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How can you explain human complexity when we have so few protein coding genes, e.g. about 5,000 less than a cucumber? Isabella Ceccherini UOC Genetica.

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1 How can you explain human complexity when we have so few protein coding genes, e.g. about 5,000 less than a cucumber? Isabella Ceccherini UOC Genetica Medica, IGG 17 Febbraio2015

2 C-value* paradox non vi è relazione tra il C-value di un organismo e la sua complessità biologica * C-value=quantità di DNA in un set aploide

3 G-value* paradox non vi è relazione tra il G-value di un organismo e la sua complessità biologica * G-value=numero di geni presenti in un corredo aploide C. elegans = 959 o 1031 cellule ma stesso numero di geni che nell’uomo Pulce d’acqua e afide del pisello = molte migliaia di geni più che nell’uomo (≥35.000)

4 Perché organismi tanto semplici necessiterebbero di tanti geni? 1.Pressione selettiva per l’adattamento a ambienti e predatori diversi 2.Espansione di famiglie di geni tipicamente coinvolti nella risposta a stimoli ambientali es.: roditori hanno più recettori olfattivi (cambio adattativo), primati hanno più geni codificanti miRNA (hanno contribuito allo sviluppo cerebrale)

5 Come fanno organismi tanto complessi con un numero di geni relativamente basso?

6 Se non è il numero di geni il determinante primario della complessità di un organismo, cosa è allora? Proporzione di DNA non codificante, aumenta dai Metazoi semplici a quelli complessi (es.: da 75Mb in C. elegans a 3070Mb nell’uomo) Tra il DNA non codificante si trovano aumentate: - le regioni non tradotte di geni codificanti proteine (5’ UTR e 3’ UTR), sede di sequenze regolatorie - le regioni altamente conservate (es.: si equivalgono alla porzione codificante in Drosophila, 4 volte la porzione codificante nell’uomo) Splicing alternativo, raro nei Metazoi semplici ma presente nella maggioranza (>80%) dei geni umani Poliadenilazione alternativa

7 Regolazione dell’espressione genica considerata quale responsabile di molte delle differenze fenotipiche tra specie comparando l’espressione genica genome-wide in tessuti equivalenti da DNA umani e da DNA di primati non umani è emerso che sono i geni codificanti fattori di trascrizione quelli che mostrano con più alta probabilità differenze tra le due specie

8 Cellule umane specializzate mostrano patterns distinti di espressione genica

9 La regolazione dell’espressione genica prevede il coordinamento di una serie di eventi che dall'attivazione della trascrizione di un gene, conducono alla produzione della proteina corrispondente. Il controllo di questi processi è molto fine e la sua complessità aumenta salendo lungo la scala evolutiva.

10 Check points

11 I geni sono inizialmente trascritti come lunghi mRNA precursori che vanno incontro ad una serie di modificazioni nucleari (aggiunta del 5’cap, poliadenilazione e splicing) prima di essere esportati nel citoplasma. Modificazioni post-trascrizionali dell’RNA

12 Splicing alternativo (AS) dell’RNA Permette ad un singolo gene di codificare isoforme multiple di trascritti, un modo per generare diversità funzionale nel proteoma cellulare Avviene in quasi ogni gene umano e, mentre in alcuni casi deriva da imprecisioni nel complesso macchinario, in numerosi altri è chiaramente funzionale

13 Nei Vertebrati gli esoni sono molti più corti degli introni. Prima che gli introni vengano rimossi dal trascritto primario, ogni esone è inizialmente riconosciuto da fattori proteici. Meccanismo dello splicing

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16 “U” factors: small nuclear ribonucleoprotein particles (snRNPs)

17 In funzione dello splicing si possono avere 4 tipi di esoni

18 Splicing alternativo (AS) dell’RNA Lo spliceosoma si assembla in base al bilanciamento tra fattori proteici che lo promuovono e fattori proteici che lo sopprimono. Tali fattori possono avere una diversa distribuzione tissutale. Inoltre, i siti di splicing stessi possono essere deboli o forti; gli esoni alternativi possiedono siti di splicing più deboli

19 Controllo dello splicing alternativo

20 Binding of U2 snRNP to the branch site is promoted by the binding of an alternating arginine/serine (RS) domain-containing factor (U2AF) to the polypyrimidine tract (PPT). The large RS domain protein (green oval) represents an SR-related splicing coactivator protein that serves to bridge crossintron, and possibly crossexon, interactions involving snRNPs and ESE bound SR proteins.

21 Risultati dello splicing alternativo Insieme ad esoni alternativi si possono introdurre:  codoni di stop prematuri*,  frameshifts*,  siti per modificazioni post-traduzionali  siti per la localizzazione subcellulare

22 * Splicing alternativo & evoluzione Legano l’apparizione e la moltiplicazione degli introni nei genomi agli effetti benefici del “nonsense mediated decay” (NMD): NMD avrebbe agito come selezionatore degli introni di nuova insorgenza, permettendo che rimanessero nei genomi solo quelli non deleteri Osservano che l’AS e l’NMD sono strettamente accoppiati. Infatti riportano che 1/3 delle varianti AS che esaminano contengono PTCs (premature truncating codons), ossia sono targets di NMD. Questo fenomeno non va visto come uno spreco cellulare ma piuttosto come mezzo per le cellule di regolare l’espressione genica a livello post- trascrizionale in una maniera tempo– e tessuto-specifica

23 Risultati dello splicing alternativo Insieme ad esoni alternativi si possono introdurre:  codoni di stop*,  frameshifts*,  siti per modificazioni post-traduzionali  siti per la localizzazione subcellulare Alcuni recettori di membrana hanno isoforme di membrana e isoforme solubili a seconda dell’inclusione o meno di un dominio TM Due diverse isoforme possono competere, ad esempio per un ligando, determinando conseguenze funzionali

24 Un gene più prodotti genici alternative splicing splicing alternativo della Tropomiosina

25 Lo splicing alternativo può aver generato durante l’evoluzione nuovi geni con nuove combinazione di esoni che specificherebbero per domini diversi a partire dalla ricombinazione tra introni di geni diversi

26 Risultati dello splicing alternativo AS può anche risultare in:  diverse sequenze al 5’UTR e 3’UTR  diversi segnali di poliadenilazione in esoni alternativi 5’UTR è principalmente coinvolto nel controllo della traduzione. 3’UTR regola aspetti multipli del metabolismo dell’mRNA (esporto nucleare, localizzazione citoplasmatica, efficienza della traduzione e stabilità dell’mRNA)

27 Gli mRNA acquisiscono una coda di poli(A) all’estremità 3’- terminale in un processo noto come poliadenilazione

28 Poliadenilazione costitutiva: il gene contiene solo un sito poli(A) Regione codificante non tradotta (UTR)-APA: il gene contiene siti poli(A) multipli localizzati nel 3’UTR. APA risulta in mRNAs con diverse lunghezze del 3’UTR, ma che producono la stessa proteina Regione codificante (CR)-APA: il gene contiene siti poli(A) aggiuntivi localizzati in esoni e introni. APA risulta in mRNAs con diversi 3’UTRs and regioni codificanti C-terminali, che producono isoforme proteiche distinte Uso alternativo di 3’UTR e di siti di poliadenilazione genera un altissimo grado di variabilità di isoforme ≤1/3 geni ≥2/3 genei

29 Sito poli(A) prossimale, normalmente non-canonico e debole. Usato durante la proliferazione, dedifferenziamento e trasformazione cellulare, quando fattori PA up-regolati Sito poli(A) distale, normalmente canonico e forte. Usato durante il differenziamento, quando fattori PA down-regolati Pattern di poliadenilazione in diversi contesti cellulari Siti di legame per diversi fattori di trascrizione coinvolti nella proliferazione/differenziamento (E2F, c- myc, and p53) si trovano arricchiti nei promotori di geni codificanti per fattori di poliadenilazione

30 CITOPLASMA mRNA nel citoplasma traduzione Degradazione dell’mRNA Polipeptide Proteina attiva Degradazione della proteina Processamento della proteina (es. Cleavage, modificazioni chimiche) Trasporto alla destinazione cellulare Funziuone cellulare (es. attività enzimatica, supporto strutturale) Ulteriori Controlli Post- trascrizionali Stabilità dell'RNA Inibizione della traduzione di RNA specifici Regolazione dell'efficienza della traduzione Controllo della localizzazione citoplasmatica degli RNA

31 Ancora un supplemento di spiegazione nelle prossime diapositive ………

32 La concentrazione di un mRNA è una funzione del suo grado di sintesi e di degradazione Quando la sintesi è favorita, l’mRNA resterà disponibile più a lungo per essere tradotto, risultando in un più alto livello di prodotto genico La stabilità degli RNAs è regolata fa fattori che agiscono in trans come proteine che legano gli mRNA, miRNA e lncRNA Tutti questi fattori sono regolatori genici post-trascrizionali che legano gli mRNA e possono regolare sia la stabilità dei trascritti che la loro traduzione

33 Regolazione della stabilità dell’mRNA della caseina Elementi AU-rich (AREs) sono elementi destabilizzanti che agiscono in cis (cis-acting), localizzati nel 3’UTR di una varietà di mRNAs a vita corta come quelli per le citochine e i proto- oncogeni. AREs sono riconosciuti da fattori trans-acting alcuni dei quali promuovono mentre altri inibiscono la deadenilazione e la degradazione degli mRNA

34 La selezione dei siti poli(A) genera isoforme di mRNA con diversa localizzazione subcellulare e funzione Eventi nucleari (a) e/o citoplasmatici (b) inducono il rimodellamento del 3’UTR e influenzano la traduzione di isoforme specifiche Meccanismi di localizzazione dell’mRNA e traduzione controllata dal rimodellamento del 3’UTR I trascritti maturi vengono esportati dal nucleo e una volta giunti nel citoplasma:  se l’mRNA è attivamente tradotto, la coda di poli(A) è progressivamente scorciata ad una velocità specifica per ciascun mRNA, determinante la sua emivita  gli mRNAs che devono essere silenziati (non tradotti) sono deadenilati, “decapped “ e avviati all’ mRNA decay In alcuni casi, gli mRNAs che devono essere mantenuti in uno stato dormiente vengono deadenilati e vanno incontro a poliadenilazione citoplasmatica successivamente, ossia quando tornano ad essere traducibili

35 Una isoforma del BDNF con un lungo 3’UTR è trasferita ai dendriti e la sua traduzione in loco è necessaria per manifestare i suoi effetti sulla sfrondatura e la morfologia delle spine dendritiche, oltre che per la plasticità sinaptica Esempi di sintesi proteica locale in neuroni di mammifero Segnali-guida attrattivi o repulsivi dirigono la crescita assonale attraverso riarrangiamenti del cono di crescita. Il riarrangiamento del citoscheletro è indotto, almeno in parte, da traduzioni locali di b-actin (ACTB) o RHOA mRNAs

36 Degradazione dell’mRNA Traduzione Processamento e degradazione delle proteine Modificazioni della cromatina trascrizione Processamento dell’RNA degradazione dell’mRNA traduzione Processamento e degradazione delle proteine Ulteriori Controlli Post-trascrizionali ogni mRNA ha una caratteristica emi-vita, determinata in parte da sequenze al 5’UTR e 3’UTR L’iniziazione della traduzione può essere controllata mediante la regolazione dei fattori di inizio Anche il processamento e la degradazione delle proteine mediante proteasoma (UPS) sono soggetti a regolazione

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39 Cytoplasmic Polyadenylati on Promotes Translation in Some mRNAs In immature oocytes, many mRNA containing U rich and short poly (A) are inactive for translation. These mRNAs have to be polyadenylated in the cytoplasm before they can be activated for translation. The best-characterized cytoplasmic polyadenylation element, CPE, whose consensus U(4– 5)A(1–2)U is highly conserved, binds the CPE binding protein (CPEB) and recruits its interacting partners, the poly(A) ribonuclease (PARN) and the poly(A) polymerase GLD2. As PARN activity is higher than GLD2, in the cytoplasm, the poly(A) tails of CPE-containing RNAs are shortened and translation is repressed. Extracellular stimuli that activate protein synthesis induce phosphorylation of CPEB, resulting in dissociation of PARN from the ribonucleoprotein complex and GLD2-dependent elongation of mRNA poly(A) tails


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