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Identificare le proteine che sono in grado di interagire con il prodotto del gene di interesse in modo specifico: 1)Co-immunoprecipitazione 2)Libreria.

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Presentazione sul tema: "Identificare le proteine che sono in grado di interagire con il prodotto del gene di interesse in modo specifico: 1)Co-immunoprecipitazione 2)Libreria."— Transcript della presentazione:

1 Identificare le proteine che sono in grado di interagire con il prodotto del gene di interesse in modo specifico: 1)Co-immunoprecipitazione 2)Libreria con il “sistema doppio ibrido di lievito” -Interaction trap system (Fields and Sternglanz 1994): le proteine che si legano fisicamente l’una all’altra vengono Individuate mediante la loro capacita` di attivare la trascrizione di un gene indicatore Il sistema a singolo ibrido. Obiettivo identificare le proteine che si legano ad un elemento di regolazione bersaglio, che agisce in cis, solitamente una sequenza di DNA Sistema a triplo ibrido: terza molecola che puo`essere un RNA o una molecola proteica

2 I sistemi “a doppio Ibrido” e a “singolo ibrido” in lievito

3 Phage Display 1)Inserimento di frammenti di DNA estraneo nel gene di una proteina fagica di rivestimento. Il gene modificato e`espresso come proteina di fusione, che viene incorporata nel virione e risulta visibile sulla superficie del fago. Tra le applicazioni: -ingegneria degli anticorpi -ingegneria dell proteine in generale (es. selezione di varianti desiderabili da una libreria di mutanti) -studio delle interazioni proteina-proteina

4 Phage display

5 Manipolazione genetica degli animali -Studio della funzione genica -Modelli animali per le malattie Oocita fecondato Cellule staminali embrionali (ES, post-zigotiche nessuna separazione fra linea somatica e linea germinale)

6 Preparazione di topi transgenici mediante microiniezione nei pronuclei

7 Le cellule ES modificate geneticamente costituiscono un mezzo per trasferire DNA estraneo o mutazioni specifiche nella linea germinale del topo

8 La mutagenesi mirata mediante ricombinazione omologa può inattivare un predeterminato gene cromosomico all ’ interno di una cellula integra “Hit and run” Vettori di inserzione

9 La mutagenesi mirata con doppia sostituzione può essere usata per introdurre nel DNA piccole mutazioni “Tag and exchange” Vettori di sostituzione HPRT+ TK- TK esterno alla regione di omologia HPRT-

10 Il metodo knock-in consente di sostituire l’attivit à di un gene di un dato cromosoma con quella di un altro gene appositamente introdotto Il gene En-2 va a finire sotto il controllo del promotore di En-1

11 Sistemi di ricombinazione sito-specifica CRE-loxP del batteriofago P1 CRE Causa di recombinazione media la ricombinazione fra due sequenze loxP con lo stesso orientamento, in seguito a tale evento la sequenza collocata fra I due siti viene escissa

12 Struttura della sequenza di riconoscimento di loxP loxP

13 Gene trapping Principio: gene indicatore è espresso solo dopo il suo inserimento in un gene (sia introne che in un esone) o in un promotore. Integrandosi puo’ acquisire gli elementi che mancano per essere espresso

14 Clonazione animale

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16 Anthony J. F. GRIFFITHS et al. GENETICA sesta edizione Cap 11 Isolamento e Manipolazione del gene

17 Metodi con cui si puo’ introdurre in una cellula DNA estraneo

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19 Due metodi con cui un ceppo ricevente di lievito puo’ essere trasformato

20 Ingegneria genetica delle piante

21 200kb

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23 Il T-DNA insieme a qualsiasi segmento di DNA in esso contenuto -si e’ inserito in un cromosoma della pianta transgenica, quindi Viene ereditato come un carattere mendeliano semplice

24 Ingegneria genetica degli animali

25 Gene targeting Knockout

26 Produzione di un topo knockout

27 Terapia genica

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