dottorato di ricerca A causa dei ritardi dovuti all’iter di approvazione del progetto stesso si rende necessaria una proroga con slittamento della scadenza del progetto a giugno 2015

99 RAZIONALI DELLA RIMODULAZIONE Si è previsto l’ingresso di due partner del progetto di ricerca (Bonassisa e Labinstruments) anche nel progetto di formazione per le attività del modulo B- affiancamento on the job con spostamento di risorse dal partner CNR-ISPA Per adeguamento alle sopravvenute esigenze organizzative, sono state attribuite ore di docenza al partner UNIFG sia nell’ambito dell’obiettivo A che nell’ambito dell’obiettivo B Il costo complessivo del progetto è stato mantenuto come da decreto. I costi totali dei partner UNIFG e D.A.Re sono rimasti invariati, mentre il costo totale del partner CNR-ISPA è diminuito per l’attribuzione di risorse ai nuovi partner di progetto. In tutti i partner presenti da capitolato tecnico approvato, si sono apportate variazioni alle interno delle singole voci di costo, in alcuni casi anche attivando nuove voci di costo, a causa di una più efficiente allocazione delle risorse rispetto alle attuali necessità e durata delle attività.

100 RIMODULAZIONE FINANZIARIA TOTALE COSTI DA DECRETO PROGETTO CAMPANIAPUGLIA87.3CITAUEX UETOT COSTO PERSONALE DOCENTE SPESE DI TRASFERTA DEL PERSONALE DOCENTE E DEI DESTINATARI DELLA FORMAZIONE ALTRE SPESE CORRENTI STRUEMNTI ED ATTREZZATURE COSTI DI SERVIZI DI CONSULENZA COSTO DEI DESTINATARI TOTALE TOTALE COSTI RIMODULATI CAMPANIAPUGLIA87.3CITAUEX UETOT COSTO PERSONALE DOCENTE SPESE DI TRASFERTA DEL PERSONALE DOCENTE E DEI DESTINATARI DELLA FORMAZIONE ALTRE SPESE CORRENTI STRUMENTI ED ATTREZZATURE COSTI DI SERVIZI DI CONSULENZA COSTO DEI DESTINATARI TOTALE

101 Grazie per l’attenzione!


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