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Esercitazioni di Biochimica Applicata Introduzione alle metodologie di base per l’analisi delle proteine 1. Dosaggio quantitativo delle proteine totali.

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Presentazione sul tema: "Esercitazioni di Biochimica Applicata Introduzione alle metodologie di base per l’analisi delle proteine 1. Dosaggio quantitativo delle proteine totali."— Transcript della presentazione:

1 Esercitazioni di Biochimica Applicata Introduzione alle metodologie di base per l’analisi delle proteine 1. Dosaggio quantitativo delle proteine totali in un campione biologico; 2.Proteine cellulari - tecniche di omogeneizzazione e centrifugazione: arricchimento della/le proteina/e studiate in frazioni sub-cellulari ottenute da omogenato d’organo, tessuto, linee cellulari; 3.Saggio analitico nella frazione subcellulare (saggio enzimatico); 4. Cinetica enzimatica; 5.Procedure di separazione delle proteine in studio (elettroforesi su gel) Analisi di proteine specifiche o totali nei diversi tessuti e distretti anatomici, in liquidi biologici e colture cellulari: tecniche separative più risolutive, metodi di identificazione e purificazione. In particolare: Western blot, elettroforesi bidimensionale, proteomica, tecniche cromatografiche, purificazione all’omogeneità, sequenziamento. Tecniche mirate

2 per conoscere quante proteine sono presenti in un determinato preparato biologico, prima di procedere verso ulteriori analisi relative ad una o più proteine; esempi: per calcolare l’attività specifica durante i saggi funzionali (es. per vel. enzimatica); per calcolare la densità specifica di un recettore nei saggi di legame (binding) dei recettori proteici; come indice di purezza/resa della proteina studiata durante le fasi progressive di purificazione; prima di una separazione cromatografica o elettroforetica (SDS-PAGE, Western blot, proteomica). Il dosaggio quantitativo delle proteine viene applicato:

3 Dosaggio della concentrazione di proteine totali in un campione biologico Metodi chimici: Metodo Kjeldahl (N totale) Metodi spettrofotometrici: -metodo in assorbanza UV a 280 nm (amminoacidi aromatici) - Metodi colorimetrici: Metodo del biureto; Metodo di Lowry; Metodo BCA (acido bicinconinico); Metodo di Bradford; Metodi turbidimetrici: precipitazione in acidi TFA o TCA e analisi turbidimetrica del precipitato.

4 Metodo di Kjeldahl Determinazione dell’N proteico trasformato in gr proteine mediante un fattore di conversione- Per incrementarne l’accuratezza: precipitazione delle proteine con TCA, TFA o PCA, lavaggio per centrifugazione e precipitato usato per l’analisi successiva: 1) Digestione: il campione con le proteine viene portato ad alta temperatura in presenza di H 2 SO 4 concentrato + catalizzatore (ex. Cu 2 SO 4 ) + ossidanti (ex. permanganato o H 2 O 2 ); tutto l’N organico si trasforma in NH 4 +, ossidazione di C e S a CO 2 e SO 2 ; 2) Distillazione: (NH 4 ) 2 SO 4 formato + 2NaOH = 2NH 3 (raccolta x distillazione) + Na 2 SO H 2 O; 3) Titolazione: NH 3 raccolta e titolata per aggiunta di acido forte (ex. HCl) a titolo noto. Calcolo del contenuto di azoto o di proteine in un campione 1 mol HCl = 1 mol NH3= 14 gr N Quantità di N nel campione in gr: ml HCl x M HCl x 14/1000 Quantità di proteine nel campione in gr: ml HCl x M HCl x 14/1000 x 100/16 se si considera che il contenuto medio di N proteico è 16%.

5 Metodi spettrofotometrici - colorimetrici

6 I 20 L-amminoacidi che formano le proteine Legame peptidico da: Metodi spettrofotometrici basati su reazioni che possono coinvolgere il legame peptidico o i gruppi –R di alcuni AA Metodi spettrofotometrici basati su reazioni che possono coinvolgere il legame peptidico o i gruppi –R di alcuni AA Dosaggio proteine

7 Sensibilità: quantità più piccola di proteine determinabile nel campione biologico; Specificità: capacità di quantificare solo le proteine del campione; Interferenze: queste possono alterare sia accuratezza che specificità del metodo: es.: assorbimento alla analitica di componenti del campione diverse dalle proteine (es. acidi nucleici); interferenze del mezzo, ex. sali del tampone, con la formazione di complessi colorati (metodi colorimetrici); Capacità relativa o assoluta di misurare le proteine del campione biologico: dipendenza dalla composizione in certi aminoacidi delle proteine o meno: metodo relativo, metodo assoluto; importante durante procedura di purificazione. Integrità del campione: capacità o meno di lasciare integro il campione con possibilità di utilizzarlo in altri dosaggi; Stabilità: metodi colorimetrici, stabilità nel tempo dei complessi colorati. Sensibilità: quantità più piccola di proteine determinabile nel campione biologico; Specificità: capacità di quantificare solo le proteine del campione; Interferenze: queste possono alterare sia accuratezza che specificità del metodo: es.: assorbimento alla analitica di componenti del campione diverse dalle proteine (es. acidi nucleici); interferenze del mezzo, ex. sali del tampone, con la formazione di complessi colorati (metodi colorimetrici); Capacità relativa o assoluta di misurare le proteine del campione biologico: dipendenza dalla composizione in certi aminoacidi delle proteine o meno: metodo relativo, metodo assoluto; importante durante procedura di purificazione. Integrità del campione: capacità o meno di lasciare integro il campione con possibilità di utilizzarlo in altri dosaggi; Stabilità: metodi colorimetrici, stabilità nel tempo dei complessi colorati. PARAMETRI CHE CARATTERIZZANO I DIVERSI METODI DI DOSAGGIO DELLE PROTEINE Metodi spettrofotometrici

8 ASSORBANZA IN UV DELLE PROTEINE Caratteristiche: Sensibile:  g Integrità del campione: si Stabilità: si Interferenza con: basi azotate acidi nucleici (si corregge a 260 e 280 nm) Metodo relativo: può variare in base al tipo di proteine presenti.

9 Scarsa sensibilità Reattivo di Benedict: solfato di rame CuSO 4 in soluzione alcalina e sali citrato o tartrato di K+ o Na+ Reattivo di Benedict: solfato di rame CuSO 4 in soluzione alcalina e sali citrato o tartrato di K+ o Na+ Metodi colorimetrici Metodo «capostipite» di altre tecniche colorimetriche, quali i metodi del Lowry e del BCA. Metodo «capostipite» di altre tecniche colorimetriche, quali i metodi del Lowry e del BCA. Caratteristiche: Integrità campione: no Metodo ritenuto assoluto, più costante di UV.

10 Integrità campione: no Stabilità e tempistica: stabile entro limiti di tempo, lettura dopo 30 min. Procedura relativamente lunga. Metodo ritenuto più costante specifico e sensibile rispetto a UV, Folin classico e biureto. Integrità campione: no Stabilità e tempistica: stabile entro limiti di tempo, lettura dopo 30 min. Procedura relativamente lunga. Metodo ritenuto più costante specifico e sensibile rispetto a UV, Folin classico e biureto. Caratteristiche: Metodo di Folin classico: Residui fenolici quali gruppi –R di AA aromatici (specialmente tirosina), sono ossidati da reattivo di Folin-Ciocalteu in ambiente alcalino: acidi fosfotungstico- molibdico del reagente si riducono a composti di colore blu. Il Lowry incrementa sensibilità associando biureto e Folin. Metodo di Folin classico: Residui fenolici quali gruppi –R di AA aromatici (specialmente tirosina), sono ossidati da reattivo di Folin-Ciocalteu in ambiente alcalino: acidi fosfotungstico- molibdico del reagente si riducono a composti di colore blu. Il Lowry incrementa sensibilità associando biureto e Folin.

11 Quota di ioni rameici ioni rameosi dalle proteine in ambiente alcalino. L’acido BCA chela ioni rameosi formando un complesso colorato molto stabile. Integrità campione: no Stabilità: buona. Tempistica: procedura lunga. Interferenze: lipidi, detergenti, EGTA; DTT (ditiotreitolo >1mM). Migliore del Lowry per detergenti, sali etc.. Integrità campione: no Stabilità: buona. Tempistica: procedura lunga. Interferenze: lipidi, detergenti, EGTA; DTT (ditiotreitolo >1mM). Migliore del Lowry per detergenti, sali etc.. rid

12 Integrità campione: no Stabilità: più stabile degli altri metodi; rapidità di esecu- zione – non richiede incubazione dopo aggiunta reagente. Metodo relativo- Sensibilità comparabile a Lowry Integrità campione: no Stabilità: più stabile degli altri metodi; rapidità di esecu- zione – non richiede incubazione dopo aggiunta reagente. Metodo relativo- Sensibilità comparabile a Lowry Interferenze con detergenti Residui di arginina, triptofano, tirosina e fenilalanina Residui di arginina, triptofano, tirosina e fenilalanina

13 Metodo del Biureto: retta di calibrazione – due analitiche, a sensibilità diversa: 545 nm, quantità di proteine misurabile: 1 – 5 mg 330 nm, quantità di proteine misurabile: mg Metodo del Biureto: retta di calibrazione – due analitiche, a sensibilità diversa: 545 nm, quantità di proteine misurabile: 1 – 5 mg 330 nm, quantità di proteine misurabile: mg Retta a 330 nm

14 Metodo del Bradford: retta di calibrazione – analitica: 595 nm


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