La presentazione è in caricamento. Aspetta per favore

La presentazione è in caricamento. Aspetta per favore

Il conteggio e la identificazione delle cellule ematiche.

Presentazioni simili


Presentazione sul tema: "Il conteggio e la identificazione delle cellule ematiche."— Transcript della presentazione:

1 Il conteggio e la identificazione delle cellule ematiche

2 Malattie ematologiche attese nel Salernitano N.casi/anno L.A. Mieloide 25 L.A. Linfoide 10 Altre 10 M.di Hodgkin 35 Linfomi non-H 100 Mieloma Multiplo 50 L.Linfatica Cronica 70 L.Mieloide Cronica 15 Totale 315

3 PROBABILITA’ DI CURA IN ONCO- EMATOLOGIA LEUCEMIE ACUTE ANZIANI 10-20% ADULTI 30-40% GIOVANI 50% LINFOMI NH 30-50% L. DI HODGKIN 70-90% MIELOMA MULTIPLO BMT 20-30% CT 3-4 anni ABMT x 2 o più

4 Speranza di guarigione %Remissione % Guarigione L.A. Mieloide L.A. Linfoide: bambini adulti M.di Hodgkin Linfomi non-H Mieloma Multiplo 70 0 L.Linfatica Cronica 90 0 L.Mieloide Cronica 95 TMO 60 IFN 15 Inibitori tirosinkinasi ?

5 L’obiettivo della terapia è sempre la guarigione ? Scelta del trattamento più adeguato vuol dire fare un bilancio fra rischi e benefici attesi. I trattamenti intensivi aumentano le possibilità di guarigione, ma: –espongono a maggiori rischi –peggiorano la qualità di vita

6 Quanto costa curarsi ? 6 mesi di terapia Leucemia - chlorambucilEuro 72 Linfatica - fludarabina Cronica :- fluda+rituximab trapianto autologo anni di terapia Leucemia - idrossiurea Euro 600 Mieloide - interferone alfa Cronica :- trapianto allogenico Glivec

7 MORFOLOGIA CITOFLUORIMETRIA CITOGENETICA BIOLOGIA MOLECOLARE BIOPSIA OSTEOMIDOLLARE VALUTAZIONE MASSE (ecografia, tac….) DIAGNOSTICA DELLE PATOLOGIE ONCOEMATOLOGICHE

8 Antonj van Leeuwenhoek nel 1674 trasmise in una lettera alla Royal Society di Londra la prima descrizione dei globuli rossi Ma molto probabilmente Marcello Malpighi, di Bologna, fu il primo ad osservare i Globuli Rossi nel 1661 nel lume dei capillari di uomo e animale. Egli li descrisse come “globuli rubescenti” e li localizzò nelle arterie e nelle vene che aveva appena scoperto.

9 Nel 1877, con la scoperta della colorazione triacida comincia l’era della MORFOLOGIA EMATOLOGICA

10 Giulio Bizzozero Nel Dicembre 1881 comunicò all'Accademia di Medicina la sua grande scoperta: le piastrine come terzo componente morfologico del sangue e la loro importanza nel processo della trombosi.

11 Strumenti diagnostici del laboratorio di ematologia agli inizi del secolo scorso

12 Per ematocrito si intende il volume compresso (PCV:packed cell volume) occupato dai globuli rossi rispetto al volume totale di sangue Si esprime in percentuale (Ht %). È evidente che il valore dell’Ematocrito è funzione del numero e del volume dei Globuli Rossi Hct = MCV x n. GBR Per ematocrito si intende il volume compresso (PCV:packed cell volume) occupato dai globuli rossi rispetto al volume totale di sangue Si esprime in percentuale (Ht %). È evidente che il valore dell’Ematocrito è funzione del numero e del volume dei Globuli Rossi Hct = MCV x n. GBR Nel 1930, Maxwell Wintrobe standardizza la procedura per l’esecuzione dell’EMATOCRITO

13 MCV Hct / n. GBR MCV Hct / n. GBR MCH Hb / n. dei GBR in milioni MCH Hb / n. dei GBR in milioni MCHC Hb / Hct (GBR x MCV) MCHC Hb / Hct (GBR x MCV) Normocitica MCHC 34 g/L normocromica MCH 29 pg Macrocitica MCHC 30 g/L Ipocromica MCH 29 pg Microcitica MCHC 38 g/L Ipercromica MCH 29 pg Indici di Wintrobe

14 Elettrodo interno Elettrodo esterno Elettrodo esterno Flusso del diluente Vuoto regolato Temps U La variazione d’Impedenza Principio di Coulter (1956) Conta del numero di particelle nell’unità di tempo Volume delle particelle Calcolo automatico del Hct e degli Indici di Wintrobe

15 La misura ottica associa la citometria a flusso e la diffrazione luminosa. Si basa sulla rilevazione dei cambiamenti e sulla deviazione che un fascio di luce subisce quando colpisce una particella La misura ottica associa la citometria a flusso e la diffrazione luminosa. Si basa sulla rilevazione dei cambiamenti e sulla deviazione che un fascio di luce subisce quando colpisce una particella Metodo Ottico

16 Low angle scatter 2 o - 3 o (Volume) High angle scatter 5 o - 15 o (HGB concentration) Metodo ottico : due parametri di riconoscimento per il globulo rosso : Raccolta del segnale a definiti intervalli angolari

17 Da test al giorno a centinaia di test al giorno Tutto ciò rappresentò la prima rivoluzione della ematologia di laboratorio. Quindi, negli anni ’60 si cominciarono a costruire strumenti che fornivano in tempi brevi misurazioni precise, riproducibili ed accurate. Tutto ciò rappresentò la prima rivoluzione della ematologia di laboratorio. Quindi, negli anni ’60 si cominciarono a costruire strumenti che fornivano in tempi brevi misurazioni precise, riproducibili ed accurate.

18 Temps U Occasionalmente 2 o 3 cellule possono passare attraverso l’orificio di conta nello stesso tempo Viene quindi generato un impulso di grande ampiezza La frequenza di questo passaggio in coincidenza è statisticamente prevedibile ed è funzione del numero delle cellule. La correzione viene quindi realizzata automaticamente per gli analizzatori che usano questa tecnologia. Occasionalmente 2 o 3 cellule possono passare attraverso l’orificio di conta nello stesso tempo Viene quindi generato un impulso di grande ampiezza La frequenza di questo passaggio in coincidenza è statisticamente prevedibile ed è funzione del numero delle cellule. La correzione viene quindi realizzata automaticamente per gli analizzatori che usano questa tecnologia. Correzione della coincidenza

19 Flusso di guaina Flusso del campione Focalizzazione Idrodinamica Per ottenere degli impulsi coerenti, viene utilizzato un principio complementare: la focalizzazione idrodinamica. Le cellule sono messe in fila le une dietro le altre e spinte verso la zona di conta. Per ottenere degli impulsi coerenti, viene utilizzato un principio complementare: la focalizzazione idrodinamica. Le cellule sono messe in fila le une dietro le altre e spinte verso la zona di conta. Flusso del campione Flusso di guaina Flusso di guaina

20 CURVA DI DISTRIBUZIONE DEL VOLUME ERITROCITARIO

21 La formula leucocitaria

22 I motivi che hanno portato al tentativo di automatizzare la formula leucocitaria sono: Alto costo Problemi organizzativi Utilità diagnostica dubbia Scarsa precisione I motivi che hanno portato al tentativo di automatizzare la formula leucocitaria sono: Alto costo Problemi organizzativi Utilità diagnostica dubbia Scarsa precisione

23 errori statistici TIPO CELLULARE 100c 500c 1.000c10.000c BASOFILI 0-5.4* * * * EOSINOFILI * * * MONOCITI * * LINFOCITI * NEUTROFILI * HOUWEN B. Laboratory Hematology 7:89-100

24 fL Formula leucocitaria basata sul volume cellulare (3 popolazioni)

25 VOLUMEVOLUME VOLUMEVOLUME Attività perossidasica Densità Nucleare Mn Pmn Volume / Citochimica (perossidasi) / Citolisi (SIEMENS)

26 Diffrazione : Superficie; granulazioni VolumeVolume conduttività Impedenza Conduttività Scatter Volume / Conduttività / Scatter (Coulter)

27 ASSORBANZAASSORBANZA ASSORBANZAASSORBANZA VOLUME Volume / Citochimica / Citolisi (ABX Pentra) VOLUME

28 1°/3° (0°) dimensione 10° Struttura 90°Pol/ 90°dep Granulazioni Fascio laser PolarizzazionePolarizzazione Diffrazione luminosa a 3 diversi angoli (Abbott-Cell-Dyn)

29 Scatter / Fluorescenza / Citolisi / Dimensioni (Dasit-Sysmex)

30 1) Conta e classificazione dei leucociti normali Precisione: si esprime come Coefficiente di Variazione È la capacità di un metodo di ripetere un valore costante Precisione: si esprime come Coefficiente di Variazione È la capacità di un metodo di ripetere un valore costante CV per il metodo manuale: Neutrofili e Linfociti tra 5 e 10% Monociti25% Eosinofili40% Basofili95% CV per il metodo manuale: Neutrofili e Linfociti tra 5 e 10% Monociti25% Eosinofili40% Basofili95% CV per i metodi automatici: Neutrofili e Linfociti < 4% Monociti< 10% Eosinofili< 10% Basofili< 50% CV per i metodi automatici: Neutrofili e Linfociti < 4% Monociti< 10% Eosinofili< 10% Basofili< 50%

31 Accuratezza: è la corrispondenza al vero di una misurazione Il vero in ematologia è rappresentato dal metodo di riferimento che per la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella conta microscopica effettuata: in condizioni standardizzate da operatori qualificati su un numero sufficiente di leucociti (400). Il vero in ematologia è rappresentato dal metodo di riferimento che per la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella conta microscopica effettuata: in condizioni standardizzate da operatori qualificati su un numero sufficiente di leucociti (400). L’accuratezza degli strumenti analitici più evoluti è molto elevata per Neutrofili, Linfociti ed Eosinofili meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica) poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa frequenza di questa classe di leucociti). L’accuratezza degli strumenti analitici più evoluti è molto elevata per Neutrofili, Linfociti ed Eosinofili meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica) poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa frequenza di questa classe di leucociti). 1) Conta e classificazione dei leucociti normali

32 2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature Sensibilità: capacità di riconoscere i campioni contenenti cellule anomale Specificità: capacità di non segnalare i campioni normali Valore predittivo positivo: indica la probabilità che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale; Valore predittivo negativo: indica la probabilità che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie. Valore predittivo positivo: indica la probabilità che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale; Valore predittivo negativo: indica la probabilità che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie.

33 Campione emolizzato WBC

34 Aggregati piastrinici WBC PLT

35 T° < 37°C a 37°C Presenza di crioglobuline PLT

36 Presenza di crioagglutinine GBR HCT 24.3 Hb 13.0 MCV MCH 54.1 MCHC 53.0 CHCM normale GBR HCT 24.3 Hb 13.0 MCV MCH 54.1 MCHC 53.0 CHCM normale

37 Pseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossi Neonati Iperazotemia Iperbilirubinemia Hb patologiche Neonati Iperazotemia Iperbilirubinemia Hb patologiche

38 Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi e non sono in grado di contare e classificare in modo accurato le cellule patologiche. Essi devono: 1)Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali 2)Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi e non sono in grado di contare e classificare in modo accurato le cellule patologiche. Essi devono: 1)Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali 2)Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature

39 Lo striscio di sangue periferico

40

41

42

43 che ci vuole? niente!....

44 La quantità di sangue da strisciare è, entro certi limiti, variabile in funzione delle caratteristiche del campione e di quello che si vuole cercare

45 Dopo aver appoggiato il vetrino il sangue si estende lungo (quasi) tutta la superficie di contatto

46 Difficile fare di peggio… Troppo lungo Troppe curve

47 Troppo corto e spesso Troppo corto e sottile Troppo corto

48

49 I segreti: 1)Asciugare bene 2)Coprire bene 3)Sciacquare bene I preparati per la colorazione variano spesso da lotto a lotto insieme a qualità dell’acqua, temperatura ed umidità dell’aria COLORAZIONE

50 errori metodologici Area densa Zona marginale Area sottile TESTATESTA CORPO IDEALEIDEALE LINFOCITI ++ GRANULOCITI ++ MONOCITI ++

51 B. Bain NEJM 2005

52 Nuovi parametri ematologici

53 Migliorare la capacità del laboratorio nel fornire dati accurati Indirizzare il laboratorista o il clinico verso un sospetto di patologia Fornire uno strumento di monitoraggio di un percorso clinico-terapeutico Aprire nuove frontiere diagnostiche FUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETRO

54 La ricerca industriale ha una indiscutibile (ed accettabile) motivazione economica Raramente un nuovo parametro nasce da una richiesta clinica Il primo target della ricerca industriale è il laboratorista Il passaggio al campo clinico non ha alcun percorso strutturato e consolidato Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale

55 Analizzatore dipendenza Scarso impatto della cultura di laboratorio Difficoltà del laboratorista a comprendere il reale potenziale clinico Scarsa pubblicizzazione in campo clinico OSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETRO

56 Sviluppo della ricerca clinica laboratorio industria nuovi parametri nuovi farmaci sperimentazione preclinica e clinica Paziente “clinici” - laboratoristici sperimentazione esportazione

57 Parametri emocitometrici “tradizionali” “Nuovi” parametri ematologici Operatore Analizzatore Operatore Analizzatore

58 comunicare un allarme strumentale vuol dire comunicare incapacita’ a definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo strumento L’allarme strumentale non è un parametro

59 DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO 1 CITOGRAMMA ERITROCITARIO DI VOLUME E CONCENTRAZIONE DI EMOGLOBINA ipocromia macrocitosi ipercromia microcitosi

60 Densità (concentrazione Hb) VOLUME

61 DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO 1 Caratteristiche degli eritrociti fra microscopia e automazione Anisocitosi Alterazioni morfologiche Microcitosi – Macrocitosi Ipocromia – Ipercromia Poichilocitosi Inclusi eritrocitari MICROSCOPIA AUTOMAZIONE

62 DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO 1 Acantocito = aculeo Codocito = campana cellula a bersaglio Dacriocito = lacrima Drepanocito = falce Ellissocito = ovale Cheratocito = corno Cnizocito = fossetta Megalocito = gigante Schizocito = taglio Stomatocito = bocca Sferocito = sfera emazie a fungo

63 RDWRDW Parametro sintetico (o riduttivo?): è una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica Manca di standardizzazione metodologica, pur avendo una univocità terminologica rara nei nuovi parametri strumentali Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche, con scarso approfondimento fisiopatologico Parametro sintetico (o riduttivo?): è una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica Manca di standardizzazione metodologica, pur avendo una univocità terminologica rara nei nuovi parametri strumentali Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche, con scarso approfondimento fisiopatologico normalenormale elevatoelevato

64 Am J Clin Pathol Sep;80(3): Improved classification of anemias by MCV and RDW. Bessman JDBessman JD, Gilmer PR Jr, Gardner FHGilmer PR JrGardner FH Am J Clin Pathol Sep;80(3): Improved classification of anemias by MCV and RDW. Bessman JDBessman JD, Gilmer PR Jr, Gardner FHGilmer PR JrGardner FH Arch Intern Med Apr;148(4): Erythrocyte anisocytosis. Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution width. Simel DLSimel DL, DeLong ER, Feussner JR, Weinberg JB, Crawford J.DeLong ERFeussner JRWeinberg JBCrawford J Health Services Research Field Program, Durham Veterans Administration Medical Center, NC Arch Intern Med Apr;148(4): Erythrocyte anisocytosis. Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution width. Simel DLSimel DL, DeLong ER, Feussner JR, Weinberg JB, Crawford J.DeLong ERFeussner JRWeinberg JBCrawford J Health Services Research Field Program, Durham Veterans Administration Medical Center, NC 27705

65 RDW E CELIACHIA

66 Increased Red Cell Distribution Width and coeliac disease Brusco G. et al Dig. Liver Dis Increased Red Cell Distribution Width and coeliac disease Brusco G. et al Dig. Liver Dis L’incremento di RDW risulta la più frequente anormalità ematologica ( %) in adulti CD L’incremento di RDW può essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specifici L’RDW elevato è più frequente dell’anemia sideropenica nei pazienti CD L’RDW diviene normale dopo dieta priva di glutine L’incremento di RDW risulta la più frequente anormalità ematologica ( %) in adulti CD L’incremento di RDW può essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specifici L’RDW elevato è più frequente dell’anemia sideropenica nei pazienti CD L’RDW diviene normale dopo dieta priva di glutine RDW: new screening test for coeliac disease? Guglielmi V. et al Minerva Med 2002 RDW: new screening test for coeliac disease? Guglielmi V. et al Minerva Med 2002

67 RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE

68 Am J Cardiol Oct 1;106(7): Epub 2010 Aug 11. Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events. Zalawadiya SKZalawadiya SK, Veeranna V, Niraj A, Pradhan J, Afonso L.Veeranna VNiraj APradhan JAfonso L Department of Internal Medicine, Wayne State University Detroit Medical Center, Detroit, Michigan, USA. Am J Cardiol Oct 1;106(7): Epub 2010 Aug 11. Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events. Zalawadiya SKZalawadiya SK, Veeranna V, Niraj A, Pradhan J, Afonso L.Veeranna VNiraj APradhan JAfonso L Department of Internal Medicine, Wayne State University Detroit Medical Center, Detroit, Michigan, USA. In conclusion, a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk. Exp Clin Cardiol Fall;15(3): High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension. Wen Y. Exp Clin Cardiol Fall;15(3): High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension. Wen Y.

69 Arch Intern Med Mar 9;169(5): Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults. Patel KVPatel KV, Ferrucci L, Ershler WB, Longo DL, Guralnik JM.Ferrucci LErshler WBLongo DLGuralnik JM Laboratory of Epidemiology, Demography, and Biometry, National Institute on Aging, 7201 Wisconsin Ave, Ste 3C309, Bethesda, MD 20814, USA Arch Intern Med Mar 9;169(5): Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults. Patel KVPatel KV, Ferrucci L, Ershler WB, Longo DL, Guralnik JM.Ferrucci LErshler WBLongo DLGuralnik JM Laboratory of Epidemiology, Demography, and Biometry, National Institute on Aging, 7201 Wisconsin Ave, Ste 3C309, Bethesda, MD 20814, USA CONCLUSION: Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older

70 RDWRDW

71 Reticolociti È una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale). Questi precipitano, per effetto dei coloranti sopravitali, formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che è alla base della loro denominazione. È una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale). Questi precipitano, per effetto dei coloranti sopravitali, formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che è alla base della loro denominazione.

72 Definizione morfologica Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o più particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale. Reticolociti e Corpi di Heinz

73 Contengono RNA (colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile) Contengono RNA (colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile) sono più grandi dei globuli rossi MCVr > MCVgbr sono più grandi dei globuli rossi MCVr > MCVgbr possono avere un diverso contenuto di RNA (cioè un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione D’Onofro e Zini “Morfologia del Sangue” D’Onofro e Zini “Morfologia del Sangue”

74 Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es. M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico). Quando la sostanza filamentosa è abbondante, possono assumere l’aspetto di emazie policromatofile, con sfumature di colore bluastro Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es. M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico). Quando la sostanza filamentosa è abbondante, possono assumere l’aspetto di emazie policromatofile, con sfumature di colore bluastro

75 Anche la punteggiatura basofila è un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala.

76 La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive Eritroblasti Ortocromatici Eritroblasti Ortocromatici Reticolociti Midollari Tempo di Permanenza 2-3 giorni Reticolociti Midollari Tempo di Permanenza 2-3 giorni Barriera EMATO- MIDOLLARE Barriera EMATO- MIDOLLARE Reticolociti nel Sangue Periferico Tempo di permanenza giorni Reticolociti nel Sangue Periferico Tempo di permanenza giorni

77 .…strisci non troppo sottili, ma non con cellule sovrapposte….....oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mm… ….fattori importanti sono l’acutezza visiva, la pazienza del tecnico, la qualità ed il potere risolvente del microscopio…. ….nel caso che ci siano pochi reticolociti, è necessario contare un numero elevatissimo di cellule…. CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI Dacie & Lewis MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986

78 Metodi manuali-visuali I coloranti hanno la capacità di indurre l’aggregazione e la precipitazione dei ribosomi, in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma. I coloranti oggi in uso sono: Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine) il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento) l’Azur B I coloranti hanno la capacità di indurre l’aggregazione e la precipitazione dei ribosomi, in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma. I coloranti oggi in uso sono: Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine) il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento) l’Azur B

79 PLT ReticolocitiRBC Metodi citofluorimetrici Auramina-O Arancio di Tiazolo Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza d’onda ed emettono ad una lunghezza d’onda maggiore Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati, sostituiti poi da emocitometri dedicati I parametri misurati sono: l’intensità della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellulari; l’intensità della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA. I parametri misurati sono: l’intensità della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellulari; l’intensità della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA.

80 Viene costruito così un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate: le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensità di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione. Viene costruito così un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate: le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensità di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione. Vantaggi notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manuali obiettività più elevata velocità di esecuzione Vantaggi notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manuali obiettività più elevata velocità di esecuzione

81 Svantaggi la mancanza di calibratori stabili e affidabili la mancanza di materiale di riferimento autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un “zero”) Interferenze Svantaggi la mancanza di calibratori stabili e affidabili la mancanza di materiale di riferimento autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un “zero”) Interferenze Leucocitosi specie Linfocitosi della LLC Leucocitosi specie Linfocitosi della LLC Aggregati piastrinici e macrotrombociti Aggregati piastrinici e macrotrombociti Heinz Jolly plasmodi

82 Nuovo blu di metilene Oxazina 750 Medodi ottici (coloranti sopravitali) Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dell’assorbimento luminoso Viene costruito così un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate: le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensità di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione. Viene costruito così un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate: le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensità di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione.

83 Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazioni: 1)Valori numerici (% e assoluti) 2)Indici di maturazione (LFR, MFR, HFR e IRF) 3)Indici qualitativi a) prevalentemente volumetrici a) prevalentemente volumetrici (MCVr, MRV,…) (MCVr, MRV,…) b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobina b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobina (CHr, Ret He,…) (CHr, Ret He,…)

84

85

86

87

88

89 citogenetica

90 LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA, CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (Bcr/Abl)

91 Traslocazioni cromosomiche Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma all’altro Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia (Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni, dalle inversioni e dalle inserzioni) Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciò può comportare conseguenze: se il gene trasferito è un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto, può risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido Questa è la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi

92 Deregolazione dell’espressione genica:Deregolazione dell’espressione genica: overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene Espressione di una proteina di fusione:Espressione di una proteina di fusione: giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomi Traslocazioni cromosomiche

93 Specificità delle traslocazioni Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia, si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale: esempio tipico la t(15;17) della APL Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(14;18) nel linfoma follicolare, ma è presente anche in altri NHL e nei soggetti normali, sebbene il numero di copie sia molto basso

94 Traslocazioni cromosomiche I geni coinvolti sono per lo piu’ fattori di trascrizione, ma anche tirosin o serin protein chinasi, recettori di membrana cellulare, fattori di crescita, con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo cellulare I geni coinvolti sono per lo piu’ fattori di trascrizione, ma anche tirosin o serin protein chinasi, recettori di membrana cellulare, fattori di crescita, con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo cellulare

95

96 Gene di fusione BCR/ABL Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste nelle cellule normali Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9, con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta “breakpoint cluster region” (BCR) perché è in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma. Il gene di fusione BCR/ABL è specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che l’alterazione cromosomica Ph1 e genica (BCR/ABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica, eritrocitica, piastrinica e linfocitica B)

97 Nelle leucemie acute mieloblastiche, la traslocazione t(8;21) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida. LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)

98 t(15;17)(q22;q21) Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA La traslocazione t(15;17) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dell'acido retinoico (RAR  ) sul cromosoma 17, ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15.

99 Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11 LAM M4 LEUCEMIA ACUTA MIELOMONOCITICA Con eosinofili Inv(16)(p13q22)

100 LIMITI DELLA CITOGENETICA CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia è strettamente correlato alla quantità e alla qualità delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare

101 LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA - Definisce l’origine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi - Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici - Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme all’immunofenotipo - Valuta la risposta ad una terapia evidenziando un’eventuale Malattia Minima Residua - Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo osseo da donatore di sesso diverso

102 FISH (Fluorescent in Situ Hybridization) - Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi - Elevata specificità, sensibilità e rapidità -Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio -Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi

103 ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA Aberrazioni cromosomiche Frequenza (%) CitogeneticaFISH Trisomia q q q69 17p48

104 MALATTIA MINIMA RESIDUA: DEFINIZIONE Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche. Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva.

105 Metodi per lo studio della MRD MetodoCaratteristicheSensibilità Morfologiabassa sensibilità e5% specificità Immuno scarsa specificità 1-5% Fenotipizzazione Citogeneticalento, richiede1% preparazione metafasi FISHlento, applicabile ai nuclei in0.3-5% Iinterfase PCRconoscenza delle sequenze>0.001% falsi positivi


Scaricare ppt "Il conteggio e la identificazione delle cellule ematiche."

Presentazioni simili


Annunci Google