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Di che cosa abbiamo bisogno? Un Nucleo NMR-attivo Un campo magnetico statico B 0 Un trasmettitore di radiofrequenza PRINCIPI DI BASE M Piccioli R.M.B.

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1 Di che cosa abbiamo bisogno? Un Nucleo NMR-attivo Un campo magnetico statico B 0 Un trasmettitore di radiofrequenza PRINCIPI DI BASE M Piccioli R.M.B. Biotec

2 Parole Chiave Esperimenti in Onda continua ed in Trasformata di Fourier PRINCIPI DI BASE M Piccioli R.M.B. Biotec

3 M Piccioli R.M.B. Biotec

4 Thank you, Mr. Fourier! F( ) F(t) M Piccioli R.M.B. Biotec

5 M Piccioli R.M.B. Biotec

6 FOURIER TRANSFORMATIONS F( )=  ( 0 ) F( )=A  (sin  )/  centered at 0 F( )=T 2 /1+(2  T 2 ) 2 -i 2  (T 2 ) 2 /1+(2  T 2 ) 2 0 F( )=T 2 /1+(2    T 2 ) 2 -i 2    (T 2 ) 2 /1+(2    T 2 ) 2 0 F(t)=exp(-t/T 2 ) F(t)=exp(-t/T 2 )exp(i2  A ) M Piccioli R.M.B. Biotec

7 Why bother with FT? FT allows to decompose a function in a sum of sinusoidal function (deconvolution). In NMR FT allows to switch from the time domain, i.e. the signal emitted by the sample as a consequence of the radiofrequency irradiation and detected by the receiving coil to the frequency domain (NMR spectrum) The FT allows to determine the frequency content of a squared function M Piccioli R.M.B. Biotec

8 Aspetti delle Trasformate di Fourier importanti per NMR Una somma di onde, puo’ essere decomposta nelle singole onde che l’hanno generata e puo’ essere convertita in una serie di frequenze Una radiazione elettromagnetica v applicata per un tempo corto ha la proprietà di eccitare non solo la frequenza v ma anche tutte le frequenze intorno Tanto piu’ l’impulso è corto e tanto più è largo il range di frequenze eccitate La Trasformata di Fourier del prodotto di due funzioni è uguale al prodotto delle trasformate delle due funzioni M Piccioli R.M.B. Biotec

9 A “real” F.I.D. M Piccioli R.M.B. Biotec

10 The NMR Experiment After the pulse is switched off, the magnetization precesses in the xy plane and relaxes to equilibrium The current induced in a coil by the magnetization precessing in the xy plane is recorded. It is called FID. zy xzy xzy x M B1B1B1B1 90°t IIII I t To have a spin transition, a magnetic field B 1, oscillating in the range of radiofrequencies and perpendicular to z, is applied (perturbing pulse) The B 1 field creates coherence among the spins (they all have the same phase) and net magnetization in the x,y plane is created

11 Parole Chiave Impulso Trasformata di Fourier PRINCIPI DI BASE

12 Parole Chiave Frequenza di Larmor Precessione del segnale (evoluzione del Chemical shift) PRINCIPI DI BASE

13 Esperimento NMR Lo stato del sistema all’equilibrio Ovvero: campione nel campo magnetico, prima di fare l’esperimento Consideriamo solo un singolo spin. Per esempio un campione contenente solo H 2 O

14 Esperimento NMR L’effetto di un IMPULSO è di portare il sistema fuori dall’equilibrio La magnetizzazione di H 2 O è ruotata. Tanto piu’ lungo è l’impulso applicato tanto maggiore sarà la rotazione

15 Importante Il segnale osservato nell’esperimento NMR è il segnale che si trova sul piano xy

16 Esperimento NMR IMPULSO a 90° IMPULSO a 180°

17 Segnale ricevuto Se la radiofrequenza applicata è esattamente la frequenza di Larmor, si osserva nel tempo un segnale che tende a decadere (vedi dopo). Questo segnale è confrontato con la frequenza del rotating frame e la frequenza di risonanza del segnale è proprio quella del rotanting frame Il fatto che il segnale deacde dipende da un meccanismo, chiamato rilassamento, che saraà discusso in seguito My=exp(t/T2) Time (t) Fourier Transformation Frequency ( ) =0

18 Segnale ricevuto Se invece la magnetizzazione che studiamo ha una frequenza di risonanza diversa da quella dell’impulso di eccitazione, si osserverà un segnale alla frequenza obs=( 1- 0) My=cos( obs )texp(t/T2) Time (t) Fourier Transformation Frequency ( ) My=cos( obs )texp(t/T2) =0 = obs

19 Free Induction Decay (FID) Observed NMR signal in the time domain Resonance frequencies are acquired as a function of time Common case of observed FIDs t tt

20 FT relax. PreparationDetection x y z t2t2 00 M Piccioli R.M.B. Biotec

21 Signal to noise ScansS/N M Piccioli R.M.B. Biotec

22 Sensibilità dell’Esperimento NMR S/N  N  5/2 B 0 3/2 N = Numero di spins che contribuiscono al segnale  rapporto giromagnetico del nuclide studiato  Camp magnetico utlizizzato M Piccioli R.M.B. Biotec

23 The NMR spectrometer Magnet Probe Coils Transmitters Amplifiers and pre-amplifiers Receiver ADC

24 The NMR spectrometer

25 The Magnet A “cutted” magnet History First magnets were built using ferromagnetic material= permanent magnet Then Electromagnets: i.e. field was generated by wiring of conducting material Now: cyomagnets: i.e. electromagnets made of superconducting wire.

26 Cryomagnets Superconducting wire has a resistance approximately equal to zero when it is cooled to a temperature close to absolute zero ( o C or 0 K) by emersing it in liquid helium. Once current is caused to flow in the coil it will continue to flow for as long as the coil is kept at liquid helium temperatures. The length of superconducting wire in the magnet is typically several miles.

27 Magnet

28 The Probe The sample probe is the name given to that part of the spectrometer which accepts the sample, sends RF energy into the sample, and detects the signal emanating from the sample. It contains the RF coil, sample spinner, temperature controlling circuitry, and gradient coils. Picture an axial cross section of a cylindrical tube containing sample. In a very homogeneous Bo magnetic field this sample will yield a narrow spectrum

29 B 0 homogeneity In a more inhomogeneous field the sample will yield a broader spectrum due to the presence of lines from the parts of the sample experiencing different Bo magnetic fields.

30 Ubiquitin 76 amino acids, 8,5 kDa M Piccioli R.M.B. Biotec

31 1D experiment Could be nice but.....Too crowded.. What do we learn? Chemical shifts relaxation rates Not enough to get a structure M Piccioli R.M.B. Biotec

32 Occorrono informazioni strutturali, e correlazioni tra i vari spin che permettano l’assegnamento. Per ottenere cio’ é necessario osservare tutti i possibili accoppiamenti scalari e dipolari. M Piccioli R.M.B. Biotec

33 NMR MULTIDIMENSIONALE Gli spettri NMR monodimensionali permettono questo solo per molecole semplici e di basso peso molecolare. All’aumentare del PM, diventa impossibile individuare tutti gli accoppiamenti scalari dall’analisi dei multipletti e tutti gli accoppiamenti dipolari dagli esperimenti NOE monodimensinoali. M Piccioli R.M.B. Biotec

34 The need for multidimensional NMR M Piccioli R.M.B. Biotec

35 COSA SIGNIFICA Spettro NMR BIDIMENSIONALE M Piccioli R.M.B. Biotec

36 Cosa è un esperimento bidimensionale ? Dopo un impulso a 90° il segnale è pronto per essere acquisito Facciamo l’acquisizione ma NON terminiamo l’esperimento ed applichiamo ancora uno o piu’ impulsi in modo da perturbare ulterioremente il sistema Attraverso una combinazione di impulsi e delays noi facciamo in modo che ci sia uno scambio di magnetizzazione tra spin accoppiati SUCCESSIVAMENTE, acquisiamo il segnale una seconda volta, Registrando il segnale NMR che rimane sul piano xy dopo la perturbazione M Piccioli R.M.B. Biotec

37 PREPARAZIONE-ACQUISIZIONE t1- PERTURBAZIONE- ACQUISIZIONE (t2) 90° Aq F1 HAHA  A (F1) HBHB Aq F2  A (F1)  B (F2) HAHA  A (F1)  A (F2) M Piccioli R.M.B. Biotec

38 Perché la magnetizzazione di uno spin dovrebbe trasferirsi su quella di un altro spin? Perché ci sono gli accoppiamenti scalari e gli accoppiamenti dipolari M Piccioli R.M.B. Biotec

39 Eccito (impulso a 90°)-Acquisisco (t1)- Perturbo (trasferisco)- Acquisisco (t2) Se la perturbazione non ha effetto e se non c’è trasferimento di alcun tipo, Ottengo lo stesso spettro in ciascuna delle 2 dimensioni tempo (t1 e t2) Dopo la trasformate di Fourier io otterro’ uno spettro dove i segnali appaiono su una diagonale di una matrice quadrata M Piccioli R.M.B. Biotec

40 Se durante la perturbazione una parte della magnetizzazione si traferisce da un nucleo ad un altro, per esempio per effetto di accoppiamento scalare, allora lo spettro della dimensione t2 sarà diverso da quello della dimensione t1. Il risultato è che avro’ dei segnali fuori dalla diagonale. Ciascun segnale fuori dalla diagonale darà l’informazione sugli accoppiamenti scalari attivi nel sistema M (  I t 1 ) (  S t 2 ) Acquisisco (t1)- Perturbo (trasferisco)- Acquisisco (t2) M Piccioli R.M.B. Biotec

41 EXAMPLE N H H C C O We make a 1H experiment and we acquire. Then all signals transfer the information because of scalar coupling N H H C Then I observe Hc I observe Hn I consider the first and the second acquisition as two indpendent dimensions Spectrum after The J coupling Spectrum before The J coupling M Piccioli R.M.B. Biotec

42 EXAMPLE N H H C C O N H H C Spectrum after The J coupling Spectrum before The J coupling 4 ppm9 ppm Signal! This indicates that there is a scalar coupling between Hn and Hc M Piccioli R.M.B. Biotec

43 EXAMPLE N H H C C O N H H C Spectrum after The J coupling Spectrum before The J coupling 4 ppm9 ppm Signal! This indicates that there is a scalar coupling between Hn and Hc Hn Hc J-coupling M Piccioli R.M.B. Biotec

44 EXAMPLE N H H C C O Spectrum after The J coupling Spectrum before The J coupling Hc Hn J-coupling If you begin from Hc, the situation is the same ! M Piccioli R.M.B. Biotec

45 EXAMPLE N H H C C O Spectrum after The J coupling Spectrum before The J coupling Hc Hn J-coupling Therefore, if I consider only this system Hn Hc J-coupling M Piccioli R.M.B. Biotec

46 The first dimension = t 1 The second dimension = t 2 the series of pulses that I have to apply to my system = PULSE SEQUENCE example t1t1 t2t2 t 1 dimension Or F1 t 2 dimension Or F2 M Piccioli R.M.B. Biotec

47 Usually t 1 is also defined as indirect dimension t 2 is also defined as direct dimension the series of pulses that I have to apply to my system = PULSE SEQUENCE example t1t1 t2t2 t 1 dimension Or F1 t 2 dimension Or F2 M Piccioli R.M.B. Biotec

48 F1 F2 Definitions Cross peak Two different frequencies are observed in the two dimensions Diagonal peak The same frequency is observed in both dimensions CROSS PEAK= Yes, There is a COUPLING between the two frequencies M Piccioli R.M.B. Biotec

49 Accoppiamento scalare L’accoppiamento scalare puo’ comunque essere osservato attraverso esperimenti NMR bidimensionali, quali il COSY M Piccioli R.M.B. Biotec

50 Example: COSY Through-bond connectivities COSY= COrrelation SpectroscopY H4-H5 H4’-H5’ M Piccioli R.M.B. Biotec

51 Example: COSY Through-bond connectivities COSY= COrrelation SpectroscopY H4-H5 H4’-H5’ M Piccioli R.M.B. Biotec

52 Beyond COSY COSY is not the only 2D experiment It is possible to transfer the information from spin A to spin B via several possible mechanisms The most important routes, which is COMPLEMENTARY TO J-coupling Is THROUGH SPACE COUPLING M Piccioli R.M.B. Biotec

53 Accoppiamento dipolare L’accoppiamento dipolare si ha tra due spin che sono vicini nello spazio Si tratta della interazione tra due dipoli magnetici, tra i quali, quando essi sono vicini nello spazio, si ha uno scambio di energia L’entità dell’effetto dipende dal campo magnetico e dalle dimensioni della molecola. Nel caso di spin 1H, l’accoppiamento dipolare si trasferisce per spin che si trovano a distanze inferiori ai 5 A. NON si osservano doppietti L’accoppiamento dipolare da luogo ad un trasferimento di magnetizzazione da uno spin all’altro. Questo effetto va sotto il nome di effetto NOE Nuclear Overhauser Effect Perturbo A Aumenta la intensità di B M Piccioli R.M.B. Biotec

54 Accoppiamento dipolare L’accoppiamento dipolare è “indipendente dall’accoppiamento scalare 2 spin possono essere accoppiati : -Scalarmente E dipolarmente se sono vicini nello spazio e legati da legami chimici -scalarmente ma non dipolarmente se sono legati da legami chimici ma non vicini nello spazio -dipolarmente ma non scalarmente se sono spazialmente vicini ma non legati da legamei chimici Pensate a degli esempi, per favore L’effetto NOE è osservabile in un esperimento NMR bidimensionale, detto NOESY (in realtà si puo’ anche osservare in esperimenti monodimensionle (1D NOE) di cui pero’ non parleremo M Piccioli R.M.B. Biotec

55 Through space AND throuhg bonds Through space Through bond M Piccioli R.M.B. Biotec

56 Quando lo spettro è troppo affollato di segnali, non è possibile fare esperimenti monodimensionali, perché non tutti i segnali sono disttinguibili dagli altri E’ quindi necessario u nesperimento bidimensionale, ovvero un esperimento che permette di trasferire la magnetizzazinoe da uno spin all’altro utilizzando l’accoppiamento dipolare M Piccioli R.M.B. Biotec

57 Example: Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY NOESY NOE Effect: If two spins that are close in space are excited out of equilibrium, they will mutually transfer their magnetization AA AB M Piccioli R.M.B. Biotec

58 Example: Cross peaks: A and B are close Diagonal peak The real case: Some 1500 peaks are observed for a protein of 75 aminoacid s AAAB NOESY experiment M Piccioli R.M.B. Biotec

59 2D NOESY Spectrum M Piccioli R.M.B. Biotec

60 Distance constraints NOESY volumes are proportional to the sixth power of the interproton distance and to the correlation time for the dipolar coupling B0B0B0B0  IIII JJJJ r M Piccioli R.M.B. Biotec

61 The “old times” approachNOESY COSY Identify through space connectivities HN(i)-Ha(i) and HN(i)Ha(i-1) Identify through bond connectivities HN(i)-Ha(i) NOESY conn. COSY conn M Piccioli R.M.B. Biotec

62 M Piccioli R.M.B. Biotec

63 La Spettroscopia NMR che utilizza sono spin 1H è solo un caso particolare della spettroscopia NMR bidimensinoale In effetti, accoppiamenti scalari e dipolari sono possibili anche tra spin diversi, es 1H e 13C 1H e 15N 13C e 15N 13C e 13C M Piccioli R.M.B. Biotec

64 In particolare, gli esperimenti che utilizzano accoppiamenti scalari tra spin diversi permettono di usare le 1J che di solito hanno valori maggiori e quindi danno esperimenti piu’ sensibili. Sarà pertanto possibile effettuare esperimenti bidimensionali dove in ciascuna delle due dimensioni si acquisicono nuclei diversi, per esempio 13C e 1H Otterremo un segnale nello spettro SE E SOLO SE abbiamo nel nostro sistema due spin (1H e 13C) che sono tra di loro accoppiati. M Piccioli R.M.B. Biotec

65 Questi esperimenti offrono molti vantaggi e aprono molte possibilità: 1.Spin 1H e 13C potranno essere direttamente accoppiati tra di loro aiutando la identificazione dei varigruppi e semplificando l’assegnamento 2.2. Ogni picco permette di individuare due spin, semplificando il problema della identificazione dei segnali 3.Un esperimento bidimensionale offre una risoluzione molto maggiore perchéi segnali non sono separati solo in una dimensionale ma in una matrice bidimensionale, permettendo cosi’ l’analisi di sistemi anche piu’ complessi e non risolvibili in 1D M Piccioli R.M.B. Biotec

66 1 J couplings for backbone resonances M Piccioli R.M.B. Biotec

67 1 J couplings for backbone resonances M Piccioli R.M.B. Biotec

68 The 2D Hetcor experiment Two dimensional Heteronuclear correlation Experiment M Piccioli R.M.B. Biotec

69 The 2D Hetcor experiment Two dimensional Heteronuclear correlation Experiment M Piccioli R.M.B. Biotec

70 E’ possibile, in uno stesso esperimento mandare impulsi su nuclidi diversi (Es: 1 H, 13 C) ’ possibile, combinare questa possibilità con ciò che sappiamo a proposito degli accoppiamenti scalari e quindi UTILIZZARE gli accoppiamenti scalari per trasferire la magnetizzazione dauno spin 1H ad uno spin 13C ad esso scalarmente accoppiato M Piccioli R.M.B. Biotec

71 E’ possibile, in uno stesso esperimento mandare impulsi su nuclidi diversi (Es: 1 H, 13 C) Inoltre possiamo combinare tutto cio’ con quello che sappiamo sugli esperimenti bidimensionali M Piccioli R.M.B. Biotec

72 Eccito (impulso a 90°) 1 H Acquisisco (t1) 1 H – Perturbo (Trasferisco la magnetizzazione da 1 H a 13 C utilizzando l’accoppiamento scalare 1 J HC Acquisisco (t2) 13 C 2D HETCOR Expriment M Piccioli R.M.B. Biotec

73 2D HETCOR Expriment M Piccioli R.M.B. Biotec

74 2D HETCOR Expriment Prima dimensione M Piccioli R.M.B. Biotec

75 2D HETCOR Expriment Prima dimensione M Piccioli R.M.B. Biotec

76 2D HETCOR Expriment Prima dimensione Seconda dimensione M Piccioli R.M.B. Biotec

77 2D HETCOR Expriment Prima dimensione Seconda dimensione M Piccioli R.M.B. Biotec

78 M Piccioli R.M.B. Biotec

79 Esempio COSY M Piccioli R.M.B. Biotec

80 Esempio COSY N.B. In questo caso non si osserva solo l’accoppiamento 3J ma si osserva una “propagazione” dell’informazione attraverso gli accoppiamenti scalari M Piccioli R.M.B. Biotec

81 Esempio HETCOR M Piccioli R.M.B. Biotec

82 Heteronuclear Single Quantum coherence 2D HSQC Experiment M Piccioli R.M.B. Biotec

83 2D HSQC Expriment Heteronuclear Single Quantum coherence M Piccioli R.M.B. Biotec

84 2D HSQC Experiment Prima dimensione Seconda dimensione Heteronuclear Single Quantum coherence M Piccioli R.M.B. Biotec

85 2D HSQC Expriment Prima dimensione Heteronuclear Single Quantum coherence M Piccioli R.M.B. Biotec

86 2D HSQC Experiment Seconda dimensione Prima dimensione Heteronuclear Single Quantum coherence M Piccioli R.M.B. Biotec

87 2D HSQC Experiment Heteronuclear Single Quantum coherence Seconda dimensione Prima dimensione E’ possibile progettare esperimenti per trasferire la magnetizzazione da un nucleo all’altro anche indipendentemente dall’acquisizione In questo esperimento il primo spin che viene eccitato è 1H, la magnetizzazione viene trasferita da 1H a 13C PRIMA della acquisizione della prima dimensione, che quindi è 13C. SOLO i 13C che sono accoppiati ad 1H possono essere osservati! Successivamente la magnetizzazione e di nuovo trasferita 1H utilizzando sempre l’accoppiamento scalare ed alla fine osservo 1H M Piccioli R.M.B. Biotec

88 Eccito (impulso a 90°) 1 H Trasferisco la magnetizzazione da 1 H a 13 C utilizzando l’accoppiamento scalare 1 J HC Acquisisco (t1) 13 C – Perturbo -Trasferisco la magnetizzazione da 13 C a 1 H utilizzando l’accoppiamento scalare 1 J HC Acquisisco (t2) 1 H 2D HSQC Experiment M Piccioli R.M.B. Biotec

89 Questo tipo di esperimento si chiama anche Out and back Significa che parto da 1H, trasferisco da 1H a 13C (out), acquisisco 13C nella prima dimensione e poi torno (back) sullo stesso nucleo da cui sono partito 2D HSQC Experiment Il doppio trasferimento fa si che l’esperimento sia molto piu’ selettivo Osservo solo 1H e 13C che sono accoppiati tra di se per effetto di 1 J M Piccioli R.M.B. Biotec

90 The HSQC experiment M Piccioli R.M.B. Biotec

91 Caratteristiche dell’esperimento HSQC Non esiste la diagonale La magnetizzazione viene trasferita da 1 H al 13 C ad esso accoppiato Successivamente si acquisisce, nella dimensione indiretta, 13 C Infine si ri-trasferisce su 1 H e si osserva 1 H Tutti gli 1 H che non sono accoppiati a 13 C NON si osservano

92 Heteronuclear NMR OBSERVE 13 C during t 1 Transfer the information to all 1 H coupled OBSERVE 1 H during t 2 1H1H 13 C No more diagonal Each peak indicate A different H-C pair M Piccioli R.M.B. Biotec

93 Heteronuclear NMR OBSERVE 13 C during t 1 Transfer the information to all 1 H coupled Observe 1 H during t 2 1H 13C No more diagonal Two protons are bound to the same carbon CH 2 M Piccioli R.M.B. Biotec

94 The HSQC experiment M Piccioli R.M.B. Biotec

95 Heteronuclear cases The scheme of 1J scalar couplings M Piccioli R.M.B. Biotec

96 The 1H- 15N HSQC experiment Heteronuclear Single Quantum Coherence M Piccioli R.M.B. Biotec

97 The HSQC experiment In 5 minutes you may know…. if your protein is properly folded if all aminoacids gives rise to an observable peak Each amide NH group gives rise to one peak Detect H-N couplings Same sensitivity of a 1 H experiment (although you are observing 15 N) but much larger resolution if you can do the job (whatever is your job) M Piccioli R.M.B. Biotec

98 Heteronuclear NMR in proteins example: 15 N labelled proteins M Piccioli R.M.B. Biotec

99 Heteronuclear NMR in proteins example: 15 N labelled proteins M Piccioli R.M.B. Biotec

100 The HSQC experiment In 5 minutes you may know…. if your protein is properly folded if all aminoacids gives rise to an observable peak Each amide NH group gives rise to one peak Detect H-N couplings Same sensitivity of a 1 H experiment (although you are observing 15 N) but much larger resolution M Piccioli R.M.B. Biotec

101 Ca 2+ Apo 3.3 M GdmCl Loss of secondary structure elements: unfolded protein Refolding Ca M GdmCl The role of metal cofactor in protein unfolding Metal triggered protein folding M Piccioli R.M.B. Biotec

102 HN  1 83 HN  28 HN  32 Apo vs holo protein, mapping the environment of the metal ion 15 N 15 H M Piccioli R.M.B. Biotec M Piccioli R.M.B. Biotec

103 The need for multidimensional NMR

104 Troppi segnali 1 H ? M Piccioli R.M.B. Biotec

105 Isotope labeling For biomolecules, tipically, 15 N or 13 C and 15 N, or 13 C, 15 N, 2 H 15 N Only A more effective fingerprint -characterization -folding -dynamics protein size >10000 Homonuclear 2D experiments do not have enough resolution HSQC or HMQC HSQC-NOESY or HSQC TOCSY M Piccioli R.M.B. Biotec

106 Isotope labeling For biomolecules, tipically, 15 N or 13 C and 15 N, or 13 C, 15 N, 2 H 15 N and 13 C Scalar couplings through 13 C atoms -triple resonance -assignment -structure protein size >20000 M Piccioli R.M.B. Biotec


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