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Enzimi. “Proteine che agiscono da catalizzatori biologici aumentando enormemente la velocità delle reazioni biochimiche”

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Presentazione sul tema: "Enzimi. “Proteine che agiscono da catalizzatori biologici aumentando enormemente la velocità delle reazioni biochimiche”"— Transcript della presentazione:

1 Enzimi

2 “Proteine che agiscono da catalizzatori biologici aumentando enormemente la velocità delle reazioni biochimiche”

3 Alta specificità Alta specificità  dotati di elevatissimo grado di specificità, maggiore di qualunque catalizzatore chimico Alta velocità di reazione Alta velocità di reazione  aumentano la velocità di reazione fino a volte rispetto alla stessa reazione non catalizzata da enzimi Capacità di regolazione Capacità di regolazione  inibizione a feedback, controllo allosterico, modificazione covalente, variazioni della quantità di enzima Agiscono in condizioni moderate Agiscono in condizioni moderate  temperature inferiori a 100 °C, pressione atmosferica, pH neutro Catalizzatori Catalizzatori  in grado di catalizzare molte volte la stessa reazione senza produrre sottoprodotti indesiderati PROPRIETÀ DEGLI ENZIMI

4 Sintesi proteica Zimogeno (precursore) Apoenzima (parte proteica) OLOENZIMA coenzima (vitamina) ione metallico gruppo prostetico (legato covalentemente) Apoenzima(inattivo)

5 Coenzimi CoenzimaPrecursore BiocitinaBiotina 5‘-DeossiadenosilcobalaminaVitamina B 12 Flavin adenin dinucleotideRiboflavina (B 2 )Acido lipoico Nicotinamide adenin dinucleotideAc. Nicotinico Piridossal fosfatoPiridossina (B 6 ) TetraidrofolatoFolato Tiamin pirofosfatoTiamina (B 1 )

6 Elementi inorganici che servono come cofattori di enzimi Cu 2+ Citocromo ossidasi Fe 2+ o Fe 3+ Catalasi, perossidasi K + Piruvato cinasi Mg 2+ Esochinasi, glucosio-6-fosfatasi Mn 2+ Arginasi MoDinitrogenasi Ni 2+ Ureasi SeGlutatione perossidasi Zn 2+ Anidrasi carbonica, alcool deidrogenasi

7 Velocità delle reazioni La velocità di una reazione varia con la temperatura secondo l’equazione di Arrehenius: Velocità = Ae - Ea/RT Dove A è la costante nota come fattore pre-esponenziale, correlata alla frequenza con cui le molecole si urtano con il giusto orientamento ed alla probabilità che la collisione avvenga con un’energia sufficiente a far avvenire la reazione, Ea rappresenta l’energia di attivazione (J mol -1 ), R la costante dei gas (J mol -1 K -1 ) e T la temperatura assoluta X + Y Z

8 Stato di transizione S P Energia Coordinte di reazione ENERGIA DI ATTIVAZIONE EaEa La conversione S --> P è termodinamicamente favorevole (P si trova ad uno stato energetico inferiore rispetto a S), ma la reazione non può avvenire se S non acquisisce sufficiente energia per superare la barriera dell’energia di attivazione

9 Come agiscono gli enzimi? Si combinano transientemente con il substrato e ne abbassano l’energia di attivazione Non spostano l’equilibrio della reazione, ma aumentano la velocità con cui l’equilibrio viene raggiunto Non subiscono modificazioni permanenti durante la reazione e sono subito disponibili per catalizzare una nuovo ciclo di reazione

10 Numero di molecole Energia cinetica delle molecole Molecole con valori medi di energia Molecole che possiedono energia sufficiente per reagire in una reazione catalizzata da un enzima Molecole che possiedono energia sufficiente per reagire in una reazione non catalizzata Distribuzione delle energie cinetiche

11 E + S ES EP E+ P S P Reazione non catalizzata Reazione catalizzata da un enzima

12 Energia Coordinate di reazione E + S ES EP E + P Stato di transizione ΔG° Stato di transizione Stato di transizione E att (enzimatica) E att (non enzimatica) Profilo energetico di una reazione catalizzata da un enzima

13 Misura dell’attività enzimatica Mi permette di determinare la quantità di enzima presente in un campione Solitamente si sfrutta la proprietà intrinseca dell’enzima di catalizzare una reazione

14 Supponiamo di voler determinare la quantità di Lattico deidrogenasi (LDH) presente nel sangue di un paziente Piruvato + NADH Lattato + NAD + LDH ABS Lunghezza d’onda 340 nm NADH NAD +

15 TamponeSubstrato Miscelatampone-substrato Preparazione test Cuvetta (quarzo- vetro-plastica)

16 START Scelta della lunghezza d’onda STOP

17 0.000 minuti ABS 340 nm Spettrofotometro Lunghezza d’onda

18 Spettrofotometro Posizionamento della cuvetta nello spettrofotometro

19 1.546 minuti ABS 340 nm 

20 1.546 minuti ABS 340 nm 

21 1.546 minuti ABS 340 nm 

22 1.546 minuti ABS 340 nm 

23 1.546 minuti ABS 340 nm 

24 1.546 minuti ABS 340 nm 

25 1.546 minuti ABS 340 nm 

26 1.546 minuti ABS 340 nm 

27 1.546 minuti ABS 340 nm 

28 1.546 minuti ABS 340 nm 

29 1.546 minuti ABS 340 nm 

30 1.546 minuti ABS 340 nm 

31 1.546 minuti ABS 340 nm 

32 Aggiunta dell’enzima (cofattore o substrato) Rapido mescolamento

33 1.546 minuti ABS 340 nm  Inizia la reazione enzimatica

34 1.516 minuti ABS 340 nm   

35 1.493 minuti ABS 340 nm     

36 1.479 minuti ABS 340 nm       

37 1.449 minuti ABS 340 nm         

38 1.411 minuti ABS 340 nm           

39 1.390 minuti ABS 340 nm             

40 1.343 minuti ABS 340 nm               

41 1.317 minuti ABS 340 nm                 

42 1.289 minuti ABS 340 nm                   

43 1.274 minuti ABS 340 nm                     

44 1.245 minuti ABS 340 nm                       

45 1.224 minuti ABS 340 nm                         

46 1.189 minuti ABS 340 nm                           

47 1.156 minuti ABS 340 nm                             

48 1.123 minuti ABS 340 nm                               

49 1.098 minuti ABS 340 nm                                 

50 1.053 minuti ABS 340 nm                                   

51 1.012 minuti ABS 340 nm                                     

52 0.994 minuti ABS 340 nm                                       

53 0.964 minuti ABS 340 nm                                         

54 0.938 minuti ABS 340 nm                                           

55 0.910 minuti ABS 340 nm                                           

56 0.889 minuti ABS 340 nm                                             

57 0.868 minuti ABS 340 nm                                               

58 0.861 minuti ABS 340 nm                                                 

59 0.844 minuti ABS 340 nm                                                   

60 0.821 minuti ABS 340 nm                                                     

61 0.803 minuti ABS 340 nm                                                       

62 0.789 minuti ABS 340 nm                                                         

63 0.777 minuti ABS 340 nm                                                           

64 0.759 minuti ABS 340 nm                                                             

65 0.719 minuti ABS 340 nm                                                               

66 0.690 minuti ABS 340 nm                                                                 

67 0.657 minuti ABS 340 nm                                                                   

68 0.634 minuti ABS 340 nm                                                                     

69 0.611 minuti ABS 340 nm                                                                       

70 0.592 minuti ABS 340 nm                                                                         

71 0.558 minuti ABS 340 nm                                                                           

72 0.528 minuti ABS 340 nm                                                                             

73 0.499 minuti ABS 340 nm                                                                              

74 0.459 minuti ABS 340 nm                                                                               

75 0.425 minuti ABS 340 nm                                                                                

76 0.399 minuti ABS 340 nm                                                                                

77 0.384 minuti ABS 340 nm                                                                                

78 0.380 minuti ABS 340 nm  La registrazione viene bloccata                                                                                

79 0.380 minuti ABS 340 nm                                                                                  Determinazione dell’attività enzimatica

80 Occorre calcolare la velocità della reazione Se vengono rispettate determinate condizioni, la velocità della reazione è direttamente proporzionale alla concentrazione di enzima ?

81 E + S ES E + P In condizioni di stato stazionario Velocità= k 3 [ES] k1k1 k2k2 k3k3 k 1 >> k 2 k 1 ≥ k 3 se la concentrazione di substrato è sufficientemente elevata [E]  [ES]

82 E + S ES E + P In condizioni di stato stazionario k1k1 k2k2 k3k3 k 1 >> k 2 k 1 ≥ k 3 Fino a quando [E]>>[S] [E] >>[S] V = costante V = k 3 [ES]  [E]

83 [S] VoVo Andamento della velocità iniziale in funzione della concentrazione di substrato L’equazione matematica che esprime la relazione iperbolica tra la velocità iniziale e la concentrazione del substrato viene detta equazione di Michaelis-Menten V max ½ V max KmKmKmKm v = V max  [S] K m  [S]

84 0.380 minuti ABS 340 nm                                                                                  Determinazione dell’attività enzimatica Pendenza  A/min

85 0.380 minuti ABS 340 nm                                                                                  Determinazione dell’attività enzimatica Velocità costante

86 In condizioni di [S] saturanti In tali condizioni la velocità è direttamente proporzionale alla concentrazione di enzima minuti ABS 340 nm                                                                                  La velocità della reazione non aumenta all’aumentare della concentrazione di substrato

87 Determinazione dell’attività enzimatica UI  A V tot  d t V c = Variazione di assorbimento Volume totale test Coefficiente di estinzione (mM o M) del substrato Camminoottico Tempo Volume enzima Unitàenzimatiche

88 L’attività di un enzima viene misurata in termini di “Unità enzimatiche” o “Unità Internazionali” “Unità enzimatica” Quantità di enzima capace di trasformare una micromole (  mole) di substrato in un minuto per ml di soluzione

89 1 unità di enzima 2 unità di enzima 3 unità di enzima Tempo Velocità Incrementando la concentrazione di enzima aumenta la pendenza della retta In condizioni di [S] saturanti

90 Metodi Continuo A tempo fisso L’operatore segue la reazione “in tempo reale”: è possibile capire se stiamo eseguendo effettivamente una misura di velocità iniziale  la velocità enzimatica deve rimanere costante. In tali condizioni la velocità di reazione risulta direttamente proporzionale alla concentrazione dell’enzima da misurare L’operatore fa partire la reazione e la blocca dopo un periodo di incubazione prescelto  è essenziale che durante tale periodo la reazione sia di ordine zero relativamente alla concentrazione del substrato e la velocità enzimatica sia quindi sempre massima

91 Continuo Tempo ABS v0v0v0v0 Tempo ABS v0v0v0v0 Tempo v0v0v0v0 ABS Problemi di mescolamento, effetto diluizione…. Soluzione concentrata di enzima

92 A tempo fisso Tempo ABS v0v0v0v0 STOP Tempo ABS v0v0v0v0 STOP Tempo v0v0v0v0 STOP Elevata concentrazione di enzima Campione non mescolato, precipitato…..

93 Tipologia di analisi Test semplice: Nella soluzione di reazione è presente un solo enzima. La reazione può essere seguita monitorizzando la scomparsa del substrato, la formazione del prodotto, le variazioni spettroscopiche di qualche coenzima (NADH, NADPH per esempio) Test accoppiato: Si rende necessario quando nessuno dei composti che prendono parte o si formano nella reazione enzimatica può essere sfruttato per seguire l’andamento della reazione. Occorre accoppiare la reazione “primaria” con una seconda reazione definita “indicatrice”

94 A + NADH + H + B + NAD + ABS Lunghezza d’onda 340 nm NADH o NADPH NAD + o NADP + deidrogenasi Test ottico semplice (test di Warburg)

95 Test ottico accoppiato D + NADH + H + E + NAD + deidrogenasi A + B C + D enzima Creatinfosfato+ ADP Acido piruvico + ATP creatinfosfocinasi Glucosio + ATP Glucosio-6-P + ADP esocinasi Glucosio-6-P + NADP + Acido lattico + NADPH + H + Glucosio-6-Pdeidrogenasi

96 Per effettuare un dosaggio enzimatico in maniera corretta occorre: Uniformare la temperatura (30°C) Scegliere il valore di pH ottimale Scegliere il valore di pH ottimale Escludere la presenza di inibitori (reversibili o irreversibili) Escludere la presenza di inibitori (reversibili o irreversibili)


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