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MTT ASSAY PROTOCOL 1° giorno: SEMINA delle CELLULE 1. tripsinizzare e contare le cellule; 2. diluire propriamente le cellule in terreno di coltura; 3.

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1 MTT ASSAY PROTOCOL 1° giorno: SEMINA delle CELLULE 1. tripsinizzare e contare le cellule; 2. diluire propriamente le cellule in terreno di coltura; 3. pipettare le cellule nei pozzetti (100  l/pozzetto) usando un pipettatore multicanale (fare attenzione ai volumi pipettati dal pipettatore). Nella colonna 1 e la colonna 12 della piasta vanno pipettati 200  l di solo terreno e verranno utilizzati come BIANCHI 2° giorno: TRATTAMENTO 4. diluire il farmaco in modo appropriato in terreno di coltura. Fare una diluizione 2x rispetto a quella finale voluta, in quanto 100  l di diluizione saranno aggiunti ai 100  l già presenti nel pozzetto; 5. aggiungere solo terreno ai pozzetti di controllo (pozzetti delle colonne 2 e 11); 6. aggiungere il farmaco a partire dalla concentrazione più bassa; 3° giorno: TEST MTT 7. aggiungere 50  l di MTT (2 mg/ml in PBS) ad ogni pozzetto, inclusi quelli di contr 8. tenere le piastre in incubatore per 3 ore; 9. centrifugare le piatre per 10’ a 2000 rpm; 10. rimuovere il terreno di coltura rovesciando le piastre e asciugandole su un foglio di carta assorbente; 11. aggiungere 120  l di DMSO ad ogni pozzetto; 12. avvolgere le piastre con alluminio e metterle su un agitatore rotante per 20-30’; 13. leggere le piastre.

2

3 CURVA DOSE-EFFETTO

4 EQUAZIONE DELL’EFFETTO MEDIANO fa/fu = (D/D m ) m log(fa/fu) = log D – m log D m y = fa/fu = 1 log fa/fu = 0


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