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TEST RAPIDI IN DIAGNOSI PRENATALE

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Presentazione sul tema: "TEST RAPIDI IN DIAGNOSI PRENATALE"— Transcript della presentazione:

1 TEST RAPIDI IN DIAGNOSI PRENATALE
Francesca Torricelli SOD Diagnostica Genetica Azienda Ospedaliero Universitaria Careggi

2 Le aneuploidie rappresentano oltre il 90% delle anomalie cromosomiche con difetti congeniti

3 Un po’ di storia 1970 : possibilità di diagnosi di S. di Down su liquido amniotico mediante analisi cromosomica 1980: introduzione della FISH per l’identificazione della trisomia 21 su nuclei interfasici di amniociti non coltivati 1993 / 1997: QF-PCR per la diagnosi prenatale di aneuploidie 2002: Multiple ligation-dependent probe amplification (MLPA)

4 Diagnosi Prenatale Classica
Villocentesi Amniocentesi Metodo più usato Dopo la 15 settimana, spesso tra 16/17 Prelievo di 1ml di liquido amniotico per settimana gestazionale Cariotipo dopo coltura di 8-14 giorni 0.5-1% rischio di aborto 0,2% fallimento della coltura rischio di mosaicismo Possibilità di ripetere amniocentesi o sangue funicolare Possibilità di eseguire ITG se il risultato è patologico Si esegue tra settimane Prelievo Biopsia dei villi coriali Cariotipo su preparato diretto, analisi del citotrofoblasto metafasi spontanee, risposta 24 ore Cariotipo su coltura, mesenchima, risposta dopo 8-10 giorni coltura 1% rischio di aborto 1% rischio di mosaicismo placentare Possibilità di ripetere amniocentesi Possibilità di eseguire IVG se il risultato è patologico

5 Prenatal Diagnostic Methods
Quali test rapidi oggi…….. Prenatal Diagnostic Methods 3 metodi FISH QF-PCR MLPA dei test rapidi in uso oggi la FISH si basa sempre sulla citogenetica in quanto utilizza nuclei in interfase di solito da amniociti non coltivati con sonde specifiche e quindi l’analisi e la metodica non è automatizzabile sia per la parte tecnica che manuale QF-PCR e MLPA basandosi su metodiche di PCR permettono di processare piu’ campioni in contemporanea e i risultati sono valutabili dopo analisi su sequenziatori automatici

6 FISH su amniociti non coltivati
La FISH per la diagnosi rapida di aneuploidie in diagnosi prenatale più frequentemente viene applicata ad amniociti non coltivati, anche se è ugualmente applicabile su villo coriale soprattutto nei casi di gravidanze ad alto rischio per aneuploidie quando non sia stato possibile valutare metafasi su campione diretto Si utilizzano generalmente sonde commerciali che riconoscono regioni diverse dei cromosomi in analisi come per esempio per il 21 la regione critica sul braccio lungo

7 FISH in interfase: parametri per l’interpretazione dei segnali
Campioni con oltre il 60% dei nuclei aneuploidi vengono considerati come dotati di un clone anormale Campioni con il 10-60% dei nuclei aneuploidi vengono considerati a mosaico Campioni con nuclei aneuploidi inferiori al 10% sono considerati normali sebbene la presenza di aneuploidie non si possa escludere completamente I risultati del conteggio dei nuclei in interfase vengono riportati come percentuale di nuclei con numero di segnali differenti (1, 2, 3, 4 ) L’interpretazione clinica di qualsiasi risultato deve essere eseguita unitamente all’analisi citogenetica standard

8 Sonde per cromosoma 13 e cromosoma 21
FISH interfasica Sonde per cromosoma e cromosoma 21 Sonde per cromosoma 18 X e Y

9 Accuratezza della FISH in interfase per trisomie 13, 18, 21 e aneuploidie dei cromosomi sessuali
Autori Paese Tipo di studio Tipo di popolazione Numero Analisi fallite o non informative % Sensibilità Specificità FN FP Jalal et al. 1998 USA coorte Alto rischio 310 0.6 100 (44/44) 100 D’Alton et al. 1997 315 19.4 100 (21/21) Aviram-Goldring et al. 1999 Israele 30 100 (7/7) Eiben et al 1999 Germania 3.280 5.7 100 (153/153) Bink et al. 2000 1.126 16 96.4 (27/28) 1 Bryndorf et al. 2000 Danimarca 463 83 (29/35) 2 Feldman et al 2000 301 100 32/32) Marguerat et al. 2000 Svizzera 199 83.3 (5/6) Pergament et al 2000 2.336 100 (87/87) Thilaganathan et al 2000 UK 3.202 0.1 99 (93/94) 99.9 Ulmer et al. 2000 230 5.2 100 (34/34) Cheon Leung et al. 2001 Canada 309 6 100 (50/50) Meyer et al. 2000 244 0.5 94.7 (17/18) Sawa et al. 2001 Giappone 1.525 4.9 100 (76/76) Teppemberg et al. 2001 5.348 2.8 99.6 (570/572) 99.8 Weremowicz et al. 2001 911 3 94 (75/80) 5 Luquet et al. 2002 Francia 2.000 1.6 98.5 (204/207) Locatelli et al. 2005 Italia 48 100 (20/20) Wyandt et al 2006 1.788 ND 98.7 (75/76) La tabella riporta i dati della letteratura relativi alla sensibilità e alla specificità della FISH in interfase per la diagnosi rapida di aneuploidie in diagnosi prenatale. I dati ottenuti da coorti con grandi numeri sono quelli più rappresentativi. La specificità in tutti i dati è compresa tra 99.8% e 100%. La sensibilità ha una certa variazione ma nei lavori con coorti maggiori si aggira tra 98,5 e 100%. Sono riportati un maggior numero di casi falsi negativi rispetto a quelli falsi positivi : NB è importatne valutare un certo numero di cellule dal momento che si lavora in interfase Legenda: FN falsi negativi; FP falsi positivi; ND non disponibile Modificato da: Lisa G.Shaffer and The-Hung Bui, A.J.M.G. 145C:87-98 (2007)

10 QF-PCR Quantitative Fluorescence Polymerase Chain Reaction (QF-PCR) è una tecnica semplice e rapida che consente la diagnosi molecolare delle aneuploidie più comuni (trisomia 21, 13, 18 e aneuploidie dei cromosomi sessuali) Questo tipo di approccio non richiede colture cellulari: la diagnosi può essere completata in 2-3 giorni Il metodo si basa sull'amplificazione di brevi sequenze del DNA che contengono blocchi ripetuti di 2-6 basi (marcatori STRs). Queste sequenze sono specifiche per il cromosoma che si intende analizzare. Usando marcatori per i cromosomi 21, 13, 18, X e Y è possibile diagnosticare le aneuploidie più frequenti.

11 Quantitative fluorescent PCR
QF-PCR Quantitative fluorescent PCR Amplificazione di STR localizzati in differenti regioni del cromosoma 21 mediante PCR Ratio: 1 : : La QF-PCR utilizza DNA estratto da cellule diverse, sia amniociti, che villo coriale, con metodi di estrazione classica o con semplice bollitura (chelex) seguita da una amplificazione multipla ; i kit commerciali utilizzano un numero variabile di microsatelliti per ciascun cromosoma analizzato. Nella diapositiva sono rappresentati schematicamente le due schemi delle trisomia : nel primo caso sono presenti 3 differenti alleli ciascuno con la stessa area e/o altezza del picco, nel secondo caso è presenta una trisomia in forma diallelica con rapporto 1:2 tra i due alleli Ratio: 1 :

12 Trisomia del cromosoma 18
1 : 1 : 1 1 : 2 I marcatori diallelici si considerano trisomici quando il rapporto fra le aree dei due picchi è <0.65 o >1.8

13 Triploidia Cr. 21 1:2 1:1:1 Cr. 18 Cr. 13 2:1 Non inf.

14 Interpretazione della monosomia X e diagnosi della Sindrome di Turner
Criticità del metodo Contaminazione con DNA materno Interpretazione della monosomia X e diagnosi della Sindrome di Turner

15 Assenza del segnale dell’Y
Criticità del metodo Assenza del segnale dell’Y AM XY Cr. X Cr. 7 Cr. 13 2:1 Turner 1:1 XX Sindrome di Turner ? Contaminazione con DNA materno In caso di assenza del segnale del cromosoma Y nei kit che non prevedono il controllo per quantificare le copie dell’X non si può diagnosticare la sindrome di Turner, immagine a sx in alto, dove è presente la copia su cromosoma X dell’amelogenina (AMXY), che è un STS quindi non polimorfico ma fisso con un picco nella femmina e 2 picchi nel mascho, e il locus HPRT sul cromosoma X che è un STR non informativo Nell’immagine in alto a dx è riportato il kit che utilizza come controllo un STS sul cromosoma 7, presente in due copie, con il quale si confronta un STS sul cromosoma X che è in doppia copia, quindi rapporto 7:X 1:1 nella femmina, o in singola copia con rapporto 7:X 2:1 nella sindrome di Turner Contaminazione Sono presneti picchi di intansità minore a piu’ loci di cromosomi diversi come indicato dalle frecce, per parlare di contaminazione materna e non di mosaicismo i loci con extrapicchi devono coinvolgere tutti i quasi i loci, nel caso di una trisomia a mosaico sono presenti extrapicchi solo nei loci del cromosoma che presenta la trisomia a mosaico.

16 N° di Liquidi Amniotici
Accuratezza della QF-PCR per trisomie 13, 18, 21 e aneuploidie dei cromosomi sessuali Cromosoma : N° markers N° di campioni N° di Liquidi Amniotici N° di Sangue Fetale N° di Aborti Sensibilità N° di CVS Verma et al / / / 21: /33 Pertl et al / 247 / / 21: 4 15/15 13: 2 1/1 18: 3 4/5 Levett et al / / / 21: 6 57/57 13: 6 8/8 18: 6 17/17 X:5-Y:2 20/20 Voglino et al : 110/110 13: 15/15 18: 40/40 XY: 25/25 Curcio et al / / 21: 4 26/26 13: 3 2/2 18: 3 8/8 XY: 5 6/6 Cirigliano et al / 21: 6 344/344 13: 4 61/61 18: 5 162/162 XY: 8 224/224 Ogilvie et al / / 21: /333 13: /54 18: /130 XY: 10 36/36 Choueri et al / / / 21: 8 20/20 13: 5 1/1 18: 5 3/3 In tabella sono riportati solo alcuni dei lavori più significativi che hanno applicato la QF-PCR per la diagnosi rapida di aneuploidie. Uno dei dati importanti è che sono riportati anche il numero di markers che sono stati utilizzati per ciascun cromosoma. La sensibilità è praticamente del 100% Alcuni non hanno analizzato i cromosomi sessuali Praticamente l’applicazione principale è stata su amniociti non coltivati Modificato da: Lisa G.Shaffer and The-Hung Bui, A.J.M.G. 145C:87-98 (2007)

17 MLPA Mulptiple ligation-dependent probe amplification
Esistino kit commerciali per la diagnosi rapida di aneuploidie con MLPA Non necessita di informatività dei markers usati perché quantifica i segmenti analizzati Presenta le stesse limitazioni della QF-PCR Non evidenzia contaminazione materna Non permette di diagnosticare triploidie

18 MLPA In letterarutura il primo lavoro per la ricerca rapida di aneuploidie con MLPA risale al Questo metodo è stato utilizzato anche da uno dei partecipanti al controllo qualità

19 Rischio residuo per anomalia cromosomica dopo FISH in interfase o QF-PCR
Discordanti Falsi Negativi Discordanti Autori Paese Totale Normali concordanti Anormali concordanti S ND NS FP Evans et al. 1999 USA,UK, svizzera, svezia 2.889 / 1.274 Thilaganathan et al 2000 UK 3.200 3.088 93 5 13 1(0.03%) Thein et al. 2000 1.687 1.576 97 7 Lewin et al. 2000 Francia 27.407 26.268 818 99 222 Ryall et al. 2001 Australia 3.380 3.251 104 6 19 Cheong et al 2001 Canada 294 234 50 9 1 Witters et al. 2002 Belgio 5.036 4.853 125 49 Leung eta l. 2003 Hong kong 1.526 1.461 61 2 Homer et al. 2003 USA 21.609 20.860 524 145 80 Grimshaw eta l. 2003 3.764 3.666 86 12 Leung et al. 2004 1.548 1.466 60 Cirigliano et al. 2004 Spagna, Italia 17.917 17.129 732 56 (96.7%) 5.639 (2.4%) 2.039 (0.9%) 1 (0%) Totale S e NS 295 (0.4%) 402 (0.6%) I totali riportati sono calcolati su i numeri della colonna Legenda: S clinicamente significativo; NS clinicamente non significativo ND non disponibile; FP falsi positivi Modificato da: Lisa G.Shaffer and The-Hung Bui, A.J.M.G. 145C:87-98 (2007)

20 Test rapidi in diagnosi prenatale
Vantaggi Svantaggi Tempi rapidi di risposta Risultato entro 2-3 giorni Il rischio di falsi positivi e falsi negativi riportato in letteratura è basso E’ necessario poco materiale di partenza QF-PCR è meno costosa e laboriosa della FISH e della citogenetica classica QF-PCR può essere automatizzata La QF-PCR può essere eseguita anche se nel campione è presente una certa contaminazione da sangue materno Identificano solo le aneuploidie dei cromosomi in analisi Non è in grado di diagnosticare traslocazioni e delezioni La contaminazione con DNA materno può rappresentare un problema La presenza di mosaicismo fetale è un problema La FISH non si può eseguire se è presente una piccola contaminazione da sangue materno

21 Linee guida 7. QF-PCR FOR RAPID PRENATAL DIAGNOSIS OF ANEUPLOIDY This technique is a useful adjunct to prenatal diagnosis and is a more appropriate technique than FISH when dealing with large numbers of prenatal referrals. Internal validation is essential before using this technique. Close liaison with Molecular Genetics colleagues is necessary to establish this technique in a cytogenetic laboratory. The limitations of QF-PCR in identifying chromosome abnormalities must be clearly known. It is recommended that testing for trisomies 13, 18 and 21 is carried out, whilst it is acceptable to test for sex chromosome aneuploidy in only a subset of referrals. QF-PCR analysis provides information only about the probe locus in question. It does not substitute for a complete chromosome analysis.

22 For amniotic fluid, between 0
For amniotic fluid, between 0.5 and 4 ml or 1/10 of the sample is recommended for QF-PCR analysis, …………… For chorionic villus samples, it is recommended that at least two chorionic villi taken from different regions of the biopsy should be processed to minimise the risk of misdiagnosis due to confined placental mosaicism………….. A chelex-based method is recommended for DNA preparation as this does not require any tube-tube transfers…………

23 7.3 ANALYSIS It is recommended that both the electrophoretogram and peak measurements,………………….. To interpret a result as abnormal, at least two informative marker results should be consistent with a triallelic genotype, with all the other markers uninformative. It is unacceptable to interpret a result as abnormal if shown by only one marker. Confirmation of sample identity when a result is abnormal by repeat PCR of the DNA, re-extraction of samples, or maternal blood analysis is recommended. ………………… To interpret a result as normal at least two informative marker results consistent with a normal diallelic pattern are required, with all other markers uninformative. 7.4 REPORTING ….. report normal QF-PCR results as ‘consistent with a normal diploid complement for chromosomes 13, 18 and 21’, ‘an apparently normal complement of chromosomes 13, 18 and 21 was detected’, ‘no evidence of trisomy’ or similar statement……… Abnormal reports should include an interpretative statement such as ‘consistent with Down syndrome’, ‘associated with Down syndrome’, ‘indicative of Down syndrome’ or ‘predicted to be affected with Down syndrome’.

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25 7.1 Blood-stained Amniotic Fluid Sample
It is acceptable to process all blood-stained samples, though care must be taken when interpreting the results as the blood may be fetal or maternal in origin. Levels of blood-staining in the cell pellet may also correlate with the level of the maternal genotype, though this should be carefully validated before being applied to interpret results. ……………….. The presence of two genotypes in DNA from bloodstained samples is consistent with maternal cell contamination. Results from bloodstained samples can be divided into three categories; ……………………… 7.2 Chorionic Villus samples Maternal material may be present in CVS material prepared for QF-PCR analysis if the sample is of poor quality and/or the removal of maternal decidua is incomplete. Maternal cell contamination in CVS of reasonable quality is generally avoidable and may compromise the QF-PCR and/or karyotype results; every effort should be made to consistently remove all maternal decidua from CVS.

26 8 MOSAICISM Mosaicism for trisomy and normal cell lines can be detected by QF-PCR analysis, evident as extra peaks and skewed allele ratios on a chromosome-specific group of markers. These results may be subtle; skewed allele ratios representing the mosaic chromosome may remain in the normal or abnormal ranges (i.e. ratios may all be borderline inconclusive or where the greater area/height is noted to be associated with the larger allele)……………………. If the QF-PCR result can be confidently interpreted the mosaic result should be reported, although the clinical significance of a mosaic result should be carefully considered in the report. …………………….. Rare completely discrepant QF-PCR and karyotype results due to placental mosaicism in CVS have been reported ………………………..

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28 Linee guida per la diagnosi citogenetica
Consensus 2007 Sociatà Italiana di Genentica Umana 6.6 identificzione rapida di aneuploidie 6.6.1 FISH Interfasica per l’aalisi delle aneuploidie dei cromosomi 13,18,21,X,Y .. può essere utilizzata per la ricerca rapida delle principali aneuploidie, il risultato è disponibile in ore…….. Può essere utilizzata su trofoblasto nel caso in cui siano assenti metafasi o per estendere l’analisi di un caso di mosaicismo. Questa indagine non costituisce un’alternativa all’analisi completa del cariotipo, ma è un test integrativo, preliminare e parzialeche può essere utile quando viene richiesta una diagnosi specifica urgente. 6.6.1 FISH Interfasica per l’aalisi delle aneuploidie dei cromosomi 13,18,21,X,Y .. può essere utilizzata per la ricerca rapida delle principali aneuploidie, il risultato è disponibile in ore…….. Può essere utilizzata su trofoblasto nel caso in cui siano assenti metafasi o per estendere l’analisi di un caso di mosaicismo. Questa indagine non costituisce un’alternativa all’analisi completa del cariotipo, ma è un test integrativo, preliminare e parzialeche può essere utile quando viene richiesta una diagnosi specifica urgente. PCR Quantitativa florescente (QF-PCR) ……………..fornisce informazioni limitate ai “sequence tagget site” (STS) utilizzati e che per la definizione dell’assetto cromosomico deve essere associata alla citogenetica convenzionale ….. È necessaria una quantità di liquido amnioticotra 0,5 e 4ml, mentre nel trofoblasto si raccomanda di eseguire l’estrazione di DNA da almeno due frammenti di villo coriale per limitare il rischio di errori diagnostici correlati ai mosaicismi confinati alla palcenta

29 Linee guida per la diagnosi citogenetica
Consensus 2007 Sociatà Italiana di Genentica Umana 6.6 identificzione rapida di aneuploidie 6.6.3 Multiple Ligation Probe-dependent Assay (MLPA) …… è una tecnica rapida e relativamente economica che permette di quantificare il numero di copie di oltre 45 sequenze di DNA in un’unica reazione di PCR……………………….. …………… sono sufficienti 20ng di DNA……….. …….è in gradi di discriminare anche una singola copia di DNA…………. Può firnire una diagnosi rapida delle aneuploidie , ma deve sempre essere associata alla diagnosi citogentica tradizionale

30 National Genetics Reference Laboratory (Manchester),UK ,
External quality assessment of rapid prenatal detection of numerical chromosomal aberrations using molecular genetic techniques: 3 years experience. Prenat Diagn May;27(5): Ramsden SC, Mann K, McConnell C, Hastings R. National Genetics Reference Laboratory (Manchester),UK , Nel regno unito la QF-PCR è il metodo più utilizzato per la diagnosi rapida di aneuploidie, inoltre presenta minori costi e miglior gestione dei campioni rispetto alla FISH in quanto permette di analizzare contemporaneamente molti campioni La diagnosi prenatale di malattie genetiche richiede metodi accurati e robusti, in qunato le procedure invsive hanno un aumentato rischio di aborto e una risposta positiva per diagnosi prenatale generalmente induce la coppia ad interrompere la gravidanza L’aumento della richiesta determina la necessità per i laboratori che eseguono tali indagini di vere elevati standard di qualità e di partecipare a controlli esterni di qualità

31 Tutti i report di risposta sono anonimi
External quality assessment of rapid prenatal detection of numerical chromosomal aberrations using molecular genetic techniques: 3 years experience. Prenat Diagn May;27(5):404-8 5 campioni inviati ai partecipanti per anno, costituiti da DNA estratto da amniociti non coltivati e da villo coriale I partecipanti devono genotipizzare i campioni con i metodi utilizzati di routine e inviare i risultati con i form di risposta utilizzaticon l’iterpretazione completa del risultato Tutti i report di risposta sono anonimi Nel 2004 è stata valutata l’accuratezza della genotipizzazione, nel 2005 e 2006 la valutazionedei risultati è stata fatta in base alla linee guida : Da questa tabella emerge come con il passare deglòi anni la QF PCR sia entrata nella routine della maggior parte delle stutture europea ad eccezione dell’italia dove la citogenetica classica rimane tutt’ora il mezzo d’elezione per la diagnosi prenatale.

32 Fallimenti tecnici 4/265 (1.5%)
External quality assessment of rapid prenatal detection of numerical chromosomal aberrations using molecular genetic techniques: 3 years experience. Prenat Diagn May;27(5):404-8 Risultati Fallimenti tecnici 4/265 (1.5%) Errori di genotipizzazione 1/265 (0.4%) relativo al 2006 non è stato identificato il mosaicismo della trisomia 18 Commenti Aumento di partecipazione negli anni Basso il numero di fallimenti tecnici e il numero di errori di genotipizzazione Completa interpretazione del risultato da parte del laboratorista, in quanto il clinico di riferimento, vista la specificità del dato può non essere in grado di interpretare correttamente l’aspetto tecnico EQA valuta sia gli errori di genotipizzazione che la qualità d’interpretazione del dato clinico Per quanto riguarda i risultati trisomici devono essere indicati

33 External quality assessment of rapid prenatal detection of numerical chromosomal aberrations using molecular genetic techniques: 3 years experience. Prenat Diagn May;27(5):404-8 I casi trisomici sono stati tutti caratterizzati , nel referto in questo caso è necessario indicare npn solo i markers trisomici ma anche tutti gli altri CASI CON MCC: esuste differenza tra fallimento del risultato e mancata interpretazione per la presenza di 2 differenti genotipi; la presenza di due genotipi distinti può indicare raramente un gemellare, o un chimerismo, in questi casi la ripetizione del test è utilie; sono necessarie anche informazioni clincihe precise relative al acmpione analizzato. 45,X: è essenziale descrivere anche gli altri markers utilizzati e associare il risultato alle informazioni cliniche MOSAICO su CVS: si evidenzia una chiara difficoltà di interpretare il risultato, in questo caso è necessario indicare di eseguire un follow up sulla coltura a lungo termine

34 EQA (external quality assessment)
External quality assessment of rapid prenatal detection of numerical chromosomal aberrations using molecular genetic techniques: 3 years experience. Prenat Diagn May;27(5): National Genetics Reference Laboratory (Manchester),UK , Schema pilota di EQA per la diagnosi rapida di aneuploidie, inizialmente per i laboratori del Regno Unito e successivamente esteso a tutta Europa EQA (external quality assessment) Monitorare la qualità del test eseguito Migliorare la qualità del test eseguito Nel regno unito la QF-PCR è il metodo più utilizzato per la diagnosi rapida di aneuploidie, inoltre presenta minori costi e miglior gestione dei campioni rispetto alla FISH in quanto permette di analizzare contemporaneamente molti campioni La diagnosi prenatale di malattie genetiche richiede metodi accurati e robusti, in qunato le procedure invsive hanno un aumentato rischio di aborto e una risposta positiva per diagnosi prenatale generalmente induce la coppia ad interrompere la gravidanza L’aumento della richiesta determina la necessità per i laboratori che eseguono tali indagini di vere elevati standard di qualità e di partecipare a controlli esterni di qualità I fallimenti tecnici in totale sono stati 4/265 La partecipazione dei laboratori a EQA è essenziale per l’accreditamento dei laboratori in base ai criteri ISO15189


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