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IL DNA fingerprinting umano oggi Prof.ssa Claudia Donnini, Università di Parma Bologna, 7 settembre 2005.

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1 IL DNA fingerprinting umano oggi Prof.ssa Claudia Donnini, Università di Parma Bologna, 7 settembre 2005

2 1) Che cosa significano sigle e numeri? 2) Come si è arrivati all’uso di questa tipologia di profilo e perché?

3 Il DNA nucleare della specie Homo sapiens è costituito da: 23 cromosomi nelle cellule della linea germinale, contenuto in DNA: circa 3x10 9 paia di basi (bp) 23 coppie di cromosomi nelle cellule somatiche, contenuto in DNA: circa 2x3x10 9 paia di basi (bp)

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6 1985. Il Dr Alec Jeffreys i suoi collaboratori, dell’Università di Leicester, in Inghilterra, - mettono in evidenza l’esistenza di profili individuali (il fingerprinting del DNA) e - dimostrano, con le loro analisi, l’esistenza di una relazione familiare cioè di una compatibilità ereditaria risolvendo una disputa in un caso di immigrazione (Jeffeys et al., 1985, Nature 314: 67-73; Jeffeys et al, 1985 Nature 316: 76-9 ; Jeffrey et al., 1985, Nature 317: 818-9)

7 Jeffreys e coll. scoprono che esistono nel DNA umano delle regioni (minisatelliti/VNTR= Variable Number Tandem Repeat) in cui brevi sequenze di DNA (da bp) vengono ripetute in tandem numerose volte e in più loci sui cromosomi e che il numero di ripetizioni è altamente variabile nei diversi individui

8 da Brooker, Genetica, ed. Zanichelli

9 Questo metodo di fingerprinting viene definito: Multilocus RFLP-VNTR RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) indica che, a causa del numero variabile di ripetizioni, vengono creati dal taglio con un enzima di restrizione, frammenti di DNA di diverse dimensioni.

10 da Snustad-Simmons, Principi di Genetica, Edises II ed.

11 Single-locus RFLP-VNTR (Restriction Fragment Length Polymorphism-Variable Number Tandem Repeat Polymorphism) VNTR: numero variabile di ripetizioni seriali (tandem repeats) (da 9 a 40bp che possono essere ripetute anche centinaia o migliaia di volte, dimensione da 500 a bp) Single-locus: ripetizione localizzata in un solo locus cromosomale.

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13 Di conseguenza se applico lo stesso protocollo sperimentale di Jeffreys et al. e uso come sonda una Single-locusVNTR verranno individuati due frammenti se l’individuo è eterozigote (ha ricevuto dai genitori DNA con numero diverso di ripetizioni). un unico frammento se l’individuo è omozigote (ha ricevuto da entrambi i genitori DNA con lo stesso numero di ripetizioni)

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16 1986. Negli Stati Uniti viene ammessa per la prima volta in tribunale un’analisi con RFLP, in un caso di stupro (Stato della Florida contro Tommy Lee Andrews) L’analisi del DNA a fini forensi subisce una battuta di arresto. A New York, nel processo contro Joseph Castro, la corte sceglie di rendere inammissibile l’analisi del DNA ai fini della inclusione.

17 Il problema può essere così riassunto “la cosa da cui la deduzione è fatta deve essere sufficientemente stabilita per avere una generale accettabilità nel particolare campo a cui si riferisce” In particolare nel processo in questione per decidere l’ammissibilità la corte chiede che la prova del DNA deve rispondere a tre criteri: 1) E’ fondata la teoria che riguarda l’analisi del DNA? 2) Le tecniche utilizzate nell’analisi sono in grado di produrre risultati affidabili? 3) In questo caso i test sono stati eseguiti in modo corretto?

18 Tale decisione è il fattore che più ha contribuito a aumentare l’attenzione sulla emissione di normative per la certificazione di qualità e la standardizzazione dell’analisi.

19 Vantaggi: Riproducibilità - Elevato potere discriminatorio Svantaggi: - Richiedere quantità discrete di DNA (50-500ng) e quindi il non potere essere utilizzato a partire da tracce biologiche e - di richiedere tempi abbastanza lunghi.

20 Si sono quindi cercate, per l’analisi del fingerprinting, nuove regioni ripetute nel DNA ma sufficientemente brevi per potere essere amplificate per PCR anche in caso di degradazione parziale del DNA: - microsatelliti / STR (Short Tandem Repeat polymorphism)

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22 L’amplificazione di una STR darà origine a due bande se l’individuo è eterozigote un'unica banda se l’individuo è omozigote

23 Numerose STR sono state validate e se ne é stabilito nelle diverse popolazioni umane la frequenza delle singole ripetizioni (Hammond et al, 1994 Am J Hum Genet 55: ; Garofano et al, 1998 J Forensic Sci 43: ; Garofano et al., 1998 Forensic Science Int. 97: 53-60)

24 ENFSICODIS (7 loci)(13 loci) TH01 D21S11 D18S51 vWA FGA D8S1179 TPOX CSF1PO D16S539 D7S820 D13S317 D5S818 D3S1358 ENFSI (European Network of Forensic Science Institutes) CODIS (Combinated DNA Index System) della FBI.

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26 Per rendere il più efficace possibile l’analisi da traccia l’amplificazione delle STR e di una regione del gene dell’amelogenina, che serve per l’identificazione del sesso, viene fatta contemporaneamente.

27 L’allineamento tra il gene dell’amelogenina umana presente sul cromosoma X il gene dell’amelogenina umana presente sul cromosoma Y ha messo in evidenza alcune differenze In particolare c’e una regione lunga 106 pb sull’X 112 pb sull’Y L’amplificazione di questa regione permette di distinguere tra ♀♂ ♀ : se c’è una unica banda da 106 pb ♂ : se ci sono due bande, una da 106 pb e una da 112 pb

28 Per potere distinguere i prodotti di amplificazione delle singole STR i primers (oligonucleotidi) per l’amplificazione sono legati a diverse molecole fluorescenti (generalmente da 3 a 5).

29 Per ovvie ragioni ad una identica molecola fluorescente vengono legati primers che amplificano regioni di diversa dimensione e quindi non confondibili.

30 La ragione dell’uso di primers fluorescenti è legata al fatto che l’analisi degli amplificati viene fatta con un sistema di elettroforesi capillare che consente di distinguere gli amplificati sulla base del colore.

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32 Ar + LASER (488 nm) Sample injection Sample separation Capillary Mixture of dye-labeled PCR product from Multiplex PCR reaction Sample Detection CCD Panel Color Separation ABI Prism spectrograph Fluorescence Il capillare, che contiene una soluzione polimerizzante, è dotato di una finestrella attraverso la quale il laser eccita ad una precisa lunghezza d’onda il campione di DNA marcato con un determinato fluoroforo che ne permette l’identificazione.

33 Le bande, la cui dimensione dipende dal numero di ripetizioni, vengono trasformate in picchi.

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36 Si possono anche utilizzare programmi che trasformano i picchi in numeri

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38 Se confronto profili individuali: NON identità genetica: ESCLUSIONE IDENTITA’ genetica: COMPATIBILITA’

39 Il più importante limite dell’analisi del DNA in criminalistica è rappresentato dai gemelli monozigotici In quest’ultimo caso, viene effettuata un’analisi statistica dei risultati ed infine viene fornita una percentuale di attribuzione che sarà tanto più prossima al 100% quanto maggiore sarà il numero di regioni del DNA analizzate. Generalmente l’analisi da 9 a 15 STR consente di raggiungere una percentuale di attribuzione superiore al 99,9999%.

40 Testi consigliati John M. Butler "Forensic DNA typing: biology and technology behind STR markers". 1a ed ACADEMIC PRESS 2001 N. Rudin and K. Inman, “An introduction to Forensic DNA analysis” Second edition CRC Press 2002

41 Indirizzi web utili ENSFI CODIS DNA e crimine ources_index.html sources.htmlhttp://www.denverda.org/html_website/denver_da/DNA_re sources.html htmhttp://www.ncsl.org/programs/health/genetics/DNAadmiss. htm


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