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Cromatografia Fabrizio Papa. Simulazione di una Cromatografia.

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Presentazione sul tema: "Cromatografia Fabrizio Papa. Simulazione di una Cromatografia."— Transcript della presentazione:

1 Cromatografia Fabrizio Papa

2 Simulazione di una Cromatografia

3 Poniamoci alcune domande: 1)Perché da una sostanza verde abbiamo ottenuto due sostanze, una gialla ed una blu? 3) Perché le due sostanze si sono separate? 2) Perché le due sostanze sono scese verso il basso? 4) Perché il volume occupato dalle sostanze è aumentato? 5) Perché la sostanza blu più trattenuta occupa un volume maggiore della sostanza gialla meno trattenuta?

4 Un esempio

5 Cerchiamo ora di individuare gli elementi della simulazione cromatografica e dell’esempio dei tipi chiacchierone e riservato ed abbinarli tra loro. Sostanza gialla Sostanza blu SolidoSolvente Tubo di vetro Corso Tipo Violetto riservato Tipo rosa chiacchierone Folla Gambe Simulazione Esempio

6 Cerchiamo ora di rispondere ad una domanda più difficile: Perché le bande si allargano? Per rispondere a ciò riprendiamo ancora l’esempio dei tipi chiaccherone e riservato.

7 Perché si allarga la banda? Un esempio.

8 Tempo Intensità Cromatogramma

9 Non resta che cercare dei termini più appropriati per identificare gli elementi e gli eventi osservati e avremo definito tutto sulla cromatografia. Tubo di vetro Solido Solvente Trascinamento del solvente Colonna cromatografica Eluente: fase mobile Fase stazionaria Eluizione Sostanze Soluti

10 Tempi Intensità t0t0 t’ R tempo di ritenzione corretto t R = tempo di ritenzione Tempi di ritenzione K’ = (t R – t 0 )/t 0 Fattore di capacità K d = C s /C m Coefficiente di distribuzione K’ = K d *V s /V m

11 Analizziamo ora l’ampiezza della banda: t R = tempo di ritenzione W W 1/2 H 1/2 Tempo Intensità H

12 Analizziamo ora in maniera più scientifica perché la banda si allarga: Percorsi multipli

13 Diffusione longitudinale

14 Fase stazionaria Fase mobile Trasferimenti di massa In fase stazionaria In fase mobile stagnante

15 Diffusione longitudinale = Percorsi multipli = Trasferimento di massa = O raggiungimento dell’equilibrio A B C Diamo dei valore ai tre contributi che influiscono sull’allargamento della banda

16 HETP = A + B/v + C*v Equazione di Van Deemter v = flusso HETP = altezza del piatto teorico n = L / HETP lunghezza della colonna = L n = numero dei piatti teorici

17 Un po’ di statistica Esempio: Una fabbrica produce dei prodotti (compresse) con 5 mg di principio attivo (caffeina) Vi chiedono di verificare se le compresse prodotte contengono effettivamente 5 mg di caffeina ed in caso contrario di valutare la variabilità. E voi cosa fate? 1) Le analizzate tutte? 2) Ne prelevate un po’ in modo casuale e le analizzate? Ne preleviamo 5 che danno il peso di 3, 4, 5, 6, 7 Media = = 5

18 La media non ci dice nulla sulla variabilità Proviamo con gli scarti dalla media 3 – 5 = -2 4 – 5 = -1 5 – 5 = 0 6 – 5 = 1 7 – 5 = 2 somma0 3 – 5 = -2 4 – 5 = -1 5 – 5 = 0 6 – 5 = 1 7 – 5 = – 5 = (-2) 2 4 – 5 = (-1) 2 5 – 5 = (0) 2 6 – 5 = (1) 2 7 – 5 = (2) 2 somma10 Eleviamo al quadrato Quello che abbiamo ottenuto si chiama Devianza

19 Dividendo per il numero dei campioni o osservazioni o meglio per i gradi di libertà ci avviciniamo alla variabilità del singolo campione = 2,5 Abbiamo appena ottenuto la Varianza

20 Avendo prima elevato al quadrato ora possiamo fare l’operazione inversa con la radice quadrata 2,5 = 1,58 Abbiamo finalmente ottenuto la Deviazione Standard

21 Riprendiamo i numeri appena analizzati 3, 4, 5, 6, 7 Grafichiamo i dati su un istogramma Un campionamento di cinque non è molto serio Facciamo un campionamento di 100 numeri approssimando i pesi a 0,5 Distribuzione di Gauss La deviazione standard in una curva di Gauss è cade nel punto di flesso La somma delle osservazioni tra –s e +s risulta essere il 68,2%

22 Ancora un piccolo esempio: Due ditte producono due diversi prodotti: 1) Ha una media di 10 e s 2 2) Ha una media di 100 e s 2 La deviazione standard è uguale Ci chiediamo qual è la ditta che lavora meglio, ovvero è più precisa, ovvero richiamando un termine cromatografico è più efficiente? Proviamo a rapportare la deviazione standard alla media 2/10 = 0,2 2/100 = 0,02 Se moltiplichiamo per 100 otterremo 20 e 2 ovvero il Coefficiente di Variazione Percentuale o CV% Questo ci dice chiaramente che la ditta che lavora meglio è la seconda

23  / t R I valori di questo rapporto sono molto piccoli, prendiamo il reciproco tR/tR/ O ancora meglio il suo quadrato (t R /  ) 2 N = (t R /  ) 2 1 deviazione standard equivale ad un’ampiezza di picco misurata a 0,882 di altezza, non facile da prendere e quindi si misura alla base che equivale a 4 deviazioni standard o a metà altezza che corrisponde a 2,354  N = 16(t R /W b ) 2 N = 5,545(t R /h 1/2 ) 2 N =(t R /W b /4) 2 N =(t R /h 1/2 /2,354) 2

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25 Equilibrio? Kd = Cs/Cm Kd = [fenolo]s/[fenolo]m Solvente = etile acetato Solido = silice Soluto = fenolo

26 Kd = Cm/CsKd = [fenolo] H2O /[fenolo] CH2Cl2 Estrazione con imbuto separatore, un processo all’equilibrio

27 La cromatografia non è un processo all’equilibrio Proviamo a riportare su grafico i tre contributi che tendono ad allargare una banda cromatografica A B C v = flusso HPTE

28 La cromatografia ci permette di separare due o più sostanze tR Abbondanza Risoluzione

29 Cattiva risoluzione Buona risoluzione dovuta all’efficienza della colonna Buona risoluzione dovuta alla selettività della colonna Ancora sulla risoluzione

30 t r1 t r2 tt W1W1 W2W2 R = 2  t/(W 2 + W 1 ) Risoluzione

31 Efficienza Particelle di silice Bande lungo la colonna Cromatogrammi

32 Selettività Cambiando la fase stazionariaCambiando la fase mobile Kd = Cs / Cm Soluto A Soluto B Kd A Kd B A B Fase mobile Fase stazionaria K’ = t R – t 0 / t 0 Cambiano i tempi di ritenzione

33 Parliamo di tipi diversi di cromatografia Classificazione in base alla fase mobile Liquida Gassosa A fluido supercritico Cromatografia su strato sottile in colonna, HPLC Gascromatografia in colonna Tra la cromatografia liquida e la gascromatografia, in colonna

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35 Fase stazionaria (solido) Fase mobile Cromatografia di assorbimento Siti attivi

36 Un esempio di cromatografia di adsorbimento (fase inversa) Silice (Solido) Ortodifenolo Paradifenolo Cicloesano Etileacetato

37 Fase stazionaria (liquida) Fase mobile Cromatografia di ripartizione Supporto solido

38 Un esempio di cromatografia di ripartizione (fase inversa) Silice (solido) Catene C 18 (liquido) Aldeide C 7 Fase stazionaria Fase mobile 80% 20% 40%60%

39 Cianoalchil Amminoalchil Fenilalchil Nitroalchil Altre fasi stazionarie

40 Cromatografia di esclusione

41 Cromatografia di scambio ionico - + -

42 Gruppo trimetilammonio Gruppo solfonato Gruppi scambiatori di ioni Scambiatore di anioni Scambiatore di cationi

43 Cromatografia di affinità

44 Perché eseguire un’analisi cromatografica? Analisi qualitativa Indicazioni per identificare una sostanza Analisi quantitativa Quantificazione della sostanza

45 tRtR tRtR In generale sostanze diverse hanno tempi di ritenzione diversi Analisi qualitativa

46 Analisi Quantitativa h h Linea di base Linee di base corrette (da valle a valle)

47 S = Base * Altezza/2

48 Totale = = 9 Integrazione

49 Normalizzazione interna A B C S T = S A +S B +S C %A = S A /S T *100 %B = S B /S T *100 %C = S c /S T *100 Il rivelatore risponde allo stesso modo con i vari componenti

50 Ancora normalizzazione interna A B C S A *f A /C A = S B f B /C B = S C *f C /C C f B = S A /C A *C B /S B f C = S A /C A *C c /S c f A = 1 S’ A = S A * f A S’ B = S B * f B S’ C = S C * f C C A = S A /S Tot C B = S B /S Tot C C = S c /S Tot S tot = S’ A + S’ B + S’ C Il rivelatore non risponde allo stesso modo con i vari componenti

51 Taratura diretta A S S /C S = S C /C C C C =S C *C S /S S S = standard C = campione B POSSIBILITÀ DI DETERMINARE LA CONCENTRAZIONE DEL SOLO COMPONENTE CHE INTERESSA

52 Standardizzazione esterna S Peso %A=P A /P C *100 P C = peso del campione iniettato P A = peso del componente ricavato dal grafico Risposta

53 Standardizzazione interna P A /P I.S. S A /S I.S. Q A = P A /P I.S. *Q I.S.

54 I st.II st.III st. 2  l l1l = 0,5 Standard interno Sostanza da dosare Campione incognito Campione incognito

55 PxPx Metodo dell’aggiunte multiple S P aggiunto C X =P X /V X


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