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By NA MUTAZIONI NEI GENI STRUTTURALI II: il connettivo Lezione 5.

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Presentazione sul tema: "By NA MUTAZIONI NEI GENI STRUTTURALI II: il connettivo Lezione 5."— Transcript della presentazione:

1 By NA MUTAZIONI NEI GENI STRUTTURALI II: il connettivo Lezione 5

2 By NA FACIES: Estrema fragilita’ delle ossa Ipomineralizzazione Fraquenti fratture congenite Sclere bluastre o blu-grigio(l’OI e’ una patologia del tessuto connettivo e, quindi puo’ coinvelgere tessuti diversi da quello osseo) (n.b la sclera e’ la parte non trasparente della tunica esterna dell’occhio) Crescita anomala del cranio e tardiva chiusura della fontanella anteriore(dopo il primo anno di vita) Sviluppo intellettivo normale Dentinogenesi imperfetta AUTOSOMICA DOMINANTE 1/ IN TUTTO IL MONDO Osteogenesi Imperfetta (OI)

3 By NA Fratture durante l’infanzia, meno frequenti dopo la puberta’. Statura normale, deformita’ minima. Sclere bluastre, denti normali. A volte perdita dell’udito I Gravi deformita’ e fratture ossee congenite. Di solito letale in eta’ perinatale per insufficienza respiratoria II Fratture congenite con progressivo rallentamento della crescita. Denti anormali, sclere bluastre, possibile perdita dell’udito III Fragilita’ delle ossa lieve o moderata, denti anormali, sclere normali o grigiastre, possibile perdita dell’udito IV Classificazione clinica

4 By NA AUTOSOMICA DOMINANTE Genotipo Fenotipo a a a A A A omozigote eterozigote Non affetto AFFETTI Genetica dell’OI

5 By NA VISTI GLI ASPETTI FENOTIPICI DEVE DIPENDERE DA UN DIFETTO DELLA STRUTTURA DEL TESSUTO CONNETTIVO IL COLLAGENE IL COLLAGENE E’ LA PROTEINA PIU’ ABBONDANTE DEL TESSUTO CONNETTIVO OTTIMO CANDIDATO Basi biochimiche dell’OI

6 By NA Esistono tipi diversi di collagene nei vari tessuti. Essi si differenziano per lunghezza, sequenza dei diversi domini, per composizione e dimensione dei peptidi C e N terminali e per proprieta’ fisiche. Il collagene di Tipo I e’ piu’ abbondante in pelle, tendini, ossa e arterie. Questi sono anche i tessuti maggiomente interessati dalla OI N-term Dominio a tripla elicaC-term   Il collagene

7 By NA Sintesi del collagene cfr.testo

8 By NA C OI PELLET CELLULARE MEZZO DI COLTURA COLTURA IN PRESENZA DI 3 H-PROLINA ISOLAMENTO DELLE PROTEINE SDS-PAGE PRO  1(III) PRO  1(I) PRO  2(I) Le proteine sono state tagliate e separate per elettroforesi evidenziando che un frammento del pro  (I) migrava in maniera anomala C’era una delezione nella proteina DIVERSA MIGRAZIONE  DIVERSA PROTEINA Prove del coinvolgimento del collagene nell’OI

9 By NA  1979 YAMAMOTO E CO.isolarono il cDNA del COA1  mRNA del collagene e’ stato estratto dal tessuto osseo di embrioni di pollo e frazionati in base alle dimensioni per centrifugazione su gradiente di saccarosio.  Le diverse frazioni sono state saggiate per la capacita’ di codificare il procollagene in un sistema acellulare per traduzione.  Dalle frazioni capaci di codificare il procollagene e’ stato costruito il cDNA.  Clonaggio del cDNA nel plasmide pBR322 e successiva trasformazione batterica in E.Coli  Trasferimento delle colonie su filtro e ibridazione con il cDNA marcato radiattivamente.  Isolamento colonie positive.  Verifica con saggio di legame al filtro: Denaturazione del DNA del clone positivo. Legame a colonna. Caricamento della colonna con RNA estratto da ossa di pollo. Allontanamento dell’RNA non legato ed Eluizione dell’RNA legato. Test per la produzione di COA1 mediante traduzione in vitro. Clonaggio del gene di OI1

10 By NA  OGNI CATENA DEL COLLAGENE E’ CODIFICATA DA UN GENE DISTINTO. QUESTI GENI PRESENTANO OMOLOGIA DI SEQUENZA ELEVATA. TRAMITE SCREENING DI LIBRARY GENOMICHE E’ STATO POSSIBILE ISOLARE DIVERSI GENI PER IL COLLAGENE.  ESISTONO DIVERSE CLASSI DI COLLAGENE: COLLAGENI FIBRILLARI(DI TIPO I II III V E XI) COLLAGENI NON FIBRILLARI(i domini a tripla elica sono interrotti da domini non a tripla elica) COLLAGENI A CATENA BREVE (TIPO VII)  I GENI PER IL COLLAGENE FANNO PARTE DI UNA FAMIGLIA GENICA (insieme di geni con un elevato grado di omologia di sequenza e codificanti per prodotti con funzione simile o correlata. Possono contenere elemeni non funzionanti detti PSEUDOGENI) I tipi di collagene

11 By NA Tali geni si sarebbero originati in seguito a fenomeni di DUPLICAZIONE di un unico gene ancestrale e successiva diversificazione per effetto di mutazioni nelle diverse copie. geneA mutazione diversificazione duplicazioni FAMIGLIA GENICA1 es.collagene fribrillare FAMIGLIA GENICA2 es.collagene a catena breve Origine della famiglia del collagene

12 By NA  TECNICHE COME COSTRUZIONE DI IBRIDI SOMATICI E IBRIDAZIONE IN SITU HANNO PERMESSO DI MAPPARE QUESTI GENI. SEBBENE DERIVINO DA UN GENE ANCESTRALE COMUNE I GENI PER IL COLLAGENE SONO DISPERSI NEL GENOMA, MAPPANO CIOE’ SU CROMOSOMI DIVERSI: es. il gene per la catena  1(I)(COA1) e’ localizzato sul chr17, mentre esistono geni per altre catene del collagene sui cromosomi 2, 7, 12 etc. E’ VERAMENTE UNA MUTAZIONE IN UNO DI QUESTI GENI A PROVOCARE L’OI???? Mappatura dei geni del collagene

13 By NA L’identificazione di mutazioni nel gene del collagene in casi di OI ha richiesto complesse analisi di linkage tramite polimorfismi di lunghezza dei frammenti di restrizione(RFLP)  RFLP: Variazione della sequenza nucleotidica che interessa il sito di riconoscimento di un enzima di restrizione A1 A2A3B1B2 A1 A3B1B2 mutazione elimina il sito di restrizione endonucleasi Bendonucleasi A Enzima A Enzima B Pattern di ibridazione su filtro

14 By NA Studi di linkage Il cDNA di COL1A2 venne testato nella popolazione generale (normale) per individuare la presenza diRFLP EcoR1 GEL filtro ibridato con cDNA A1 A2 cDNA COL1A2 14Kb A1 A2 A3 3.5Kb 10.5Kb cDNA COL1A2 Se si digerisce il DNA genomico di individui normali che non mostrano la OI presi a caso nella popolazione e si ibrida con il cDNA di COL12A si nota che la regione omologa al cDNA e’ polimorfica: cioe’ nel DNA puo’ essere presente o meno un sito di restrizione. Questo si nota nella popolazione normale.

15 By NA A1 A2 14Kb A1 A2 A3 3.5Kb10.5Kb Omozigoti per allele 14:14/14 A1 A2 A1A2 14Kb A1 A2 A1A2 A3 3.5Kb10.5Kb 3.5Kb10.5Kb Omozigoti per allele 10.5,3.5: 10.5,3.5/ 10.5,3.5 In questo gruppo di individui il cDNA riconosce nel genoma dopo digestione 2 frammenti di = lunghezzae’: 14 kb perche’ su entrambi i cromosomi in quella regione non e’ presente un altro sito QUINDI UNA SOLA BANDA In questo gruppo di individui il cDNA riconosce nel genoma dopo digestione 4 frammenti 2 da 10.5 e 2 da3.5 kb perche’ su entrambi i cromosomi in quella regione e’ presente un altro sito che cade all’interno della regione identificata dal cDNA. QUINDI 2 BANDE Eterozigoti per alleli 14 e10.5,3.5 14/10.5,3.5 In questo gruppo di individui il cDNA riconosce nel genoma dopo digestione 3 frammenti : 1 da 10.5 e 1 da3.5 kb originati dalla digestione di un cromosoma (perche’e’ presente un altro sito che cade all’interno della regione identificata dal cDNA) e 1 frammento da 14 originato dalla digestione dell’ altro cromosoma. QUINDI 3 BANDE

16 By NA /- -/+ -/- -/+ -/- -/- -/+ -/- -/- -/- -/+ -/+ -/+ -/+ -/- -/- +/+ -/+ I II III IV Il polimorfismo non rappresenta la causa dell’OI, ma e’ inprobabile che tale variazione segreghi con il fenotipo OI per caso... LA MUTAZIONE OI DEVE RISIEDERE INSIEME CON IL POLIMORFISMO, CIOE’ NEL GENE COL1A2 Famiglie OI1


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