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Metodi per studiare l’espressione dei geni Northern blot Trascrittasi Inversa -PCR (RT-PCR) Ibridazione In situ Trascrizione In vitro DNA Microarray.

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Presentazione sul tema: "Metodi per studiare l’espressione dei geni Northern blot Trascrittasi Inversa -PCR (RT-PCR) Ibridazione In situ Trascrizione In vitro DNA Microarray."— Transcript della presentazione:

1 Metodi per studiare l’espressione dei geni Northern blot Trascrittasi Inversa -PCR (RT-PCR) Ibridazione In situ Trascrizione In vitro DNA Microarray

2 Purificazione dell’RNA Procedura – Lisi delle cellule con un reagente che dissocia le nucleoproteine e inibisce la RNAsi – Rimozione delle proteine – Precipitazione specifica dell’RNA

3 Northern blot Per determinare la dimensione e la quantita’ di specifici mRNA Studi sull’espressione genica

4 Northern blot – Elettroforesi dell’RNA in gel contenente formaldeide per mantenere l’RNA in forma completamente lineare – Trasferimento dell’RNA su una membrana – Ibridazione con una sonda marcata

5 100V0,2A +- generatore di corrente gel di agarosio scatola elettroforetica tampone elettroforetico es. TAE (4mM Tris-acetato, 1mM EDTA, pH 8.0)

6 Gel Elettroforesi- Separa le molecole in base alla dimensione

7 Trasferimento su supporto solido

8 Trasferimento dal gel alla membrana

9 Preparare la sonda per il Northern Blot

10 Ibridazione La sonda marcata e’ aggiunta ad una soluzione contenente il supporto solido che lega l’RNA da analizzare

11 Lavaggio Rimozione della sonda non legata al supporto solido

12 Rivelazione degli ibridi Esposizione di un film se la sonda e’ marcata radioattivamente Se la sonda e’ marcata con un enzima si procede alla reazione enzimatica che produce colore direttamente sul supporto solido

13

14 gel membrana Dopo il trasferimento

15 Northern blot La rivelazione avviene usando: – DNA marcato con radioattivo( 32 P) – DNA marcato con un enzima che catalizza una reazione che produce luce o colore

16 Fig. 5. Northern blot analysis of E. lagascae total RNA from leaves ( L ), germinating seeds ( Se ), roots ( Ro ) and stems ( St ). The blot was hybridized with probes for ElLTP1 ( top panel ) and ElLTP2 ( middle panel ). The bottom panel shows ethidium bromide staining of the gel before blotting. The numbers to the left indicate approximate transcript sizes in kb Northern blot

17 Svantaggi del Northern Blot Richiede grandi quantita’ di RNA E’ un processo lungo e laborioso

18 Trascrittasi Inversa-PCR Rivelazione di mRNA molto rari Analisi di RNA con pochissime quantita’

19 Procedura Purificazione dell’RNA Aggiungere i primer mescolare RNA con la trascrittasi inversa per effettuare la sintesi del primo filamento di cDNA Aggiungere la DNA polimerasi termostabile per effettuare la sintesi del secondo filamento di cDNA e per amplificarlo con i cicli della PCR

20 AAAAA5’ TTTTT Primer 1 3’ 5’ reverse transcriptase (RNA-dependent DNA polymerase) AAAAA TTTTT mRNA cDNA mRNA Remove RNA (RNase A) TTTTT 5´cDNA Add PCR primers Trascrittasi inversa - PCR (RT-PCR) TTTTT 5’3’ 5’3’ Primer 2 Primer 3 5’ 3’ 5’ 3’ Add Taq polymerase. Run PCR

21 l l se r st l se r st pl RT Reverse transcriptase-PCR (= RT-PCR) Epoxide hydrolase

22 Ibridazione dell’RNA in situ Rivelazione di mRNA direttamente su tessuti messi su vetrini da microscopio Preparation of RNA probe with in vitro transcription T7/T3 or SP6 promoter

23 Fig. 7. RNA in situ hybridization with antisense (a-c) and sense (d) RNA probes for ElLTP1. E. lagascae seedlings were collected 7 days after sowing. co Cotyledon, en endosperm, hy hypocotyl, am apical meristem, ro root RNA in situ hybridization Colour substrate: nitro blue tetrazolium (NBT) + 5-bromo-4-chloro-3- indolyl phosphate (BCIP)

24 Northern blotting Probe labeling pBS-SemaIII dATP dGTP dTTP dCTP RNA isolation AAAAAA Gel electophoresis Blotting Hybridization Autoradiography

25 reverse Northern blotting Northernreverse Northern

26 cDNA arrays (continued) macro-arrays –low-density –filter-supported –radioactive probes (duplicates) –low sensitivity –only cDNA clones spotted –cheap

27 cDNA arrays (continued) micro-arrays –high-density –glass-supported –fluorescent probes (single slide) –high sensitivity –ability to spot oligonucleotides –very expensive

28 Tessuto della prostata, normale Tessuto della prostata, tumorale Un microarray è un supporto solido sul quale sono stati posizionati diverse migliaia di cDNA in spot separati. Ciascuno spot rappresenta un gene, in quanto contiene numerose copie di un cDNA corrispondente a tale gene. I microarrays In questo esempio i cDNA sono stati posizionati su di un vetrino, simile ai normali vetrini usati per l’istologia.

29 Microarray technology Microarray synthetized by photolithography or EST/oligo “linking” Probes

30 si confrontano i profili di espressione genica di due campioni differenti. E’ necessario estrarre le molecole di mRNA dai due campioni. Tessuto della prostata, normale Tessuto della prostata, tumorale utilizzo dei microarrays

31 Estrazione dell’mRNA dai 2 campioni di cellule che si vogliono confrontare Conversione in cDNA Marcatura con 2 fluorocromi diversi Riconoscimento tra i cDNA Eccitazione della fluorescenza tramite laser Immagine a colori raffigurante il microarray provenienti dai 2 campioni e quelli già presenti sul microarray (1) (2) (3) (4) (5) (6) Confronto dei profili di espressione genica in due campioni cellulari diversi

32 I puntini gialli corrispondono a geni che sono espressi in uguale quantità nei due campioni. I puntini verdi corrispondono a geni maggiormente espressi nel campione marcato col fluorocromo che emette fluorescenza verde (ad esempio nelle cellule normali). I puntini rossi corrispondono a geni che sono maggiormente espressi nel campione marcato col fluorocromo che emette fluorescenza rossa (ad esempio nelle cellule tumorali). Confronto dei profili di espressione genica in due campioni cellulari diversi


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