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I funghi La maggior parte delle 100.000 specie fungine note sono strettamente saprofitarie, cioe vivono su materiale organico morto che aiutano a decomporre.

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1 I funghi La maggior parte delle specie fungine note sono strettamente saprofitarie, cioe vivono su materiale organico morto che aiutano a decomporre Alcuni funghi sono invece conosciuti come parassiti obbligati e possono crescere e moltiplicarsi soltanto rimanendo per la loro intera vita in associazione con le loro piante ospite – Ad esempio nei carboni e nelle carie gli effetti distruttivi si hanno solo dopo che il patogeno ha trascorso l’intero ciclo vitale a contatto con questo I parassiti non obbligati richiedono una pianta ospite per parte del loro ciclo vitale ma possono completarlo su materiale organico morto. Si distinguono in – Saprofiti facoltativi: parassiti che siano in grado di svolgere come saprofiti almeno una parte del loro ciclo vitale – Parassiti facoltativi: funghi viventi normalmente allo stato di saprofiti e capaci in determinate circostanze di divenire patogeni

2 Caratteristiche dei funghi patogeni Morfologia – La maggior parte dei funghi ha un corpo vegetativo filamentoso chiamato micelio. I rami individuali del micelio sono chiamate ife e sono generalmente uniformi in spessore da 2 a 10  m – La lunghezza del micelio puo essere di pochi  m in alcuni funghi ma raggiungere metri di lunghezza in altri – In alcuni funghi il micelio consiste di molte cellule che contengono uno o due nuclei per cellula, in altri il micelio contiene molti nuclei che possono o meno essere divisi da setti ifali – La crescita del micelio avviene all’apice dell’ifa – Alcuni microrganismi (mixomiceti, plasmodioforomiceti) considerati erano considerati funghi primitivi ma adesso sono stati inseriti appartenenti al regno dei protozoi, infatti anziche produrre micelio, appaiono sotto forma di un plasmodio ameboide e multinucleato

3 Caratteristiche dei funghi patogeni Riproduzione – I funghi si riproducono principalmente attraverso le spore che consistono di una o poche cellule, che possono essere prodotte asessualmente o come risultato della riproduzione sessuale Riproduzione asessuale In alcuni funghi le spore asessuali sono prodotte all’interno di un sacco chiamato sporangio. Alcune di queste possono nuotare attraverso dei flagelli e sono chiamate zoospore Altri funghi producono delle spore asessuali chiamte conidi, prodotti in ife particolari chiamate conidiofori. In alcuni funghi I conidiofori producono delle piccole ife, chiamate fialidi, che producono e portano I conidi In molti funghi, comunque, I conidi sono prodotti sulla punta del conidioforo sia direttamente sul micelio o all’interno di strutture chiamate conidiomati.Una forma distintiva di conidiomata e’ il picnidio In alcuni funghi le cellule terminali dell’ifa o quelle intermedie si possono allargare, arrontondare e formare una spessa parete formando una clamidospora

4 Caratteristiche dei funghi patogeni Riproduzione sessuale – La riproduzione sessuale avviene nella maggior parte dei gruppi fungini – Negli zigomiceti, 2 cellule (gameti) di taglia e forma simile si uniscono e producono uno zigote chiamato zigospora – Nei chitidriomiceti dei gameti mobili di taglia uguale o ineguale si fondono a formare il meiosporangio – Negli ascomiceti le spore sessuali, usualmente 8 in numero, sono prodotte all’interno di una cellula zigote a forma di sacco chiamato asco, e quindi le spore prendono il nome di ascospore – Nei basidiomiceti le spore sessuali sono prodotte al di fuori di una cellula zigotica a forma di clava chiamato basidio e quindi le spore prendono il nome di basidiospore – Nei cromisti, oomiceti, dei gametangi di taglia ineguale si fondono a formare lo zigote che prende il nome di oospora – Un grande gruppo di funghi detti mitosporici non ha (o non e’ stata ancora trovata) la riproduzione sessuale.

5 Caratteristiche dei funghi patogeni Ecologia – Alcuni funghi sono strettamente biotrofici cioe’ passano tutta la loro vita su di un ospite e soltanto le spore possono trovarsi nel terreno dove possono morire o ritrovare un altro ospite su cui germinare e moltiplicarsi – Altri, come l’agente della scabbia del melo, sono emibiotrofi, e cioe’ devono passare parte della loro esistenza come parassiti sui loro ospiti e un’altra parte sui tessuti morti dell’ospite stesso nel terreno come saprofiti allo scopo di poter completare il loro ciclo di infezione – I saprofiti facoltativi crescono parassitariamente nell’ospite ma possono continuare a vivere e moltiplicarsi nei tessuti morti dell’ospite dopo la sua morte e muoversi poi nel suolo dove crescono saprofiticamente su altro materiale organico morto. Questi funghi sono di solito patogeni terricoli che possono trascorrere gran parte della loro esistenza in assenza del loro ospite ma ne hanno comunque bisogno per moltiplicarsi cospicuamente – I parassiti facoltativi vivono perfettamente come saprofiti ma se entrano in contatto con un ospite nelle giuste condizioni possono provocare malattia

6 Caratteristiche dei funghi patogeni Disseminazione – Le zoospore sono le uniche strutture fungine capaci di qualche movimento (seppur minimo), ma soltanto I mixomiceti, oomiceti e chitidriomiceti le producono – La grande maggioranza dei funghi patogeni dipende per quanto riguarda la propria diffusione da pianta a pianta sulla crescita ifale o sulla capacita’ di essere dispersi da vento, ucceli, insetti animali e uomini – I funghi sono disseminati principalmente sotto forma di spore. Anche frammenti ifali e masse miceliari compatte note come sclerozi possono essere disseminati – La disseminazione delle spore in quasi tutti i funghi e’ passiva.

7 Classificazione Funghi – Chitidriomiceti Hanno zoospore con un singolo flagello posteriore, un micelio arrotondato o allungato (Olpidium, patogeno delle brassicaceae) – Zigomiceti Producono spore asessuali non mobili all’interno di sporangi. Le spore di resistenza sono le zigospore (Rhizopus, marciume molle dei prodotti orticoli) – Ascomiceti Producono spore sessuali, le ascospore, in aschi e spore asessuali non mobili, conidi (Taphrina, Blumeria, Claviceps, Giberella, Fusarium, Ceratocystis…) – Basidiomiceti Producono spore sessuali, le basidiospore, esternamente ad un basidio (Puccinia, Ustilago, Armillaria….)

8 Identificazione Le caratteristiche piu’ significative per l’identificazione dei funghi sono le spore e le strutture che le portano (sporofori) e per certi versi anche le caratteristiche miceliari La forma, la taglia il colore e la sistemazione delle spore sullo sporoforo o all’interno del corpo fruttifero cosi come la forma ed il colore sia dello sporoforo che del carpoforo possono essere identificativi della specie fungina In molti funghi le ife in una colonia o in colonie adiacenti si fondono (anastomosi ifale). Se le ife che si fondono hanno nuclei diversi geneticamente la colonia che si produce e’ un eterokaryon. Molti funghi hanno dei sistemi che prevengono la fusione tra cellule geneticamente identiche, in questo caso si ha una incompatibilita’ vegetativa. Questo metodo e’ usato per identificare I vari ceppi all’interno di una stessa specie (appartenenza a gruppi di incompatibilita’) L’avvento della biologia molecolare, cioe’ della PCR e del sequenziamento genico a basso costo, l’accumulo di database di sequenze ribosomali relativamente grandi hanno rivoluzionato le capacita’ di identificazione dei diversi funghi

9 Sintomi necrotici I funghi causano sintomi locali o generali sui loro ospiti e tali sintomi possono evidenziarsi separatamente o insieme o possono essere in successione In generale I funghi causano necrosi localizzati o generalizzate di tessuti vegetali, possono ridurre la crescita (stunting) dell’intera pianta o di parti di essa Pochi funghi possono causare un’eccesiva crescita I sintomi necrotici piu’ comuni sono – Leaf spots: lesioni localizzate sulle foglie che consistono di cellule morte – Blight: estremamente rapido e generalizzato imbrunimento e morte delle foglie, rami e rogani fiorali – Canker: lesioni necrotiche sul fusto e su organi carnosi – Dieback: necrosi estensiva di un ramoscello – Root rot: disintegrazione o decadimento di parte o tutta la radice – Damping-off: rapida morte e collasso dei germinelli – Basal stem rot: disintegrazione della parte basale dello stelo – Soft rots: macerazione dei frutti, radici, bulbi.. – Anthracnose: lesioni necrotiche e secche sulo stelo, foglie, frutti – Scab: lesione localizzate che si rompono dando un’apparenza scabbiosa – Decline: progressiva perdita di vigore

10 Altri Sintomi Clubroot: radici allargate che assumono la forma di clave Galls: porzioni allargate di organi vegetali Warts: protuberanze pustoliformi sui tuberi e sullo stelo Witches-broom: profusa ramificazione dei ramoscelli Leaf curls: distorsione, ispessimento e incurvamento delle foglie Wilt: generalizzata perdita di turgidita’ di foglie e gemme Rust: molte piccole lesioni sulle foglie e sullo stelo di un color ruggine Smut: semi o galle riempiti di un micelio o di spore nere da parte dei “carboni” Mildew: aree sulle foglie, steli, bocciuoli e frutti coperti di un micelio biancastro e di fruttificazioni del fungo

11 Ciclo vitale Benche’ il ciclo vitale dei funghi e degli oomiceti dei diversi gruppi sia molto diverso, la maggior parte di questi passano attraverso fasi molto simili Quasi tutti i funghi hanno uno stadio sporale con un nucleo aploide semplice (1N). Le spore germinano e producono un ifa che contiene nuclei aploidi L’ifa puo’ ancora produrre spore aploidi o puo’ fondersi con un altra ifa e produrre un ifa fertilizzata in cui I nuclei si uniscono per fromare un nucleo diploide chiamato zigote (2N) Negli oomiceti lo zigote si divide per produrre un micelio diploide e zoospore. Il micelio produce I gametangi in cui avviene la meiosi, poi l’accoppiamento e la produzione dello zigote In una breve fase del ciclo di molti ascomiceti e di qualche basidiomicete I due nuclei dell’ifa fertile non si uniscono ma rimnagono separati all’interno della cellula (micelio dicariotico N+N) Negli ascomiceti, le ife dicariotiche si trovano solo all’interno del carpoforo, all’interno del quale diventano ife ascogene. In queste i due nuclei si fondono (cariogamia) per formare uno zigote che si divide per meiosi e produce ascospore aploidi (8) Nei basidiomiceti le spore aploidi producono ife aploidi. In fase di fecondazione viene prodotto un micelio dicarionte. Queste ife dicaronti possono produrre asessualmente, spore dicarionti, da cui si originera’ nuovamente micelio N+N. Alla fine I due nuclei si fondono e formano un nucleo diploide, che si puo’ replicare mitoticamente o meioticamente. In questo caso produce delle basidiospore apolidi.

12 Struttura e ultrastruttura L’ifa essenzialmente e’ un tubo dotato di parete rigida contenente una massa di protoplasma in movimento Le ife crescono unicamente all’apice, nella cosidetta zona di estensione Posteriormente all’apice l’ifa invecchia progressivamente e nelle regioni adulte puo’ disintegrarsi per autolisi. Con l’allungamento dell’apice, il protoplasma si muove continuamente dalle porzioni piu’ vecchie delle if per apportare verso l’apice stesso materiale necessario per la crescita Le ife degli ascomiceti, funghi mitosporici e basidiomicei presentano dei setti trasversali a intervalli regolari, mentre tali setti sono solitamente asenti nelle ife della maggior parte degli zigomiceti I setti presentano pori attraverso I quali possono migrare, verso l’apice ifale in crescita il citoplasma e I nuclei. Si parla quindi piu’ che di cellule di compartimenti interconnessi I funghi sono organizzati in generale come gli eucarioti, in particolare I mitocondri sono piu’ simili a quelli animali presentando delle creste alemellare anziche tubolari come quelle dei vegetali. Mentre l’apparato del golgi non ha la classica struttura a cisterne membranose ma piuttosto appare come un anello di cisterne arrotondate

13 Struttura e ultrastruttura I funghi asettati presentano molti nuclei in un citoplasma comune e quindi questi funghi sono detti cenocitici I funghi settati mostrano di solito diversi nuclei nel compartimento apicale, ma solo uno o due in ciascuno degli altri Alcuni funghi settati presentano regolarmente un singolo nucleo in ciascun compartimento Anche in molti basidiomiceti c’e una disposizione regolare di un solo nucleo per compartimento nel’omocarion e di due nel dicarion Questa condizione e’ assicurata da una particolare tipo di setto detto doliporo che presenta dei pori troppo stretti per permettere il passaggio dei nuclei ed inoltre da una modalita’ particolare di ramificazione, che porta alla formazione delle connessioni a fibbia Queste connessioni caratterizzano I basidiomiceti, possono quindi essere utilizzate come elemento distintivo quando si osserva la microscopio un micelio ignoto

14 Ultrastruttura dell’ifa L’apice e’ riempito da un gruppo di vescicole apicali (AVC) che giocano un ruolo importante nella crescita apicale Questa massa densa di vescicole prende il nome di spitzenkorper Le microvescicole porebbero rappresentare dei chitosomi – aggregati di chitna sintetasi In c) si nota un microtubulo in stretta associazione con un corpo multivescicolare Nelle regioni piu’ adulte puo’ essere presente anche un numero notevole di corpi lipidici, che rappresentano riserve energetiche In questi compartimenti sono presenti anche diverse inclusioni cristalline e in corrispondenza di ciascun setto strutture denominate corpi di woronin, che servono ad otturare I pori quando le ife vengono lesionate a seguito dell’invecchiamento dei compartimenti

15 Il micelio In quasi qualsiasi punto dell’ifa dietro l’apice si puo’ avere una ramificazione. Le ife divergono le une dalle altre conferendo ala colonia il tipico contorno circolare. Nelle parti piu’ vecchie della colonia, dove le sostanze nutritive dell’ambiente sono state esaurite, possono sorgere delle ramificazione di diametro inferiore, le quali anziche divergere tendono a svilupparsi le une verso le altre e fondersi (anastomosi ifale) La colonia risulta spesso colorata, oltre l’estremo margine che e’ ialino. Questo puo’ essere dovuto alla pigementazione dele ife stesse, ad esempio a seguito di deposito di melanina sulle pareti ifali

16 Parete fungina La parete determina la forma dei funghi dato che la rimozione della parete, mediante trattamenti enzimatci comporta la formazione di protoplasti sferici La parete protegge I funghi dalla lisi osmotica, agisce come setaccio molecolare e nel caso in cui contenga pigmenti melaninici lo protegge dai raggi UV Puo’ presentare sit adatti per l’adesione di enzimi quali invertasi e  - glucosidasi necessarie per acquisire risorse nutritive dalle pareti degli ospiti vegetali La composizione della parete non e’ fissa. Al contrario cambia sostanzialmente nelle varie fasi del ciclo vitale. Ad esempio rispetto alle ife, I conidi posseggono maggiori concentrazioni di glucani e di melanina ma inferiori di chitina, chitosano e polimeri dell’ac, glucuronico PhylumComponenti fibrillariComponenti matriciali Oomiceti Cellulosa,  -1,3-glucani Glucano ChitidriomicetiChitina, glucanoGlucano ZigomicetiChitina, chitosanoAcido poliglucuronico, glucuromanno proteine Ascomiceti Chitina,  -1,3-glucani  -1,3-glucani, galattomannoproteine Basidiomiceti Chitina,  -1,3-glucani  -1,3-glucani, xilomannoproteine

17 Parete fungina Nelle regioni mature delle ife di Neurospora crassa (fungo modello) esistono 4 zone concentriche di parete che non sono distinti nettamente ma si fondono l’uno nell’altro a.La zona piu’ esterna e’ costituita da glucan amorfi con legami prevalentemente  - 1,3 e ramificati  -1,6 b.Reticolo di glicoproteine immerso in una matrice proteica c.Strato piu’ o meno distinto di proteine d.Microfibrille di chitina (e chitosano) immerso in proteine Lo spessore totale puo’ raggiungere I 125 nm In aggiunta a questi componenti alcuni lieviti possono presentare una capsula di polisaccaridi distinta.

18 I setti I setti possono contribuire a rafforzare strutturalmente le ife, particolarmente in condizioni relativamente asciutte. Infatti I funghi settati sono di norma piu’ tolleranti allo stress idrico rispetto ai non settati Sono distinguibili diversi tipi di setti a.Ascomiceti e mitosporici presentano setti semplici con un grosso poro cenrale di  m di diametro che permette il passaggio di diversi oragnelli tra cui I nuclei b.I basidiomiceti presentano un setto doliporo piu’ complesso, con un canale centrale angusto ( nm) delimitato da due flange di materiale parietale amorfo (glucano). Su entrambi I lati del poro sono presenti strutture membranose dette parentosomi a loro volta forate, in modo da assicurare la continuita’ citoplasmatica ma anche di impedire il passaggio di organneli di dimensioni maggiori. Questo aiuta ad assicurare la distribuzione regolare dei nuclei nella fase dicarionte del micelio

19 Assemblaggio della parete Le vescicole presnti nello spitzenkorper si pensa che siano formate a partire dal Golgi nelle zone subapicali e che vengano trasportate verso l’apice dove si fondono con la membrana plasmatica dove cedono I contenuti necessari alla crescita parietale La chitina sintasi forma catene di chitna che vengono formate in situ. Questo enzima e’ presente in 2 forme – Una forma inattiva (zimogeno) nei chitosomi e talora nelle membrane – Una forma attiva strettamente associate alle membrane La forma inattiva del CHS viene attivata da una proteasi. Una volta attiva prende UDP-NAG dall’interno e inizia a sintetizzare catene di chitina verso l’esterno

20 Assemblaggio della parete Un secondo enzima importante coinvolto nella crescita della parete e’ la  -glucan sintasi Il substrato e’ rappresentato da UDP-glucosio L’enzima e’ composto da due subunita’ – Il sito catalitico (FKS) che si trova sul lato esterno della membrana – Il sito regolativo (RHO GTPase), una proteina che lega il GTP che a sua volta attiva la reazione enzimatica La FKS e’ presente in 2 isoforme la FKS1 e 2. La prima e’ attiva durante il normale metabolismo cellulare, la seconda sembra che venga regolata da una cascata fosforilativa che implica l’attivazione di un fattore di trascrizione legato allo stress (SKN7) Tra i principali polimeri parietali si instaurano vari tipi di legami incrociati, dopo l’inserimento degli stessi nella parete Chitina e glucani sono collegati da legami covalenti

21 Malattie provocate dagli Oomiceti Gli oomiceti fanno parte del regno Cromista, hanno un micelio che contiene cellulosa e glucani ma non hanno setti fuorche’ quelli che si generano quando si stacano le parti vechie dell’ifa dalla zona in crescita Producono oospore come spore di resistenza e zoospore come spore asessuali Agli oomiceti appartengono 2 ordini – Saprolegniales – Peronosporales Di quest’ultimo ordine fanno parte due generi che raggruppano diverse specie patogeno come – Pythium Uno dei piu comuni e importanti agenti causali del seed rot, seedling damping-off e root rot di tutti I tipi di piante – Phytophthora Una specie causa il late blight della patata, le altre root rot, fruit rot e blights di molte specie annuali e pluriennali Le malattie provocate dagli oomiceti sono di due tipi – Malattie che interessano parti della pianta presenti nel suolo o a contatto con esso (radici, tuberi..) – Malattie che riguardano soprattutto la parte epigea della pinata come foglie, fusti e frutti

22 Malattie da Botrytis Le malattie da questo fungo sono probabilmente le piu comuni e uniformemente distribuite di qualsiasi tipo di pianta Inizialmente appaiono come blights sui bocciuoli, marciumi sui frutti ma anche come appassimento dei germinelli In condizioni umide il fungo produce una evidente muffa grigia I sintomi in campo la necrosi dei bocciuoli precede il marciume dei frutti e del fusto Il fungo si stabilisce nei petali e quando invecchiano produce abbondante micelio Il micelio resce e invade le infiorescenze che diventano coperte da una muffa grigiastra. Da qui si diffonde attraverso il picciolo che marcisce

23 Il patogeno La malattia e’ provocata dal fungo ascomicete Botrytis cinerea Il patogeno produce un abbondante micelio grigio e dei conidiofori lunghi e ramificati che hanno delle cellule apicali tonde che portano dei conidi grigi e ovoidali I conidiofori e I gruppi di conidi assomigliano a grappoli d’uva

24 Ciclo della malattia Botrytis sverna in residui vegetali in decomposizione come sclerozi Il fungo non sembra infettare I semi ma puo diffondersi mediante semi contaminati con sclerozi Il fungo richiede basse T (18- 23C), alta umidita per crescere, sporulare e germinare Le spore che germinano penetrano attraverso le ferite e producono micelio suvecchi petali fiorlai, foglie morenti e cosi via Gli sclerozi germinano producendo una fitta trama miceliare che puo infettare direttamente l’ospite e in pochi casi invece producono apoteci e ascospore

25 Host is R z,R z or R z, ? ?,? AVR z,AVR z or AVR z, ? ?,? Pathogen H H P P ?? ? ? Resistance DiseaseDisease Disease Gene-for-Gene Hypothesis Specific recognition in upper left box only

26 Host S,S or S, ? ?, ? Tox, Tox or Tox, ? ?, ? Pathogen HH P P ?? ? ? Resistant Disease!! What if the pathogen is a necrotrophic fungus that produces a host selective toxin? ResistantResistant Gene-for-gene II Tox = gene for toxin S = gene for receptor Specific recognition in upper left box only

27 Tossine host-selective e fattori di avirulenza Le tossine host-selective un gruppo di metaboliti strutturalmente complessi e chimicamente diversi prodotte dai fitopatogeni di alcune specie fungine funzionano come determinanti di patogenicità o avirulenza Le risposte biochimiche e molecolari a questi fattori di patogenicità rivela delle risposte tipicamente associate con le difese dell’ospite e l’incompatibilità indotta dai fattori di avirulenza L’azione delle tossine host-selective mostra quindi delle similarità con quelle dei fattori di avirulenza

28 Le HST Le HST sono riportate come “host selective” in quanto sono attive solo contro le piante che sono ospite per quei patogeni che le producono Attualmente la produzione di HST è riportata in almeno 20 patogeni Le HST sono molecole che variano da metaboliti a basso peso molecolare a macromolecole; tutte le HST note sono prodotte da funghi e sono richieste per la patogenicità, infatti la malattia non avviene in assenza della produzione di tossina Nella maggior parte dei casi la sensibilità dell’ospite ad un dato HST è condizionata, generalmente, da un singolo gene e la malattia non avviene in assenza della sensibilità alla tossina La produzione di tossina da parte del patogeno e la sensibilità della pianta alla tossina sono ambedue condizioni causali della malattia Quindi le HST sono dei veri e propri agenti di compatibilità e mediano questo evento inducendo la morte della cellula ospite

29 Fattori di avirulenza In contrasto alle HST i fattori di avirulenza sono degli agenti di incompatibilità Nella maggior parte dei casi il fenotipo predominante dell’incompatibilità è la morte localizzata dell’ospite, comunemente riferita come HR Il ruolo della morte cellulare nella resistenza è in alcuni casi (interazioni con necrotrofi) incerto, ciononostante è una manifestazione tipica della risposta di resistenza La comune associazione della morte cellulare dell’ospite sia con la suscettibilità (HST) che con la resistenza (Avr) fa sorgere la seguente domanda: –Qual è la distinzione in queste risposte dell’ospite che tiene conto di tali differenti esiti nelle interazioni ospite-patogeno?

30 Sintomi Ai più semplici livelli dell’espressione dei sintomi un confronto delle conseguenze di introdurre un HST o un fattore di avirulenza dentro un ospite idoneo nel sito tissutale giusto rivela che entrambi inducono una risposta cultivar- specifica e la morte cellulare rapida seguita dalla morte di zone localizzate o di tutta la pianta L’attività del HST è normalmente saggiata attraverso un’esposizione diretta della pianta o del tessuto alla tossina e simili saggi possono essere utilizzati per determinare l’attività dei fattori di avirulenza Ad. es. i fattori di avirulenza Avr4, Avr9 ed Ecp2 di C. fulvum la proteina INF1 di P. parasitica e la proteina NIP1 di Rhyncosporium secalis sono in grado di elicitare delle risposte di morte cellulare che, macroscopicamente, sono simili a quelle indotte dalla maggior parte degli HST quando introdotti nelle foglie di piante geneticamente appropriate

31 Sintomi Quindi considerando i fattori di avirulenza al di fuori del contesto della resistenza e basandosi sulle risposte fenotipiche, potrebbero essere percepiti come fitotossine selettive Visti da questa prospettiva e considerando le HST come chiari fattori di virulenza, bisogna notare che in origine i fattori di avirulenza NIP erano considerati come tossine, infatti NIP1 stimola l’H + -ATPasi della membrana plasmatica dell’orzo in modo simile alla fusicoccina e probabilmente funziona come fattore di virulenza in assenza del suo corrispondente fattore R (pianta suscettibile)‏ Anche la proteina Ecp2 di C. fulvum è stata inizialmente caratterizzata come fattore di virulenza, infatti i mutanti ecp2 mostravano una scarsa abilità colonizzatrice, una ridotta crescita e conidiazione nell’ospite Quando molti di questi fattori di avirulenza sono introdotti direttamente nel citosol delle piante, evitando quindi lo step di riconoscimento extracellulare, la pianta va in necrosi in modo simile alla reazione causata dalla maggior parte delle HST

32 La vittorina Le similarità nelle risposte indotte dalle HST e dai fattori di avirulenza sono chiaramente illustrati nel Victoria blight (Cochliobolus victoriae) dell’avena a causa della associazione genetica della suscettibilità a questa malattia con la resistenza ad altri patogeni (Puccinia) Il C. victoriae è patogenico grazie alla sua capacità di produrre l’HST vittorina. Tutti gli isolati che producono questa tossina sono patogenici. La sensibilità dell’avena alla vittorina e quindi la suscettibilità al patogeno è condizionata dalla presenza dell’allele dominante Vb Tutti i genotipi che presentano Vb in dominanza sono sia sensibili alla vittorina che suscettibili al patogeno mentre tutti i genotipi omozigoti recessivi sono resistenti a tossina e patogeno Quindi il blight indotto da questo patogeno si ha solo quando un ceppo che produce vittorina attacca una pianta d’avena che porta un allele dominante nel locus Vb

33 La vittorina Le piante suscettibili al blight sono resistenti alla Puccinia (crown rust). Questa resistenza è conferita dal gene dominante Pc2 e l’interazione tra avena e crown rust sembra essere la tipica interazione gene-per-gene Il gene Pc2 e il Vb sono probabilmente o “linked” o identici. Questo risultato è derivato da una analisi dei varianti somaclonali generati in presenza della vittorina e indicava, inoltre, che tutti i varianti che diventavano vittorina-insensibili perdevano anche la resistenza al crown rust Quindi la vittorina funzionerebbe come un elicitore per indurre una risposta di resistenza in modo simile a come fa un fattore di avirulenza. Ma perché è percepita come tossina e induce la necrosi per facilitare la patogenesi da parte di un fungo necrotrofico? La vittorina induce una forma di PCD che condivide molte delle caratteristiche morfologiche e biochimiche dell'apoptosi, come il DNA laddering, la condensazione dell'eterocromatina, il disseccamento cellulare e l'attivazione delle proteasi

34 La vittorina Risultati preliminari indicano che l'attivazione delle proteasi in cellule vegetali inoculate con vittorina avviene attraverso una cascata che coinvolge la partecipazione di enzimi tipo caspasi La vittorina inoltre contribuisce al malfunzionamento dei mitocondri che è un processo comunemente associato con l'induzione della PCD dato che questa tossina si lega ad alcune proteine del complesso mitocondriale della glicina decarbossilasi (GDC-ciclo dell'azoto)‏ Nelle cellule animali l'alterazione della funzione mitocondriale associata con l'apoptosi è evidenziata da una perdita del potenziale transmembranoso dei mitocondri dovuto ad una transizione di permeabilità (MPT) probabilmente facilitata dall'apertura delle membrane ai soluti con MW<1500 Da Quando i mitocondri dell'avena vanno incontro ad una MPT, la vittorina ha accesso alla matrice mitocondriale dove si lega alla GDC anche se probabilmente questa non è il target primario della tossina per indurre la PCD, che probabilmente si trova a monte della GDC (probabilmente il prodotto del gene Vb)‏

35 toxin is bound by 100 kD protein in susceptible plants protein is the P protein component of the glycine decarboxylase complex (GDC) part of an enzyme complex in the mitochondrion involved in the photorespiratory cycle victorin sensitivity gene (LOV1) has been identified in Arabidopsis - typical NBS-LRR gene Are Vb and Pc-2 the same gene? more discussion of this next Tuesday - Sweat et al paper Victorin The glycine cleavage system is also known as the glycine decarboxylase complex or GCS. The system is a series of enzymes that are triggered in response to high concentrations of the amino acid glycine. The glycine cleavage system is composed of four proteins: the T-protein, P-protein, L-protein, and H- protein. They do not form

36 Le tossine AAL Le tossine AAL sono un gruppo di HST strutturalmente correlate prodotte da Alternaria alternata con le forme prevalenti TA e TB. Il patogeno causa il cancro dello stelo del pomodoro e la resistenza alla malattia e la sensibilità alle tossine sono condizionate dal locus Asc La resistenza è normalmente dominante, mentre la sensibilità alla tossina è in dominanza incompleta. L'omozigote recessivo è completamente sensibile alla tossina mentre l'eterozigote mostra una sensibilità intermedia. Isolati di Alternaria incapaci di produrre le tossine AAL non causano la malattia e i mutanti compromessi nella sua produzione perdono il fenotipo patogenico Le tossine AAL inducono una risposta di tipo apoptotico in pomodoro sensibile come dimostrato dal DNA laddering e dalla formazione dei corpi di tipo apoptotico. Questa risposta di PCD come nell'HR coinvolge il calcio. L'etilene e quindi mostra similarità ad una risposta di resistenza indotta Le tossine AAL sono delle sfinganine (sphinganine analog mycotoxins – SAM). Altre SAM, note come fumonisine, sono prodotte da Fusarium. Sia le AAL toxins che le fumonisine inducono apoptosi in cellule animali. La fumonisina B1 è selettivamente tossica nei genotipi di pomodoro sensibili come le AAL.

37 Le tossine AAL Questa similarità di risposta tra le fumonisine e le tossine AAL fa ipotizzare che la PCD indotta da queste coinvolge il signaling delle ceramidi e la distruzione del ciclo cellulare, infatti ambedue le tossine inibiscono la ceramide sintasi con una conseguente alterazione della concentrazione e delle basi sfingoidi nei microcorpi La recente caratterizzazione del locus Asc in pomodoro supporta questa ipotesi, infatti questo gene è omologo al gene di lievito LAG1 (longevity assurance gene) e il suo prodotto compensa la deplezione delle ceramidi facilitando un meccanismo di trasporto sfingolipide-dipendente sia attraverso la produzione di ceramide alternativa oppure codificando una SAM-insensitive sfinganina-N- acetiltrasferasi Le fumonisine - FB1 (e in modo simile le AAL toxins) inducono in At un HR-like response che include la PCD, la formazione di ROS, la deposizione di composti fenolici e del callosio, l'accumulo di fitoalessine e l'espressione delle PRP, inoltre queste risposte richiedono l'attivazione delle pathway del SA, JA ed Et e quindi è marcatamente simile alle risposte di difesa elicitate da un fattore di avirulenza Le piante di At resistenti alla FB1 non risultano, come succedeva in avena con la vittorina, compromesse nella risposta al fattore di avirulenza di P. syringae AvrRpt2, mostrano anzi, una resistenza aumentata nei confronti degli isolati virulenti di questo patogeno

38 Genetics of AAL-Toxin Akamatsu et al Transformed A. alternata tomato pathotype with plasmid pAN7-1 in presence of restriction enzymes (REMI) Screened for loss of toxin production Obtained toxin-deficient mutants Mutants could not produce any disease on tomato toxin is a pathogenicity factor - compare to virulence factor Conclusion: AAL-toxin is required for pathogenicity on tomato

39 Wang et al 1996 AAL-toxin inhibits sphinganine N-acyltransferase (ceramide synthase) in plants and animals AAL-toxin-induces programmed cell death (PCD) in plant and animal cells PCD likely involves ceramide (lipid) signalling and disruption of the cell cycle Sphingolipids and sphinganine bases are secondary messengers involved in PCD AAL-Toxin and Programmed Cell Death

40 De novo sphingolipid synthesis in plants Brandwagt et al. PNAS 2000;97: ©2000 by The National Academy of Sciences ceramide synthase

41 AAL Toxin Sensitivity to AAL toxin in tomato conferred by a single genetic locus (Gilchrist and Grogan 1976) Named Asc (Alternaria stem canker) locus - codominant Susceptible - asc/asc Resistant - Asc/Asc Intermediate - Asc/asc toxin is effective against plant protoplasts as well as intact leaf tissue ceramide synthases in resistant and susceptible plants are both inhibited equally by AAL toxin - no specificity at this level

42 Brandwagt et al cloned and characterized the Asc gene homologous to yeast longevity assurance gene LAG - associated with life span in yeast LAG facilitate ER-to-Golgi transport of glycolsylphosphtidylinositol (GPI)-anchored proteins Asc can partially complement LAG mutations in yeast asc has a premature stop codon relative to Asc and likely codes for a truncated protein (33 kD protein in resistant plants - 10 kD in susceptible plants) does Asc prevent apoptosis by restoring ER-to- Golgi transport? Genetics of Resistance to AAL-Toxin

43 La tossina T La tossina T è l'HST prodotta da Cochliobolus heterostrophus razza T e da Mycospaerella maydis è un polichetide tossico per il mais. Gli isolati che producono tossina sono notevolmente più virulenti dei non produttori. C. heterostrophus causa il southern corn leaf blight una malattia dei genotipi di mais che presentano l'allele cms-T (texas cytoplasm for male sterility), infatti la T-toxin è selettivamente tossica per il mais cms-T I mitocondri sono il target della T-toxin, dove induce il disaccoppiamento della fosforilazione ossidativa, la stimolazione del 4 step della respirazione guidato dal succinato o dal NADH, l'inibizione del 3 step della respirazione guidato dal malato, la perdita di ioni calcio e NAD + e il rigonfiamento dei mitocondri L'analisi del genoma del mitocondrio ha portato alla scoperta di un unico gene (T-urf3) nei mitocondri di mais cms-T che codifica una proteina di 13KDa localizzata nella membrana mitocondriale. L'espressione di URF13 in coli ha reso le cellule sensibili alla T- toxin. URF13 forma un tetramero nelle membrane del mitocondrio e legandosi direttamente alla T- toxin va incontro ad un cambiamento conformazionale che porta alla formazione di un poro in membrana. Questo induce gli effetti tipici della somministrazione della T-toxin

44 La tossina T Il ruolo della T-toxin nel formare un poro di membrana è particolarmente importante nel contesto della PCD. Infatti i mitocondri sono dei regolatori chiave della PCD sia negli animali che nelle piante. Negli animali la risposta apoptotica è spesso associata con la permeabilizzazione delle membrane mitocondriali attraverso la formazione di pori. Un certo numero di proteine pro-apoptotiche come Bax portano alla formazione di questi pori sia direttamente (come URF13) o indirettamente attraverso l'interazione con un meccanismo interno di formazione dei pori. L'espressione di Bax in tabacco porta a risposte il cui fenotipo ha delle somiglianze con l'HR, tra cui anche l'induzione dell'HR. Dato che la T-toxin induce la formazione di un poro interagendo con URF13 è possibile che questa tossina produca risposte simili all'espressione di Bax Questa ipotesi è stata confermata dall'associazione tra il genotipo cms-T e la PCD

45 La tossina HC Il Cochliobolus carbonum causa il northern leaf spot e l'ear rot del mais, la razza 1 di questo patogeno produce l'HC toxin, un tetrapeptide ciclico con un'attività HS contro i genotipi suscettibili del mais Le razze (2 e 3) non produttrici sono comuni e prevalenti in tutto il mondo ma causano lesioni di dimensione inferiore e minor danno su differenti genotipi di mais Quindi la HC-toxin è considerata un fattore di virulenza dato che la razza 1 induce la formazione di lesioni fogliari estese su mais suscettibili ma la tossina non è richiesta per la patogenicità della specie La resistenza al C. carbonum e l'insensibilità alla HC-toxin sono determinate dall'allele dominante nel locus Hm1. Questo gene codifica per una carbonil reduttasi, l'HC-toxin reduttasi, che inattiva la tossina riducendo la funzione chetonica sulla catena laterale dell'acido 2-amino-8-oxo-9,10-epossioctadecanoico che in aggiunta all'epossido è essenziale per la sua attività tossica I genotipi omozigoti per hm1 hm1 (trasnposon disrupted Hm1) mancano dell'attività HCTR e sono completamente suscettibili alla razza1 di C. carbonum

46 La tossina HC Alcuni effetti della HC possono essere “benefici” per la pianta, infatti anziché indurre una perdita di elettroliti, incrementa l'uptake dei soluti organici ed inorganici, stimola l'uptake, l'accumulo e la riduzione dei nitrati e provoca una iperpolarizzazione delle membrane Inoltre non ci sono evidenze che l'HC eliciti risposte di difesa (ROS, fitoalessine etc etc) anzi questa tossina sembra agire come repressore di risposte immunitarie. Infatti l'inoculo di foglie di genotipi di mais suscettibili con i conidi di una razza che non produce tossina in combinazione con l'HC risulta nell'espressione di una piena suscettibilità verso un, altrimenti, debolmente virulento patogeno. Questo suggerisce che le risposte dell'ospite che restringono l'abilità della razza 2 del patogeno di causare infezione sono compromesse dall'HC toxin Inoltre inoculando l'ospite con la razza 2 prima di inocularlo con la razza 1 riduce i sintomi della malattia indotti da quest'ultima, rendendoli simili a quelli indotti da quella meno virulenta. Anche in questo caso l'applicazione di HC sopprime la resistenza indotta, confermando il ruolo dell'HC nel prevenire il set-up di una difesa efficace

47 La tossina HC Tra le risposte genotipo-specifiche elicitate dall'HC è presente un'alterazione della sintesi proteica, che risulta nell'espressione di poche nuove proteine e nella soppressione della sintesi di altre normalmente espresse da genotipi resistenti L'HC non inibisce direttamente la traduzione di nuove proteine indicando che potrebbe avere effetto o sulla trascrizione o sul turnover proteico. Questa tossina, come molti tetrapeptidi ciclici, inibisce l'attività HDAC (istone deacetilasica) che svolge un ruolo fondamentale nel passaggio da etero ad eucromatina L'esame della modalità d'azione dell'HC toxin indica chiaramente che non induce risposte simili a quelle difensive dell'ospite. Quindi non mostra similarità con i fattori di avirulenza, a questo riguardo, però pur avendo una bassa tossicità si comporta in modo evidente come fattore di virulenza L'attività di inibizione della trascrizione di geni di difesa svolta da questa tossina è molto simile a quella svolta da alcuni fattori di avirulenza, come quelli prodotti da Yersinia sp. (T3Es) capaci di interferire con il signaling di pathways strutturali coinvolti con i processi di difesa dell'ospite Quindi la tossina HC potrebbe condividere delle similarità funzionali con altri fattori Avr

48 Struttura tossine

49 Morte cellulare, compatibilità ed incompatibilità La maggior parte dei patogeni che producono tossine, inclusi quelli che producono HST, sono considerati come necrotrofi. Almeno qualche HST elicita una risposta che richiede la partecipazione dell'ospite nel regolare la morte cellulare. Questo indica che il patogeno per se non uccide l'ospite ma piuttosto è l'ospite che uccide se stesso. Inoltre l'associazione di markers tipici delle risposte di resistenza con quelle della morte cellulare suggerisce che, in alcuni casi, il patogeno potrebbe avvantaggiarsi di queste risposte difensive per facilitare la patogenesi L'espressione di alcuni geni antiapoptotici, come Bcl-2 e Bcl- x1 umani e Ced9 di C. elegans, in pianta, porta alla resistenza verso una serie di necrotrofi come Sclerotinia sclerotiorum, B. cinerea e Cercospora nicotianae. Questa resistenza è legata alla prevenzione della PCD. Infatti l'inoculo di piante WT con S. sclerotiorum produce DNA laddering e PCD mentre in quelle che esprimono Bcl2, la PCD e l'infezione non avvengono. Questo suggerisce che una colonizzazione di successo dell'ospite da parte di questi patogeni dipende da una partecipazione attiva da parte dell'ospite almeno attraverso la regolazione della PCD La dipendenza di questi patogeni dalla PCD dell'ospite per la patogenesi è particolarmente significativa dato che la generazione di ROS è essenziale per la patogenesi

50 Morte cellulare, compatibilità ed incompatibilità Quindi eventi comunemente associati con la resistenza, come la PCD e la formazione di ROS, sono coinvolti con la suscettibilità verso i necrotrofi La formazione di ROS e il concomitante redox signaling giocano un ruolo centrale nell'integrazione di diversi tipi di risposte difensive della pianta e la produzione di ROS a prescindere dalla sorgente può essere sufficiente per elicitare la risposta di difesa. Inoltre la generazione di ROS è un marker che indica che le risposte di difesa sono attivate La cercosporina, la tossina prodotta da molte specie di Cercospora, viene attivata dalla luce in presenza di ossigeno ed elicita la produzione di ossigeno singoletto e aso. Anche S. sclerotiorum e B. cinerea inducono la produzione di ROS da parte dell'ospite. La quantità di ROS prodotta è positivamente correlata con l'abilità di un dato isolato di provocare la malattia La morte cellulare dell'ospite è comunemente associata ed è un elemento importante nella resistenza per i biotrofi obbligati. Un ruolo generale per questo tipo di risposta è da escludere in quanto la PCD non contribuisce in modo sostanziale alla resistenza verso i necrotrofi e emibiotrofi


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