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Emoglobina (Hb) Costituisce il 95% delle proteine del globulo rosso (ca. 300 milioni di molecole per cellula) E’ un trasportare di O 2 : si lega a questo.

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1 Emoglobina (Hb) Costituisce il 95% delle proteine del globulo rosso (ca. 300 milioni di molecole per cellula) E’ un trasportare di O 2 : si lega a questo elemento quando si trova nei polmoni (o nelle lacune di Wolff del sacco vitellino o nella placenta) o lo rilascia nei tessuti Grazie all’Hb il sangue è in grado di trasportare una quantità di O volte più elevata di quella che potrebbe essere trasportata da un ugual volume di soluzione salina acquosa come il plasma  l’Hb rende il sangue capace di trasportare MOLTO O 2

2 proteina tetramerica composta da una parte proteica ed una non proteica Gruppo eme: l’atomo di Fe è in grado di legare l’O 2 solo quando si trova allo stato ridotto (Fe 2+ ) La parte proteica crea il microambiente idrofobico necessario a mantenere l’atomo di Fe allo stato ridotto

3 Curva di dissociazione dell’Hb e sua dipendenza dal pH La curva di dissociazione e la sua dipendenza dal pH e dalla concentrazioni di alcuni composti chimici dipendono dalla parte proteica

4 Nei diversi periodi dello sviluppo ontogenetico l’approvvigionamento di O 2 avviene in strutture diverse  necessità di differenti Hb ciascuna espressa in uno specifico periodo ontogenetico e adatta ad associarsi all’O 2 nella specifica struttura di approvvigionamento La parte proteica è sempre costituita da 4 catene polipeptidiche uguali due a due (2 catene di tipo  e 2 catene di tipo non-  ) Emoglobine embrionali Hb Gower I (  2  2 ) Hb Portland (  2  2 ) Hb Gower II (  2  2 ) emoglobina fetale Hb F (  2  2 ) Emoglobine adulte Hb A2 (  2  2 ) Hb A (  2  2 )

5 Produzione dei vari tipi di catene globiniche nei diversi periodi di sviluppo I due switch (embrionale  fetale e fetale  post-natale) sono controllati a livello trascrizionale

6 Produzione di eritrociti Negli adulti è presente una certa quota di HbF  non è distribuita in modo uniforme in tutti i gl.rossi ma si trova in poche cellule  cellule F. La quantità di HbF aumenta in condizioni di stress emopoietico Qual è l’origine delle cellule F ? Due ipotesi: 1) due popolazioni di cellule staminali diverse 2) un’unica popolazione in grado di attuare due programmi trascrizionali diversi Risposta: un’unica popolazione di cellule staminali  Cloni originati da una singola cellula progenitrice contengono sia cellule che producono HbF che cellule che producono HbA

7 Produzione di tutti gli elementi figurati del sangue

8 Lo switch feto  adulto è dovuto a uno switch del programma trascrizionale delle cellule progenitrici e non ad uno switch nell’attivazione di popolazioni staminali diverse L’eritropoiesi ricapitola l’ontogenesi Stamatoyannopoulos G, Exp Hematol (3): 259

9 le catene di tipo  sono lunghe 141 aminoacidi, i loro geni si trovano sul cromosoma 16 (cluster , circa 30 kb) le catene di tipo  sono lunghe 146 aminoacidi, i loro geni si trovano sul cromosoma 11 (cluster , ca. 60 kb) catene di tipo  e di tipo  mostrano una forte omologia di sequenza ad indicare una loro origine evolutiva comune Una notevole omologia si riscontra anche con la sequenza della mioglobina  proteina che lega l’O 2 nel muscolo Manca e Masala, IUBMB Life, 60(2): 94–111, 2008

10 MioglobinaEmoglobina

11 In entrambi i cluster i geni sono organizzati secondo l’ordine temporale in cui sono espressi e sono presenti delle regioni regolative (LCR = Locus Control Region), poste diverse kb a monte dei geni stessi, che sono necessarie per l’espressione di tutti i geni del cluster I geni globinici sono di piccole dimensione (< 1.6 kb) hanno 3 esoni e 2 introni, il 38% della loro sequenza è codificante

12 Manca e Masala, IUBMB Life, 60(2): 94–111, 2008

13 Strachan e Read – Genetica Molecolare Umana, Zanichelli, 2012 Organizzazione dei due cluster globinici: cluster  (cromosoma 16) e cluster  (cromosoma 11

14 Lo studio delle Hb e dei loro geni ha portato contributi fondamentali in vari campi della biologia La proteina si trova in forma praticamente pura all’interno dei gl.rossi  cellule di un tessuto facilmente accessibile Molti individui hanno patologie dovute a mutazioni dei geni globinici  molte varianti strutturali e varianti quantitative (talassemie, HPFH)

15 alfa talassemie   / non -  < 1 ( c’è un difetto di catene  ) beta talassemie   / non -  > 1 (c’è un difetto di catene non , che nell’adulto sono sostanzialmente le  ) In ogni momento della vita di un individuo (periodo embrionale, fetale e post-natale) il rapporto n° catene  /n° catene non -  = 1 Si definisce talassemia la condizione in cui tale rapporto  1 Le talassemie sono quindi un difetto QUANTITATIVO generalmente dovuto a perdita di funzione

16 Nomenclatura Microcitemia o Talassemia minor o Trait talassemico  sono sinonimi e indicano la condizione CLINICAMENTE ASINTOMATICA degli eterozigoti facilmente individuabili attraverso un semplice esame ematologico Anemia mediterranea o Morbo di Cooley o Talassemia major  sono sinonimi e indicano il quadro clinico, molto grave (mortale in assenza di cure) degli individui omozigoti (o eterozigoti composti per alleli non funzionanti) alleli  thal0 (  thal0 )  assenza completa di catene  (  ) alleli  thal+ (  thal+ )  riduzione più o meno marcata di catene  (  )

17 I principali parametri del sangue che risultano alterati nei microcitemici nei microcitemici la quantità totale di Hb è ridotta mentre il numero di globuli rossi è aumentato gli eritrociti sono però più piccoli il ridotto contenuto di Hb determina un appiattimento delle emazie e una loro maggiore resistenza all’emolisi in soluzione salina ipotonica. g/dl per  l 33 g/dl per  l 33

18 in soluzione ipotonica l’emolisi delle emazie normali è totale e il liquido color rosa è limpido; le emazie microcitemiche vengono distrutte solo in parte e la soluzione resta torbida.

19 NORMALEMICROCITEMICO

20 i globuli rossi dei malati sono quasi completamente privi di Hb, essi sono molto pochi e presentano marcate alterazioni morfologiche, alcuni sono solo dei frammenti, tutti vanno incontro ad una precoce distruzione

21 FREQUENZA DELLA MICROCITEMIA NEL MONDO La microcitemia è frequente in tutti i paesi che si affacciano sul Mediterraneo (da cui il nome di anemia mediterranea) e in tutto il sud-est asiatico. si calcola che i portatori sani nel mondo siano circa

22 in Italia vivono circa microcitemici sani grazie alla prevenzione le nascite di individui malati sono molto limitate la frequenza dei portatori sani è molto alta nelle regioni meridionali, in Sardegna, in Sicilia e nella regione del delta del Po FREQUENZA DELLE MICROCITEMIE IN ITALIA

23 dal GENE al PRODOTTO POLIPEPTIDICO FUNZIONANTE 1.Il gene deve essere presente; 2.Il gene deve essere trascritto; 3.Il trascritto deve essere maturato: rimozione degli introni, aggiunta del CAP, aggiunta del poli-A 4.L’mRNA maturo deve essere portato nel citoplasma e caricato sui ribosomi; 5.La traduzione deve avere inizio; 6.L’mRNA deve essere tradotto per tutta la sua lunghezza; 7.La catena polipeptidica deve essere stabile e in grado di svolgere la sua funzione

24 Maturazione del trascritto primario  produzione di mRNA

25 Produzione del trascritto primario e rimozione degli introni

26 EVENTO COMPROMESSO REGIONE GENICA MUTATA TIPO DI ALLELE N° DI ALLELI NOTI CONSEGUENZA FUNZIONALE TrascrizionePromotoreThal (+)19L’attività trascrizionale residua varia tra il 20 e il 50% SplicingIntrone, sito donatore o accettore Introne, sequenze consesus Introne, attivazione di un sito criptico Esone, attivazione di un sito criptico Thal (0) Thal (+) (3 MS e 2 SS) Exon skipping o ritenzione dell’introne (o di parte di esso) mRNA normale presente in quantità ridotta + mRNA anormale Come sopra Come sopra, inoltre in caso di mutazione MS la globina prodotta presenta una SSA La grande varietà degli alleli  thal

27 EVENTO COMPROMESSO REGIONE GENICA MUTATA TIPO DI ALLELE N° DI ALLELI NOTI CONSEGUENZA FUNZIONALE Taglio dell’RNA e poliadenilazione Sito di adenilaz. AATAAA Thal (+)6RNA normali + RNA instabili CappingSito del capping Thal (+)1RNA normali + RNA instabili Attacco al ribosoma5’ UTR RBS=Ribos. Binding Site Thal (+)7Assenza di traduzione Inizio traduzione1° codone (AUG) Thal (0)7 (max poss 9) Assenza di traduzione Traduzionecodificante codone senso  STOP Thal (0)16mRNA instabile per presenza di un codone di stop prematuro Traduzionecodificante indel Thal (0)> 60Come sopra Traduzionecodificante MS Il polipeptide presenta una singola sostit. aa, le conseguenze funzionali dipendono da sede e proprietà di aa. sostituito e aa. sostituente

28 HPFH  Hereditary Persistence of Fetal Haemoglobin In base all’evento mutazionale che ne è la causa può essere suddivisa in due categorie: forme dovute a delezione (di tratti più o meno estesi del cluster globinico) forme NON dovute a delezione (ndHPFH), in quelle dovute a mutazioni nel cluster dei geni  globinici spesso le mutazioni interessano regioni regolative dei geni 

29 Lo studio delle Hb e dei loro geni ha portato contributi fondamentali in vari campi della biologia  Studi biochimici di correlazione struttura- funzione

30  Scoperta del primo crossing-over (intragenico) dislocato  la Hb Lepore  Scoperta della prima regione HSR (Hot Spot of Recombination)

31 Scoperta della prima regione LCR Si è arrivati alla sua scoperta attraverso lo studio delle delezioni del cluster beta (e delle loro conseguenze) e attraverso lo studio della organizzazione cromatinica della regione Assenza dei geni  assenza delle catene globiniche I geni sono intatti ma le globine non vengono sintetizzate, perché?

32 Struttura della  LCR  5 siti sensibili al trattamento con DNAsi I, ciascun sito è di 250 bp e contiene sequenze di legame per vari fattori di trascrizione La LCR è necessaria per l’espressione di TUTTI i geni del cluster e isola la regione dalla vicina cromatina inattiva Come agisce la LCR ? E’ stato dimostrato che la LCR lega dei fattori di trascrizione e interagisce fisicamente con i promotori dei geni globinici (con un promotore alla volta) Stamatoyannopoulos G, Exp Hematol (3): 259

33 Come vengono accesi e spenti i vari geni globinici ? Due meccanismi:  Competizione tra geni Studi su topi transgenici Stamatoyannopoulos G, Exp Hematol (3): 259

34 Come vengono accesi e spenti i vari geni globinici ?  Silenziamento di geni In topi transgenici con il gene  legato alla LCR il transgene viene espresso solo nel periodo embrionale  sequenze necessarie per il silenziamento sono state identificate sia nella parte distale che in quella prossimale del promotore Stamatoyannopoulos G, Exp Hematol (3): 259

35 Come vengono accesi e spenti i vari geni globinici ? In sintesi  di fondamentale importanza sono: 1)La distanza dalla LCR 2)La presenza di fattori di silenziamento 3)La presenza di fattori di accensione gene-specifici (sicuramente per il  forse per il  ) Periodo embrionale  il gene  viene espresso in quanto fisicamente più vicino alla LCR Periodo fetale  il gene  viene silenziato, la LCR agisce sul gene  che (forse) è attivato anche da fattori di trascrizione specifici Periodo adulto  il gene  viene silenziato, il gene  si lega a fattori di trascrizione specifici e su di esso agisce la LCR

36 Attualmente sono state indentificate varie proteine coinvolte nel silenziamento dei geni  o nell’accensione del gene . Il fenotipo di soggetti portatori di vari tipi di talassemie dovute a delezione contribuisce a chiarire l’importanza di specifiche regioni del cluster per il legame di queste proteine Ghedira et al. (2013) – Hematologica 98: )


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