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Corso di Genomica a.a. 2010-2011 lezione 29-30 laurea magistrale Biotecnologia Industriale Giovedì 20 Gennaio 2011 aula 6A orario : Martedì ore 14.00 -

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1 corso di Genomica a.a lezione laurea magistrale Biotecnologia Industriale Giovedì 20 Gennaio 2011 aula 6A orario : Martedì ore Giovedì ore D. Frezza Esami: 24 Febbraio, 3 Marzo, 23 Marzo Lezioni fino al 10 Febbraio

2 La immunoprecipitazione Procedura di base per isolare una proteina tramite il suo anticorpo, È un metodo di purificazione quando la proteina che si cerca non è molto abbondante È un metodo per isolare complessi proteici quando non si conoscono gli altri componenti ma solo quello di cui abbiamo l’anticorpo Si usa per co-precipitare complessi che si formano anche con acidi nucleici

3 procedura della Imm.precipitaz. L'immunoprecipitazione è quel fenomeno che si verifica in una soluzione in cui si ha la concomitante presenza di antigene/i (formati da uno o più determinanti antigenici) e di anticorpi (Ig) diretti contro di essi. Se si hanno questi presupposti, si avrà la possibilità di ottenere la formazioni di aggregati antigene-anticorpo (Ag-Ig) multpli, che però non portano obbligatoriamente ad un'immunoprecipitazione. Infatti se l'Ag o l'Ig sono troppo diluiti (cioè hanno un rapporto di concentrazione che si discosta troppo dall'unità), questo fenomeno non si verifica. In questi casi avremo o un eccesso di Ig, o di Ag che non permetteranno la formazione di un aggregato abbastanza grande, che non avrà le dimensioni adatte alla precipitazione. L'immunoprecipitazione avviene solo quando si forma un reticolo di Ag-Ig insolubile al punto di equivalenza. In altre parole l'immunoprecipitazione avviene solo a concentrazioni ottimali dei reagenti, ovvero quelle condizioni in cui non abbiamo né una sovrabbondanza di Ag (ciò provocherebbe una condizione in cui avremmo solo anticorpi circondati da antigene), né un eccesso di Ig (in questo caso avremmo molecole di antigene completamente circondate da anticorpi). A ciò va aggiunto che, poiché quando parliamo di anticorpi parliamo di proteine, dobbiamo tener conto dell'importanza del ruolo che svolgono temperatura, PH ed affinità nel fenomeno dell'immunoprecipitazione. Generalmente la reazione di precipitazione avviene in due fasi: prima si ha la formazione di molti complessi Ag-Ig solubili (reazione rapida), in seguito si verifica l'aggregazione di questi micro-complessi per arrivare alla formazione di un aggregato reticolare più grande, insolubile e visibile nel precipitato (reazione più lenta).

4 1° schema ChIP

5 2° schema ChIP

6 3° schema di ChIP

7 4° schema ChIP

8 5° schema ChIP

9 6° schema ChIP

10 Metodo ChiP on Chip Briefly describe the Chromatin immunoprecipitation (ChIP)-chip and ChIP-PET (paired-end ditag) methods. Chromatin immunoprecipitation methodology (ChIP) allows the identification of the sites in a genome that are occupied in vivo by a gene regulatory protein. The principle underpinning this assay is that DNA-bound proteins (including transcription factors) in living cells can be cross-linked to the chromatin on which they are situated. Following fixation, the cells are lysed and the DNA is broken into pieces kb in length by sonication. Once the proteins are immobilized on the chromatin and the chromatin is fragmented, whole protein-DNA complexes can be immunoprecipitated using an antibody specific for the protein in question. The DNA from the isolated protein/DNA fraction can then be purified. The identity of the DNA can then be determined by PCR. By using a ChIP-chip, the methods of chromatin immunprecipitation and microarray are combined. Therefor the identification of binding-sites of DNA-binding proteins can be made in a much larger scale and more efficient way (up tp 3.5 mio probes). The DNA-microarrays can either comprise cDNA or PCR-products, artificial oligonucleotides or oligonucleotides that are synthesized in situ. ChIP-chip experiments can be divided in three major steps (http://en.wikipedia.org/wiki/ChIP-on- chip): 1. Setting up a biological question 2. Wet-lab protion of the workflow First of all, the ChIP is undertaken and the identified DNA-sequences are purified. The fragments are then poured over the surface of the DNA microarray which is spotted with short, single-stranded sequences that cover the genomic portion of interest. Whenever a labeled fragment "finds" a complementary fragment on the array, they will hybridize and form again a double-stranded DNA fragment.

11 Figura metodo ChIP on Chip

12 Metodo 4C

13 diagramma di flusso per l’analisi ChiA PET (pair end tag) l’architettura del metodo prevede 6 moduli - filtro dei linkers - mappaggio dei PETs - classificazione dei PETs - confronto dei “binding sites” - confronto dei siti di interazione della cromatina - visualizzazione dei ChiA PET

14 modulo di filtraggio linkers si separano le sequenze con i linkers dei PET con il barcode (seq con barcodes non leggibili vanno tra gli ambigui) PETs buoni sono divisi per evere i linkers AA,BB ed AB modulo mappaggio dei PETs le sequenze PET sono mappate in corrispondenza alla sequenza di riferimento Riconoscimento dei PETs secondo la lunghezza genomica della localizzazione dei due tags: dimensione corta con legame intramolecolare, dimensione lunga con legame intermolecolare. - Intramolecolare identifica siti di legame del fattore - intermolecolare identifica siti di interazione della cromatina


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