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Metodi di sequenziamento Sanger (enzimatico) Maxam e Gilbert (chimico)

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Presentazione sul tema: "Metodi di sequenziamento Sanger (enzimatico) Maxam e Gilbert (chimico)"— Transcript della presentazione:

1 Metodi di sequenziamento Sanger (enzimatico) Maxam e Gilbert (chimico)

2 Confronto metodi di sequenziamento Sanger  rapida e semplice attuazione  disponibilità di kit  necessità di primer  sensibile a strutture secondarie Maxam e Gilbert  lunga preparazione del DNA  reazioni da mettere a punto  relativamente economico  strutture non influenti  utilizzabile per oligonucleotidi

3 Gel di poliacrilammide di sequenza

4 Sequenziamento automatico

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6 Sequenziamento con Taq polimerasi

7 BLOTTING (TRASFERIMENTO) Molecole trasferite SondaGel SouthernDNA DNA o RNA Agarosio o acrilammide NorthernRNA DNA o RNA Agarosio o acrilammide WesternProteineAnticorpi Acrilammide

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9 carta 3MM membrana nylon gel supporto } carta 3MM tampone vaschetta Assemblaggio del blot capillare

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11 Fattori che influenzano l’ibridazione Temperatura Forza ionica pH

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14 - + tampone carta 3MM spugnette gel membrana nylon Assemblaggio dell’elettroblot

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16 B. LEWIN, IL GENE - Edizione compatta, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2007

17 Analisi di espressione genica

18 Analisi di espressione con Northern blot

19 Altre tecniche di analisi Estensione del primer (primer extension) Protezione dalla S1/RNasi (mapping) RT-PCR (real time QRT-PCR)

20 mRNA totale oligo antisenso marcato mRNA globina cap 5’3’ ibridazione estensione con RT Analisi dei frammenti estesi su gel di sequenza frammento protetto Estensione del primer

21 Protezione da RNasi (RNase Protection) mRNA totale sonda RNA antisenso mRNA globina cap 5’3’ ibridazione trattamento con RNasi Analisi dei frammenti protetti su gel di sequenza frammento protetto inizio trascrizione

22 MICROARRAY DI cDNA

23 Analisi interazioni DNA-proteine: saggio di footprinting

24 Analisi interazioni DNA-proteine: saggio EMSA

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26 Descrizione generale esercitazioni di laboratorio Studio della localizzazione intracellulare della proteina SEC4 del lievito Saccaromyces cerevisiae A)Clonaggio di SEC4 in vettore per l'espressione in lievito di proteine di fusione con "tag" (GFP) B)Espressione di SEC4 in lievito e analisi della sua localizzazione mediante western blot di estratti frazionati Parte A I) 1. PCR su DNA genomico (preparazione frammento da clonare) 2. Preparazione di DNA plasmidico (vettore di clonaggio) con colonnina 3. Digestione DNA (vettore e frammento) con enzimi di restrizione II)1. Reazione con enzima "ligasi" 2. Analisi su gel di agarosio 3. Analisi spettrofotometrica del DNA preparato 4. Trasformazione batterica 5. Preparazione piastre di agar III)1. Analisi risultati trasformazione 2. Minipreparazione DNA plasmidico 3. Analisi su gel di agarosio

27 PCR da DNA genomico EcoRI BamHI EcoRI Sec 4

28 Clonaggio con doppia digestione GAATTC CTTAAG G CTTAA AGCTT A EcoRI AAGCTT TTCGAA BamHI AAGCTT TTCGAA GAATTC CTTAAG DNA ligasi EcoRI BamHI EcoRI pUG34 Sec 4

29 strategie controlli Reazione di ligasi

30 Controlli nella ligasi G CTTAA AGCTT A AAGCTT TTCGAA GAATTC CTTAAG DNA ligasi pUG34 Sec 4 G CTTAA AGCTT A DNA ligasi pUG34 ?

31 Visualizzazione del DNA

32 DNA circolare con superavvolgimento = 0 DNA superavvolto negativamente

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34 DNA genomicoPCR da genomicoPCR da plasmideVettore pUG34Marcatore 200 ng DNA genomicoPCR da genomicoPCR da plasmideVettore pUG34

35 Sistemi di espressione In vitro (estratti cellulari) In vivo (cellule in coltura) Animali transgenici

36 B. LEWIN, IL GENE - Edizione compatta, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2007

37 Gene reporter

38 B. LEWIN, IL GENE - Edizione compatta, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © attività reporter I confini di un promotore possono essere determinati mediante analisi di delezioni progressive

39 B. LEWIN, IL GENE - Edizione compatta, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2007

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41 fosfato di calcio liposomi (e simili) elettroporazione infezione (SV40, retrovirus) Metodi di trasfezione

42 B. LEWIN, IL GENE - Edizione compatta, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2007

43 Trasfezione in cellule in coltura

44 B. LEWIN, IL GENE - Edizione compatta, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2007 Vettori episomali

45 transiente stabile vettori episomali Trasfezione di cellule in coltura

46 Vettori di clonaggio per lievito

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48 B. LEWIN, IL GENE - Edizione compatta, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2007


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