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1 Agenti microbici nelle acque e prove interlaboratorio ISS-UNICHIM: F. Pastoni, C. Fontò UNICHIM, Milano valutazioni organizzative e tecniche.

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1 1 Agenti microbici nelle acque e prove interlaboratorio ISS-UNICHIM: F. Pastoni, C. Fontò UNICHIM, Milano valutazioni organizzative e tecniche

2 2 Prova Interlaboratorio ISS-UNICHIM

3 3 Microrganismi di riferimento Escherichia coli NCTC 9001 Enterococcus faecalis NCTC ° ciclo

4 4 Microrganismi di riferimento Escherichia coli NCTC 9001 Clostridium perfringens NCTC ° ciclo

5 5 - Verifica dell’integrità - Verifica dell’integrità Ciascuna lenticula viene esaminata per controllarne la integrità e la rispondenza ai caratteri macroscopici previsti. Prove effettuate sui materiali prima dell’utilizzo

6 6 - Verifica delle caratteristiche microbiologiche - Verifica delle caratteristiche microbiologiche Su un numero statisticamente significativo di lenticule (rispetto al totale utilizzato) vengono preventivamente effettuate tutte le prove microbiologiche previste per verificarne la rispondenza e la omogeneità. Prove effettuate sui materiali prima dell’utilizzo

7 7 Sospensione A-17 Valutazione della carica batterica totale a 22° C ed a 37° C 17° ciclo Determinazioni da effettuare

8 8 Sospensione B 17 Ricerca ed enumerazione di coliformi totali Ricerca ed enumerazione di Escherichia coli Ricerca ed enumerazione di enterococchi, Pseudomonas aeruginosa, Clostridium perfringens 17° ciclo

9 9 Carica batterica totale a 22°C * 17° ciclo Laboratori partecipanti284 Determinazioni totali261 W (segnale di preavviso) 5 (1,9%) A (segnale di intervento)11 (4,2%) Valori di z-score compresi tra -0,5 e +0,5 202 (77,4%) * Sostenuta da E. faecalis

10 10 Tali valori sono da considerare non soddisfacenti e devono costituire un segnale di allarme quando i valori di z-score sono compresi tra -2 e -3 o tra +2 e +3

11 11 I laboratori devono mettere in atto una azione correttiva quando i valori di z-score sono inferiori a -3 o superiori a +3

12 12 Carica batterica totale a 37°C * 17° ciclo Laboratori partecipanti284 Determinazioni totali262 W (segnale di preavviso)2 (0,8%) A (segnale di intervento)13 (4,9%) Valori di z-score compresi tra -0,5 e +0,5 203 (77,5%) * Sostenuta da E. faecalis

13 13 Clostridium perfringens 17° ciclo Laboratori partecipanti284 Determinazioni totali199 Numero di falsi positivi18 (9,0%)

14 14 Coliformi totali 17° ciclo Laboratori partecipanti284 Determinazioni totali263 W (segnale di preavviso)16 (6,1%) A (segnale di intervento)29 (11,0%) Valori di z-score compresi tra -0,5 e +0,5 118 (44,9%)

15 15 17° ciclo Laboratori partecipanti284 Determinazioni totali264 W (segnale di preavviso)18 (6,8%) A (segnale di intervento)21 (7,9%) Valori di z-score compresi tra -0,5 e +0,5 106(40,2%) Escherichia coli

16 16 Enterococchi 17° ciclo Laboratori partecipanti284 Determinazioni totali262 W (segnale di preavviso)4 (1,5%) A (segnale di intervento)7 (2,7%) Numero di falsi positivi6 Valori di z-score compresi tra -0,5 e +0,5 181 (69,0)

17 17 Pseudomonas aeruginosa 17° ciclo Laboratori partecipanti284 Determinazioni totali222 Numero di falsi positivi16 (7,2%)

18 18 Positivo è il quadro ottenuto relativamente alle cariche batteriche totali, sostenute tuttavia dallo stipite di Enterococcus faecalis, specie notoriamente poco sensibile a stress strutturali o connessi a condizioni operative. 17° ciclo Valutazioni tecniche

19 19 Migliorabile il quadro riguardante Escherichia coli, anche in considerazione del probante significato di indicatore di contaminazione delle acque che va riconosciuto a questa specie batterica. 17° ciclo Valutazioni tecniche

20 20 18° ciclo Determinazioni da effettuare Sospensione A-18 Valutazione della carica batterica totale a 22° C ed a 37° C

21 21 Determinazioni da effettuare 18° ciclo Sospensione B 18 Ricerca ed enumerazione di: coliformi totali Escherichia coli Enterococchi Pseudomonas aeruginosa

22 22 Determinazioni da effettuare 18° ciclo Sospensione C-18 Ricerca ed enumerazione di: Clostridium perfringens (spore comprese)

23 23 18° ciclo Carica batterica totale a 22°C * Laboratori partecipanti306 Determinazioni totali278 W (segnale di preavviso) 23(8,3%) A (segnale di intervento) 22(7,9%) Valori di z-score compresi tra -0,5 e +0,5 96(34,5%) * Sostenuta da E. coli

24 24 18° ciclo Carica batterica totale a 37°C * Laboratori partecipanti306 Determinazioni totali281 W (segnale di preavviso)9 (3,2%) A (segnale di intervento)9 (3,2%) Valori di z-score compresi tra -0,5 e +0,5 117 (41,6%) * Sostenuta da E. coli

25 25 18° ciclo Laboratori partecipanti306 Determinazioni totali290 W (segnale di preavviso)28 (9,7%) A (segnale di intervento)46 (15,9%) Valori di z-score compresi tra -0,5 e +0,5 77(26,6%) Escherichia coli

26 26 18° ciclo Coliformi totali Laboratori partecipanti306 Determinazioni totali287 W (segnale di preavviso)14 (4,9%) A (segnale di intervento)36 (12,5%) Valori di z-score compresi tra -0,5 e +0,5 85 (29,6%)

27 27 18° ciclo Pseudomonas aeruginosa Laboratori partecipanti306 Determinazioni totali236 Numero di falsi positivi12

28 28 18° ciclo Enterococchi Laboratori partecipanti306 Determinazioni totali281 Numero di falsi positivi7

29 29 18° ciclo Clostridium perfringens Laboratori partecipanti306 Determinazioni totali206 W (segnale di preavviso)11 (5,3%) A (segnale di intervento)54 (26,2%) Valori di z-score compresi tra -0,5 e +0,5 75 (36,4%)

30 30 Nel 18° Ciclo della Prova Interlaboratorio MIAC si è per la prima volta superato il numero di 300 laboratori partecipanti (per la precisione 306). Dato indubbiamente rilevante, se si considera che al 1° Ciclo MIAC parteciparono 75 laboratori. Non tutti comunque hanno inviato i risultati. 18° ciclo Valutazioni tecniche

31 31 Quadro dei laboratori che hanno inviato i risultati CBT a 22 °C = 278 su 306 CBT a 37 °C = 281 Escherichia coli= 290 Coliformi totali= 287 Enterococchi = 281 Pseudomonas aeruginosa = 236 Clostridium perfringens = ° ciclo Valutazioni tecniche

32 32 Cariche batteriche totali (I) A proposito della carica batterica totale a 22 °C, il numero di strutture analitiche i cui dati sono contrassegnati con “W” e “A” ammontano rispettivamente a 23 (pari al 8,3% sul totale di 278 laboratori) ed a 22 (7.9%). 18° ciclo Valutazioni tecniche

33 33 Cariche batteriche totali (II) Sostanzialmente migliore il dato a 37 °C, con 9 “W” e 9 “A” (su un totale di 281 laboratori pari al 3,2% ciascuno). Su tale quadro, complessivamente soddisfacente, verosimilmente incide il fatto che le cariche batteriche medesime fossero sostenute da uno stipite di Escherichia coli, più facile da riscontrare nelle condizioni colturali proprie della carica batterica a 37 °C. 18° ciclo Valutazioni tecniche

34 34 Escherichia coli e coliformi totali (I) Migliorabile il quadro dei risultati: ben 75 laboratori (25,9% sul totale delle 290 strutture analitiche) ha ottenuto valori cui corrisponde un segnale W o A. Le performance inadeguate vengano da laboratori che da minor tempo partecipano alle prove UNICHIM. Lo stesso tipo di valutazione può essere esteso ai risultati riguardanti i coliformi totali. Una precisazione a proposito del diverso valore assegnato per E. coli e per i coliformi totali: rispettivamente 33,8 e 38,1. Ciò può apparire incongruente, trattandosi di prove condotte su uno stipite di E. coli. 18° ciclo Valutazioni tecniche

35 35 Escherichia coli e coliformi totali (II) Va considerata la maggiore selettività dei substrati di crescita utilizzati per la determinazione di E. coli e quindi la minore capacità di rivivificazione dei microrganismi stressati, quali sono quelli contenuti nei materiali utilizzati nella prova. Ciò riproduce quanto si verifica in campioni naturali: è infatti verosimile ritenere che in un campione di acqua destinato al consumo umano le cellule di E. coli eventualmente presenti non siano in una condizione di piena funzionalità, trovandosi in un habitat molto diverso da quello per loro ottimale. 18° ciclo Valutazioni tecniche

36 36 Enterococchi e Pseudomonas aeruginosa Nessun rilievo particolare a proposito del quadro riguardante gli enterococchi: solo 7 falsi positivi su un totale di 281 risultati pervenuti (2,5%). Non vanno però trascurati le acquisizioni ormai consolidate sulla particolare “robustezza” di questa tipologia di microrganismi. Una situazione non dissimile è quella concernente Pseudomonas aeruginosa, con un totale di 12 falsi positivi su 236 risultati trasmessi, pari al 5,1%. 18° ciclo Valutazioni tecniche

37 37 Clostridium perfringens La valutazione circa il totale di 11 “W” (su 206, pari al 5,3%) e 54 “A” (pari al 26,2%) non può non tener conto del fatto che la determinazione in questione è tecnicamente più problematica rispetto a quelle elencate in precedenza. Da sottolineare inoltre che ben 36 dei 54 “A” sono stati ottenuti da laboratori che da minor tempo partecipano alle prove UNICHIM. 18° ciclo Valutazioni tecniche

38 38 “valore di consenso da laboratori esperti” Viene utilizzato il “valore di consenso da laboratori esperti” secondo quanto stabilito dalla norma ISO Si tratta dei risultati ottenuti da un gruppo di laboratori selezionati sulla base di criteri per quanto più possibile oggettivi (laboratori accreditati che abbiano partecipato con buoni risultati alle precedenti prove interlaboratorio). Criteri di valutazione dei risultati (I)

39 39 Il valore in precedenza richiamato viene utilizzato come termine di confronto per i risultati ottenuti da tutti i laboratori partecipanti alla prova. Criteri di valutazione dei risultati (II)

40 40 Ciò si rivela indispensabile al fine di disporre di risultati verosimili (cioè acquisiti in condizioni operative reali) e di poter pertanto effettuare attendibili valutazioni sui risultati di tutti i laboratori. Criteri di valutazione dei risultati (III)

41 41 I dati comunicati dal fornitore dei materiali di riferimento non sono infatti adeguati per tale tipo di valutazione. Criteri di valutazione dei risultati (IV)

42 42 Il fornitore dei materiali di riferimento conduce infatti le proprie prove in condizioni per certi aspetti ottimali (inoculo per insemenzamento superficiale su Blood agar), non potendo riprodurre tutte le condizioni sperimentali degli utilizzatori dei materiali stessi. Criteri di valutazione dei risultati (V)

43 43 Il fornitore dei materiali di riferimento cerca pertanto di ottenere dei risultati il più vicino possibili al contenuto effettivo delle confezioni (lenticule nel caso specifico). Criteri di valutazione dei risultati (VI)

44 44 In base alla ovvia constatazione di come le lenticule contengano microrganismi stressati (come del resto la stragrande maggioranza dei campioni naturali), l’inoculo su Blood agar consentirà una notevole rivivificazione degli stessi. Criteri di valutazione dei risultati (VII)

45 45 Tale rivivificazione è verosimilmente maggiore di quella che si ottiene con i metodi di norma impiegati nella routine laboratoristica (in particolare quando si impieghino terreni selettivi). Criteri di valutazione dei risultati (VIII)

46 46 Dati interessanti al riguardo vengono comunicati dallo stesso fornitore di materiali attraverso alcune prove parallele condotte sia su Blood agar, sia su terreni di normale utilizzo. Criteri di valutazione dei risultati (IX)

47 47 Esempio 1 Escherichia coli NCTC 9001 Prova su Blood agar = 80 u.f.c. Prova su terreno diverso = 44 u.f.c. Criteri di valutazione dei risultati (X)

48 48 Esempio 2 Klebsiella aerogenes NCTC 9528 Prova su Blood agar = 65 u.f.c. Prova su terreno diverso = 34 u.f.c. Criteri di valutazione dei risultati (XI)

49 49 Esempio 3 Pseudomonas aeruginosa NCTC Prova su Blood agar = 6,88 x 10 3 u.f.c. Prova su PCA = 1,96 x 10 3 u.f.c. Criteri di valutazione dei risultati (XII)

50 50 Prova Interlaboratorio ISS-UNICHIM

51 51 Microrganismi di riferimento Escherichia coli NCTC 9001 Enterobacter aerogenes NCTC ° ciclo

52 52 Microrganismi di riferimento Escherichia coli NCTC 9001 Klebsiella aerogenes NCTC ° ciclo

53 53 In entrambi i cicli, la Prova Interlaboratorio era imperniata sulla ricerca di Escherichia coli, parametro microbiologico regolamentato per legge nel caso delle acque di scarico. 2°-3° ciclo Valutazioni tecniche

54 54 I risultati riguardanti Escherichia coli (relativamente ai campioni positivi) appaiono piuttosto contrastanti nei due cicli (risultati complessivamente migliori nel 2° ciclo rispetto al 3° ciclo). Va comunque rilevato come la maggioranza i risultati valutati come “A” e “W” provengano da laboratori che partecipano solo da tempi recenti alle Prove Interlaboratorio. 2°-3° ciclo Valutazioni tecniche

55 55 Soddisfacenti i risultati concernenti Salmonella sp., anche se i campioni predisposti erano in tutti i casi negativi per questo parametro. Valutazioni tecniche 2°-3° ciclo

56 56 Non appare proponibile approfondire ulteriormente le valutazioni concernenti questa Prova Interlaboratorio, essendo la attuale casistica limitata a soli tre cicli. Valutazioni tecniche 2°-3° ciclo

57 57 I campioni di prova nelle PI sono sostanzialmente “facili” (si tratta di sospensioni ottenute unicamente dalle lenticule, pertanto con caratteristiche microbiologiche più semplici di analoghi campioni naturali, in quanto ad es. privi di germi “interferenti”). Considerazioni per la valutazione dei risultati

58 58 I laboratori partecipanti utilizzano metodi di prova di comune impiego. Le determinazioni analitiche, stabilite da disposizioni di legge vigenti, rappresentano la attività routinaria dei laboratori. Considerazioni per la valutazione dei risultati

59 59 Le determinazioni analitiche sono del tutto programmabili, in termini di organizzazione delle attività dei laboratori, essendo note con consistente anticipo le date di invio dei materiali di prova. Qualunque campione naturale che pervenga in laboratorio non è sempre, ovviamente, programmabile. Considerazioni per la valutazione dei risultati

60 60 I materiali di prova, nella “confezione” in cui vengono inviati (lenticule), risultano di utilizzo quanto mai pratico e semplice. Considerazioni per la valutazione dei risultati

61 61 La esigenza di predisporre dei campioni di prova contraddistinti da caratteristiche microbiologiche il più possibile riconducibili a quelle proprie delle acque destinate al consumo umano induce a delineare protocolli di esecuzione delle prove talvolta contraddistinti da diversi passaggi (predisposizione di sospensioni, diluizioni, ecc.). Si tratta tuttavia di procedure che non dovrebbero costituire difficoltà particolari per laboratori accreditati o comunque “allineati” ai criteri di qualità. Considerazioni per la valutazione dei risultati

62 62 La ricostituzione dei campioni di prova partendo dalle lenticule fornite ai laboratori rappresenta contestualmente un momento di rivivificazione dei microrganismi presenti. Imprecisioni nella fase di ricostituzione dei campioni possono quindi influenzare la rivivificazione. Qualunque campione “naturale” di acqua contiene comunque, verosimilmente, microrganismi stressati. Considerazioni per la valutazione dei risultati

63 63 Imprecisioni nella esecuzione del protocollo indicato possono indurre effetti non trascurabili sui risultati (ad esempio fenomeni di sedimentazione delle sospensioni, causate da una non efficace agitazione delle medesime prima del loro utilizzo, che determinano errori di valutazione in particolare quando si prelevino aliquote ridotte, come 1 ml. nel caso della valutazione di cariche batteriche totali). Considerazioni per la valutazione dei risultati

64 64 Prove interlaboratorio UNI CEI EN ISO/IEC “Assicurazione della qualità dei risultati di prova e di taratura” …partecipazione a programmi di prove interlaboratorio…

65 65 “Dinamica” di una prova interlaboratorio:  effettuazione di determinazioni analitiche su campioni dalle caratteristiche note;  possibilità di confrontare i risultati effettivamente ottenuti con quelli attesi;  riferimento ai risultati conseguiti dagli altri laboratori partecipanti alla prova.

66 66 I presupposti tecnico-organizzativi di una prova interlaboratorio prevedono necessariamente l’impiego di materiali di riferimento, cioè campioni noti contenenti stipiti batterici provenienti da collezioni internazionali, in attesa di potersi avvalere in futuro di campioni naturali: ciò, presumibilmente, nell’ambito della microbiologia applicata, non potrà avvenire in tempi brevi.

67 67 L’utilizzo di una tale tipologia di campioni consente lo sviluppo di una efficace capacità critica, derivante dalla possibilità di valutare le prestazioni del proprio laboratorio in virtù del confronto tra i risultati ottenuti e : o quanto atteso sulla base di riscontri inoppugnabili (caratteristiche note all’origine); o i risultati conseguiti da altri laboratori (talvolta ben più significativi rispetto ai valori precedenti, in considerazione delle condizioni reali da cui derivano).

68 68 Valutazioni conclusive Miglioramento graduale dei risultati, nel caso di svariati laboratori, in particolare quelli che hanno partecipato ad un certo numero di prove. “Effetti” delle prove interlaboratorio

69 69 Diffusione della “cultura” della qualità, anche desumibile dal rapporto sviluppato con i laboratori partecipanti. “Effetti” delle prove interlaboratorio Valutazioni conclusive

70 70 Grazie per l’attenzione


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