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1. Invito alla biologia.blu B – Biologia molecolare, genetica ed evoluzione 2 H. Curtis, N. S. Barnes, A. Schnek, G. Flores.

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2 Invito alla biologia.blu B – Biologia molecolare, genetica ed evoluzione 2 H. Curtis, N. S. Barnes, A. Schnek, G. Flores

3 La regolazione dell’espressione genica Curtis et al. Invito alla biologia.blu © Zanichelli editore

4 4 L’importanza della regolazione  La regolazione genica “è la capacità di una cellula di controllare l’espressione dei suoi geni” e in tal modo di regolare quel processo mediante cui l’informazione portata da un gene viene trasformata in un prodotto funzionale di natura proteica;  i geni possono essere attivati o disattivati al momento opportuno per evitare un inutile dispendio energetico : “ tenere in funzione moltissimi geni anche quando non servono comporta un dispendio di energia inutile”.

5 5 Curtis et al. Invito alla biologia.blu © Zanichelli editore 2012 L’importanza della regolazione  In E. coli la presenza di lattosio come alimento induce la sintesi dell’enzima beta-galattosidasi, che lo scinde;  la presenza dell’amminoacido triptofano nel terreno di crescita inibisce invece la produzione degli enzimi per la sua sintesi interna.

6 6 Curtis et al. Invito alla biologia.blu © Zanichelli editore 2012 L’importanza della regolazione Durante le diverse fasi dello sviluppo vengono espressi geni diversi per l’emoglobina con diversa affinità per l’ossigeno.

7 7 Curtis et al. Invito alla biologia.blu © Zanichelli editore 2012 L’importanza della regolazione L’esperimento di Gurdon sulle rane ha dimostrato che “nelle cellule mature non si perde DNA funzionale e i geni non sono inattivati in modo definitivo”. Quindi il differenziamento delle cellule di un organismo pluricellulare dipende dall’inattivazione di certi gruppi di geni e dall’attivazione di altri.

8 8 Curtis et al. Invito alla biologia.blu © Zanichelli editore 2012 L’importanza della regolazione  Il genoma è lo stesso per tutte le cellule di un organismo. Ciò che cambia è il proteoma: l’insieme delle proteine espresse da una cellula;  durante il differenziamento i geni vengono espressi in sequenza temporale controllata.

9 Il controllo genico nei procarioti Il controllo può avvenire in una delle tre fasi che portano alla sintesi proteica. Avviene soprattutto durante la trascrizione. 9 Curtis et al. Invito alla biologia.blu © Zanichelli editore 2012

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11 Il controllo genico nei procarioti I fattori di regolazione della trascrizione:  sono proteine codificate da geni regolatori;  si legano vicino alla sequenza promotore di un gene(all’operatore);  possono reprimere o attivare la trascrizione;  agiscono a volte con piccole molecole effettrici che ne modificano la conformazione. I geni costitutivi non subiscono questo controllo, sono sempre attivi perché codificano per proteine indispensabili durante l’intera vita della cellula. Curtis et al. Invito alla biologia.blu © Zanichelli editore

12 Il controllo genico nei procarioti Curtis et al. Invito alla biologia.blu © Zanichelli editore A Attivatori e repressori sono particolari proteine codificate dai geni regolatori che si legano in vicinanza del promotore (all’operatore) e possono agire o da controllo negativo (repressori) impedendo la trascrizione dell’mRNA o da controllo positivo (attivatori) favorendo la sua trascrizione. B Su questi attivatori o repressori si legano anche delle piccole molecole effettrici che modificandone la struttura li attivano o disattivano. dell’operatore

13 13 Curtis et al. Invito alla biologia.blu © Zanichelli editore 2012 Il controllo genico nei procarioti Nei procarioti i geni strutturali che codificano per polipeptidi con funzione correlata[p.es. tre polipeptidi (enzimi) che lavorano in un’unica sequenza biochimica] vengono spesso trascritti sullo stesso segmento di mRNA. La traduzione può già avere inizio all’estremità anteriore (5 ’ ) della molecola di mRNA Anche se la restante parte della molecola è ancora in fase di trascrizione.

14 14 Curtis et al. Invito alla biologia.blu © Zanichelli editore 2012 Il controllo genico nei procarioti Operone: promotore + operatore + geni strutturali. I geni regolatori sono sparsi nel cromosoma, non fanno parte dell’operone, ma codificano per attivatori e repressori della trascrizione.

15 15 Curtis et al. Invito alla biologia.blu © Zanichelli editore 2012 I corepressori: il triptofano, se presente nel terreno di coltura, si lega al repressore trp, ne cambia la conformazione permettendogli di legarsi al sito dell’operatore; insieme bloccano la sintesi di triptofano. In questo caso quindi il triptofano attiva il repressore e quindi è un corepressore Il controllo genico nei procarioti Gene regolatore mRNA che codifica il repressore PromotoreOperatore (corepressore) inattivo Repressore trp attivo Promotore Operatore

16 16 Curtis et al. Invito alla biologia.blu © Zanichelli editore 2012 Il controllo genico nei procarioti Gli induttori: il lattosio, se presente nel terreno di coltura, si lega al repressore lac inibendo la sua capacità di legarsi all’operatore; vengono sintetizzati gli enzimi utili alla degradazione del lattosio. In questo caso il lattosio disattiva il repressore e quindi si chiama induttore. (induttore)

17 17 Curtis et al. Invito alla biologia.blu © Zanichelli editore 2012 La regolazione negli eucarioti Come nei procarioti la capacità della RNA polimerasi di legarsi al promotore è regolata da:  attivatori e repressori;  molecole effettrici. Negli eucarioti la regolazione è più complessa perché :  maggior numero di proteine e tipi di cellule diverse;  non ci sono gli operoni(nei quali più geni strutturali venivano trascritti in un’unica molecola di mRNA) perché ogni gene strutturale ha un proprio sistema di controllo e viene trascritto separatamente;  inibizione della trascrizione attraverso l’aggiunta di un gruppo metile al DNA;  attivatori che alterano la struttura della cromatina in certe regioni del DNA consentendo all’RNA polimerasi di riconoscere e raggiungere un gene per dare avvio alla trascrizione. Es. l’enzima “istone –acetiltransferasi” che attacca gruppi acetili alle code N-terminali delle proteine istoniche.

18 18 Curtis et al. Invito alla biologia.blu © Zanichelli editore 2012 La regolazione negli eucarioti  Eterocromatina: cromatina più condensata;  eucromatina: cromatina distesa, permette la trascrizione, presente solo in interfase;  istoni: proteine che mantengono la cromatina spiralizzata;  il grado di condensazione varia da un tipo di cellula all’altro;  eterocromatina permanente: corpi di Barr, centromeri, telomeri e regioni non codificanti.

19 Corpo di Barr nel nucleo in interfase La regolazione negli eucarioti

20 (A) Rappresentazione grafica della fibra da 10 nm, o collana di perle: le perle sono i nucleosomi, formati da proteine( istoni) e DNA. (B) Struttura di un tipico istone del core. La coda N-terminale* è il target della maggior parte delle modificazioni post-traduzionali. Il dominio globulare, formato da tre alfaeliche (cilindri), è implicato nelle interazioni proteina-proteina e nell'avvolgimento del DNA. (C) Immagine schematica del nucleosoma. Il cilindro grigio rappresenta l'ottamero istonico, il tubo blu il DNA. Le code N- terminali degli istoni, non strutturate, protrudono all'esterno del nucleosoma. Il primo livello di organizzazione della cromatina. Ciascun istone dell'ottamero presenta una lunga coda N-terminale che si estende al di fuori del nucleosoma: queste code possono subire numerose modificazioni promosse da specifici enzimi che originano acetilazione, metilazione, ubiquitinazione, fosforilazione della catena laterale (residuo R). Tali modificazioni influiscono sulla struttura della cromatina facilitando la trascrizione di un gene, o la sua inibizione

21 La regolazione negli eucarioti  Acetilazione: l’acetiltransferasi (un enzima) attacca gruppi acetili -COCH 3  Fosforilazione: reazione chimica che consiste nell'addizione di un gruppo fosfato (PO 4 3- )  Metilazione: addizione di un gruppo metile -CH 3 Acetilazione, fosforilazione avvengono sulle code N-terminali delle proteine istoniche, che si allentano, lasciando libero il DNA per la trascrizione. La metilazione avviene sia sulle code N-terminali che sulla citosina del DNA reprime l'espressione genica, incrementando l'interazione tra il DNA e gli istoni.  Nei mammiferi ci sono 50 enzimi che modificano gli istoni, per compattare o despiralizzare la cromatina. Ogni pallino della coda N-terminale corrisponde a un amminoacido: quelli chiari sono stati acetilati (Arg, Lys) o metilati o fosforilati (Ser).

22 L’acetilazione si ha trasferendo un gruppo acetile - COCH 3 ( il donatore è l’AcetilCoA ) su un residuo R della lisina presente all’estremità N-terminale degli istoni. La lisina perde così la carica positiva normalmente presente sull’ N della catena laterale e di conseguenza non si lega più con i gruppi fosfato del DNA che hanno carica negativa. In questo modo la cromatina diventa meno compatta consentendo l’aggancio della RNA polimerasi cioè il processo di trascrizione. Fosforilazione della serina La fosforilazione (reazione chimica che consiste nell'addizione di un gruppo fosfato PO 4 3- ad un amminoacido ) del gruppo ossidrilico presente nella catena laterale (residuo R) della serina per produrre fosfoserina da come risultato che essendo sia i gruppi fosfato della serina che quelli del DNA negativi essi si respingonoe quindi la cromatina diventa meno compatta consentendo il processo di trascrizione. La metilazione (addizione di un gruppo metile -CH 3 ) ha solitamente luogo sui residui R di arginina o lisina presenti all’estremità N-terminale degli istoni e sulla citosina del DNA. La metilazione reprime l'espressione genica, incrementando l'interazione tra il DNA e gli istoni

23 Acetilazione della lisina e conseguenza sulla trascrizione Lisina acetilata Lisina non acetilata eterocromatinaeucrocromatina

24 Metilazione (addizione di un gruppo metile (-CH 3 )) ha solitamente luogo sui residui R di arginina o lisina presenti all’estremità N-terminale degli istoni ma può avvenire anche sulla base azotata citosina del DNA direttamente. La metilazione di solito reprime l'espressione genica, incrementando l'interazione tra il DNA e gli istoni

25 17/08/12 La metilazione della citosina del DNA e delle code N-terminali e la deacetilazione delle code N- terminali trasforma l’eucromatina in eterocromatina nella quale l'espressione genica è repressa, essendo incrementata l'interazione tra il DNA e gli istoni e quindi non essendo consentito l’aggancio della RNA polimerasi cioè il processo di trascrizione eucromatinaeterocromatina

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27 (A) In colore sono evidenziati i residui di H2A, H2B, H3 e H4 coinvolti in eventi di modificazioni post-traduzionali*. Più in particolare, in viola sono indicate le lisine (K) acetilate, in verde quelle ubiquitinate (L'ubiquitina è una piccola proteina regolatoria) e in blu quelle metilate. Sempre in blu sono indicate le arginine (R) soggette a metilazione, mentre in giallo sone evidenziate le serine (S) fosforilate. (B) I residui degli istoni modificati post-traduzionalmente vengono selettivamente 'riconosciuti' da specifici domini proteici. La figura illustra, a titolo esemplificativo, il legame di alcune proteine a residui di H3 modificati. Si noti come la lisina metilata può essere riconosciuta sia da proteine caratterizzate dalla presenza di un cromodominio ( dominio proteico** che riconosce la metilazione N-terminale degli istoni) che da un dominio Tudor (dominio proteico originariamente identificato come una regione di 50 amminoacidi presenti nella proteina codificata Tudor in Drosophila). Lo specifico residuo modificato e la presenza di vicine modificazioni post-traduzionali influenzano quale proteina si debba legare. Le lisine acetilate sono specificamente riconosciute da proteine dotate di un bromodominio; ancora una volta la specificità della proteina legata è funzione del residuo riconosciuto e delle altre modificazioni presenti su quelli vicini. Modificazioni degli istoni del core. *Una modificazione post traduzionale è la modificazione chimica di una proteina successivamente alla sua traduzione. **Si definisce dominio strutturale (o dominio o modulo) di una proteina un'unità globulare o fibrosa formata da catene polipeptidiche ripiegate in più regioni. I domini sono strutture supersecondarie complesse delle proteine.

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29 La regolazione negli eucarioti Il promotore delle cellule eucariotiche è costituito non da una sola unità ma da almeno tre regioni differenti promotore basale Inibitori ( silencer) o 3° regione1° regione2° regione PROMOTORE

30 30 Curtis et al. Invito alla biologia.blu © Zanichelli editore 2012 La regolazione negli eucarioti Il promotore è costituito da tre regioni differenti:  La prima regione detta TATA box, localizza il punto in cui la trascrizione può avere luogo;  La seconda regione (dista 25 paia di B.A.) è il sito di inizio della trascrizione, dove si inserisce la RNA polimerasi;  La terza regione cioè il sito degli elementi regolatori detti enhancer o silencer, (a seconda che favoriscano o inibiscano l’avvio della trascrizione) controllati da proteine chiamate attivatori o repressori e da una proteina chiamata mediatore se molto lontani dalla sequenza promotore. (dista in genere 50 – 100 B.A. ma a volte anche migliaia) Promotore basale

31 31 Curtis et al. Invito alla biologia.blu © Zanichelli editore 2012 La regolazione negli eucarioti Fattori di trascrizione Fattori di trascrizione generali GTF: sono 5 e si legano al promotore basale per consentire l’attacco della RNA polimerasi.

32 32 Curtis et al. Invito alla biologia.blu © Zanichelli editore 2012 La regolazione negli eucarioti  La trascrizione ha inizio quando un attivatore si lega all’enhancer;  gli enhancer sono specifici per ogni tipo di cellula. Meccanismo della trascrizione

33 33 Curtis et al. Invito alla biologia.blu © Zanichelli editore 2012 La regolazione negli eucarioti Se gli enhancer sono lontani dal promotore è necessaria la presenza di un mediatore.

34 5’ Il capping è una delle tappe di maturazione del pre-mRNA a mRNA che consiste nell'aggiunta di un "cappuccio" di 7-metil guanosina al residuo 5-terminale della catena con un insolito legame 5,5' trifosfato (condensazione di una molecola di GTP con il trifosfato dell'estremità del trascritto e metilazione in posizione 7). Questa modificazione è importante per il riconoscimento e l'aggancio appropriato dell'mRNA al ribosoma. Può essere importante anche per altri processi essenziali, come lo splicing ed il trasporto. In oltre questa modificazione rende più stabile l'mRNA. Reazioni di maturazione di un mRNA eucariotico : il cappuccio in 5’

35 La poliadenilazione è un processo che contribuisce alla maturazione dell'pre-mRNA e consiste nell'aggiunta di un numero elevato di A all'estremità 3' della catena di pre-mRNA nascente.In linea generale tutte le molecole di pre-mRNA possono andare incontro alla poliadenilazione ad esclusione delle molecole che codificano per gli istoni. Potrebbe sembrare scontato che queste unità vengano inserite non appena la trascrizione del gene si interrompe ma, in realtà, all'interno del pre- mRNA si trovano sequenze altamente conservate che indicano ad un complesso enzimatico di effettuare un taglio endonucleasico. Il complesso di poliadenilazione, formato da diversi fattori, opera tagli nucleosidici ed è responsabile dell'aggiunta delle A in coda. Il numero di A inserite è molto variabile ma è compreso tra circa cento e duecentocinquanta. Reazioni di maturazione di un mRNA eucariotico : la poliadenilazione in 3’

36 36 Curtis et al. Invito alla biologia.blu © Zanichelli editore 2012 Regolazione post-trascrizionale, traduzionale, post-traduzionale  Splicing alternativo: da un unico gene posso ottenere diversi trascritti e quindi diverse proteine;  modifiche chimiche alla sequenza leader che impediscono l’attacco dell’mRNA ai ribosomi;  RNA interference: piccole molecole di RNA, dette microRNA (miRNA) o short-interfering RNA (siRNA), che interferiscono con l’mRNA, lo neutralizzano o degradano.  repressore traduzionale: si lega all’mRNA quando la proteina è presente in quantità sufficiente;  dopo la traduzione: blocco reversibile o rottura della proteina non più necessaria.

37 Splicing alternativo Regolazione post-trascrizionale Durante la maturazione dell’mRNA la cellula è in grado di assemblare in varie maniere le sequenze codificanti (esoni) trascritte nel pre-mRNA e dare luogo così a proteine diverse a partire dallo stesso gene oppure un gene presente in tipi diversi di cellule dello stesso organismo può dare origine a molecole proteiche diverse oppure lo stesso gene può fornire proteine diverse in momenti differenti dello sviluppo. Le cellule così esibiscono un proteoma* molto grande mantenendo minime le dimensioni del genoma. *l'insieme delle proteine di un organismo o di un sistema biologico, ovvero le proteine prodotte dal genoma.

38 Altro esempio di Splicing alternativo Regolazione post-trascrizionale

39 Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006 La sequenza consenso di Kozak Regolazione post-trascrizionale modificazione chimica Non tutte le regioni della molecola di mRNA corrispondono ad un particolare aminoacido. In particolare, vi è una regione vicino all‘estremità 5’ della molecola nota come la regione non‐tradotta (UnTranslated Region”, UTR) o sequenza “leader”. Negli mRNA umani la lunghezza media del 5’‐UTR è di circa 70 nucleotidi. La UTR è importante perché contiene un sito di legame per il ribosoma. Nei vertebrati si chiama ”Kozak box” ed è costituita dalle basi ACCAUGG. Come è rilevabile, all'interno della stessa sequenza di Kozak è contenuta la tripletta AUG, il codone d'inizio codificante per la Metionina che determina l'avvio della catena polipeptidica di nuova sintesi. Una modificazione chimica della configurazione di detta sequenza può impedire temporaneamente l’attacco del ribosoma all’mRNA e quindi la sintesi proteica.

40 Curtis et al. Invito alla biologia.blu © Zanichelli editore 2011 Regolazione post-trascrizionale A volte i repressori sono piccole molecole di RNA capaci di interferire con l’mRNA. Si chiamano microRNA (miRNA) e RNA interferenti (siRNA). La loro azione consiste nel neutralizzare o demolire le molecole di mRNA quando esse hanno terminato la loro funzione o quando portano informazioni che possono danneggiare la cellula come produrre proteine anomale in grado di generare gravi malattie. Queste brevi sequenze possono essere sintetizzate in laboratorio e offrono prospettive in campo medico. RNA interference (RNA induced silensing complex) E’ un fenomeno comune in natura volto a proteggere l’ospite da RNA a doppio filamento (dsRNAs) estranei (virus) o endogeni (retrotrasposoni)

41 Regolazione traduzionale repressore traduzionale

42 Regolazione post-traduzionale Emivita e degradazione

43 43 Curtis et al. Invito alla biologia.blu © Zanichelli editore 2012 La genetica dello sviluppo Studio dei cambiamenti da zigote a età adulta degli organismi pluricellulari; il genoma di ogni individuo contiene le informazioni per la differenziazione delle cellule e lo sviluppo dell’organismo; fattori di regolazione inducono i geni a spegnersi e accendersi: regolazione genica differenziale.

44 44 Curtis et al. Invito alla biologia.blu © Zanichelli editore 2012 La genetica dello sviluppo Lo sviluppo di Drosophila melanogaster:  Fase I - cellule specializzate trascrivono un gene detto bicoide che si accumula nella parte anteriore, polarizzando la cellula uovo e quindi l’embrione dopo la fecondazione.

45 La genetica dello sviluppo Lo sviluppo di Drosophila melanogaster:  Fase II - si attivano geni che inducono la formazione di un modello corporeo segmentato. Ogni segmento dà origine a parti del corpo dell’adulto (15 segmenti: 3 cefalici, 3 toracici e 9 addominali).

46 46 Curtis et al. Invito alla biologia.blu © Zanichelli editore 2012 La genetica dello sviluppo  Fase III - si attivano i geni omeotici che stabiliscono quali parti del corpo si originano da ogni segmento. Tutti questi geni conservano la stessa sequenza di 180 paia di basi dette homeobox: codificano per proteine che si legano a enhancer specifici, attivando o inibendo gruppi di geni.

47 La genetica dello sviluppo  Fase IV - le cellule si differenziano. Le cellule staminali totipotenti danno origine a tutti i tipi di cellule. Le cellule adulte sono in grado di originare solo cellule del proprio tipo (cellule unipotenti).

48 48 Curtis et al. Invito alla biologia.blu © Zanichelli editore 2012 La proteomica  Proteomica (termine coniato da Mark Wilkins, 1994): comprendere le proteine espresse in una data cellula e metterle in relazione con i geni;  i proteomi di individui diversi presi dallo stesso tipo cellulare saranno simili;  ogni gene può codificare per più di una proteina (splicing alternativo);  trascrittoma: insieme degli mRNA di una cellula, spesso è sufficiente per comprendere le proteine sintetizzate.

49 49 Curtis et al. Invito alla biologia.blu © Zanichelli editore 2012 La proteomica Per capire quali proteine sono sintetizzate da una cellula in un dato momento si usa l’elettroforesi su gel bidimensionale:  le proteine vengono separate in base alla carica netta a un determinato pH;  le proteine vengono poi denaturate e separate in base alla loro massa. Le proteine sono quindi tagliate con enzimi specifici, le proteasi, e identificate con la spettrometria di massa.

50 50 Sadava et al. Biologia La scienza della vita © Zanichelli editore 2010 Per produrre le combinazioni di anticorpi necessarie a difendere l’organismo dagli antigeni non-self, è necessario un meccanismo che produca anticorpi diversi fra loro. La versatilità del genoma eucariotico: la produzione degli anticorpi

51 51 Curtis et al. Invito alla biologia.blu © Zanichelli editore 2012 La proteomica Confrontare i proteomi di cellule sane e malate aiuta nello studio delle malattie genetiche Elettroforesi bidimensionale su gel (A – B)


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