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TEST RAPIDI IN DIAGNOSI PRENATALE SOD Diagnostica Genetica Azienda Ospedaliero Universitaria Careggi Francesca Torricelli www.ao-careggi.toscana.it/citogenetica.

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1 TEST RAPIDI IN DIAGNOSI PRENATALE SOD Diagnostica Genetica Azienda Ospedaliero Universitaria Careggi Francesca Torricelli

2 Le aneuploidie rappresentano oltre il 90% delle anomalie cromosomiche con difetti congeniti

3 Un po’ di storia 1970 : possibilità di diagnosi di S. di Down su liquido amniotico mediante analisi cromosomica 1980: introduzione della FISH per l’identificazione della trisomia 21 su nuclei interfasici di amniociti non coltivati 1993 / 1997: QF-PCR per la diagnosi prenatale di aneuploidie 2002: Multiple ligation-dependent probe amplification (MLPA)

4 Diagnosi Prenatale Classica Villocentesi Metodo più usato Dopo la 15 settimana, spesso tra 16/17 Prelievo di 1ml di liquido amniotico per settimana gestazionale Cariotipo dopo coltura di 8-14 giorni 0.5-1% rischio di aborto 0,2% fallimento della coltura rischio di mosaicismo Possibilità di ripetere amniocentesi o sangue funicolare Possibilità di eseguire ITG se il risultato è patologico Amniocentesi Si esegue tra settimane Prelievo Biopsia dei villi coriali Cariotipo su preparato diretto, analisi del citotrofoblasto metafasi spontanee, risposta 24 ore Cariotipo su coltura, mesenchima, risposta dopo 8-10 giorni coltura 1% rischio di aborto 1% rischio di mosaicismo placentare Possibilità di ripetere amniocentesi Possibilità di eseguire IVG se il risultato è patologico

5 Prenatal Diagnostic Methods FISH QF-PCR MLPA Quali test rapidi oggi…….. 3 metodi

6 FISH su amniociti non coltivati

7 L’interpretazione clinica di qualsiasi risultato deve essere eseguita unitamente all’analisi citogenetica standard Campioni con nuclei aneuploidi inferiori al 10% sono considerati normali sebbene la presenza di aneuploidie non si possa escludere completamente Campioni con il 10-60% dei nuclei aneuploidi vengono considerati a mosaico Campioni con oltre il 60% dei nuclei aneuploidi vengono considerati come dotati di un clone anormale FISH in interfase: parametri per l’interpretazione dei segnali

8 FISH interfasica Sonde per cromosoma 13 e cromosoma 21 Sonde per cromosoma 18 X e Y

9 AutoriPaese Tipo di studio Tipo di popolazione Numero Analisi fallite o non informative % SensibilitàSpecificitàFNFP Jalal et al. 1998USAcoorteAlto rischio (44/44)10000 D’Alton et al. 1997USAcoorteAlto rischio (21/21)10000 Aviram-Goldring et al. 1999IsraelecoorteAlto rischio (7/7)10000 Eiben et al 1999GermaniacoorteAlto rischio (153/153)10000 Bink et al. 2000GermaniacoorteAlto rischio (27/28)10010 Bryndorf et al. 2000DanimarcacoorteAlto rischio (29/35)10020 Feldman et al 2000USAcoorteAlto rischio /32)10000 Marguerat et al. 2000SvizzeracoorteAlto rischio (5/6)10010 Pergament et al 2000USAcoorteAlto rischio (87/87)10000 Thilaganathan et al 2000UKcoorteAlto rischio (93/94) Ulmer et al. 2000GermaniacoorteAlto rischio (34/34)10000 Cheon Leung et al. 2001CanadacoorteAlto rischio (50/50)10000 Meyer et al. 2000USAcoorteAlto rischio (17/18)10010 Sawa et al. 2001GiapponecoorteAlto rischio (76/76)10000 Teppemberg et al. 2001USAcoorteAlto rischio (570/572) Weremowicz et al. 2001USAcoorteAlto rischio (75/80)10051 Luquet et al. 2002FranciacoorteAlto rischio (204/207) Locatelli et al. 2005ItaliacoorteAlto rischio (20/20)10000 Wyandt et al 2006USAcoorteAlto rischio1.788ND98.7 (75/76)10010 Legenda: FN falsi negativi; FP falsi positivi; ND non disponibile Accuratezza della FISH in interfase per trisomie 13, 18, 21 e aneuploidie dei cromosomi sessuali Modificato da: Lisa G.Shaffer and The-Hung Bui, A.J.M.G. 145C:87-98 (2007)

10 Quantitative Fluorescence Polymerase Chain Reaction (QF-PCR) è una tecnica semplice e rapida che consente la diagnosi molecolare delle aneuploidie più comuni (trisomia 21, 13, 18 e aneuploidie dei cromosomi sessuali) Questo tipo di approccio non richiede colture cellulari: la diagnosi può essere completata in 2-3 giorni QF-PCR Il metodo si basa sull'amplificazione di brevi sequenze del DNA che contengono blocchi ripetuti di 2-6 basi (marcatori STRs). Queste sequenze sono specifiche per il cromosoma che si intende analizzare. Usando marcatori per i cromosomi 21, 13, 18, X e Y è possibile diagnosticare le aneuploidie più frequenti.

11 QF-PCR Quantitative fluorescent PCR Ratio: 1 : 1 : 1 Amplificazione di STR localizzati in differenti regioni del cromosoma 21 mediante PCR Ratio: 1 : 2

12 Trisomia del cromosoma 18 I marcatori diallelici si considerano trisomici quando il rapporto fra le aree dei due picchi è : 1 : 1 1 : 2

13 Triploidia Cr. 21 1:2 Cr. 21 1:1:1 Cr. 18 1:1:1 Cr. 13 1:2 Cr. 21 2:1 Cr. 18 2:1 Cr. 13 2:1 Cr. 18 1:1:1 Cr. 13 1:2 Cr. 18 1:2 Cr. 21 1:2 Cr. 18 1:1:1 Cr. 13 Non inf.

14 Criticità del metodo Contaminazione con DNA materno Interpretazione della monosomia X e diagnosi della Sindrome di Turner

15 Criticità del metodo Sindrome di Turner ? Contaminazione con DNA materno AM XY Cr. X Cr. 7 Cr. 13 Cr. X Cr. 13 Cr. X Cr. 7 2:1 Turner Cr. XCr. 7 1:1 XX Assenza del segnale dell’Y

16 Verma et al ///21: 2-332/33 Pertl et al /247//21: 415/15 13: 21/1 18: 34/5 Levett et al ///21: 657/57 13: 68/8 18: 617/17 X:5-Y:220/20 Voglino et al : 110/110 13: 15/15 18: 40/40 XY: 25/25 Curcio et al //21: 426/26 13: 32/2 18: 38/8 XY: 56/6 Cirigliano et al /21: 6344/344 13: 461/61 18: 5162/162 XY: 8224/224 Ogilvie et al //21: /333 13: 2-454/54 18: /130 XY: 1036/36 Choueri et al ///21: 820/20 13: 51/1 18: 53/3 N° di campioni N° di Liquidi Amniotici N° di CVS N° di Sangue Fetale N° di Aborti Cromosoma : N° markers Sensibilità Accuratezza della QF-PCR per trisomie 13, 18, 21 e aneuploidie dei cromosomi sessuali Modificato da: Lisa G.Shaffer and The-Hung Bui, A.J.M.G. 145C:87-98 (2007)

17 MLPA Mulptiple ligation-dependent probe amplification Esistino kit commerciali per la diagnosi rapida di aneuploidie con MLPA Non necessita di informatività dei markers usati perché quantifica i segmenti analizzati Presenta le stesse limitazioni della QF-PCR Non evidenzia contaminazione materna Non permette di diagnosticare triploidie

18 MLPA

19 AutoriPaeseTotale Normali concordan ti Anormali concordanti SNDNSFP Evans et al USA,UK, svizzera, svezia /1.274/0 Thilaganathan et al 2000UK /131(0.03%) Thein et al. 2000UK /70 Lewin et al. 2000Francia /2220 Ryall et al. 2001Australia /190 Cheong et al 2001Canada /10 Witters et al. 2002Belgio /490 Leung eta l. 2003Hong kong /20 Homer et al. 2003USA /800 Grimshaw eta l. 2003UK /12/0 Leung et al. 2004UK /90 Cirigliano et al Spagna, Italia /56// Totale (96.7%) (2.4%) (0.9%) 1 (0%) Totale S e NS295 (0.4%) 402 (0.6%) Modificato da: Lisa G.Shaffer and The-Hung Bui, A.J.M.G. 145C:87-98 (2007) Legenda: S clinicamente significativo; NS clinicamente non significativo ND non disponibile; FP falsi positivi Discordanti Falsi Negativi Rischio residuo per anomalia cromosomica dopo FISH in interfase o QF-PCR

20 Test rapidi in diagnosi prenatale Identificano solo le aneuploidie dei cromosomi in analisi Non è in grado di diagnosticare traslocazioni e delezioni La contaminazione con DNA materno può rappresentare un problema La presenza di mosaicismo fetale è un problema La FISH non si può eseguire se è presente una piccola contaminazione da sangue materno SvantaggiVantaggi Tempi rapidi di risposta Risultato entro 2-3 giorni Il rischio di falsi positivi e falsi negativi riportato in letteratura è basso E’ necessario poco materiale di partenza QF-PCR è meno costosa e laboriosa della FISH e della citogenetica classica QF-PCR può essere automatizzata La QF-PCR può essere eseguita anche se nel campione è presente una certa contaminazione da sangue materno

21 Linee guida 7. QF-PCR FOR RAPID PRENATAL DIAGNOSIS OF ANEUPLOIDY This technique is a useful adjunct to prenatal diagnosis and is a more appropriate technique than FISH when dealing with large numbers of prenatal referrals. Internal validation is essential before using this technique. Close liaison with Molecular Genetics colleagues is necessary to establish this technique in a cytogenetic laboratory. The limitations of QF-PCR in identifying chromosome abnormalities must be clearly known. It is recommended that testing for trisomies 13, 18 and 21 is carried out, whilst it is acceptable to test for sex chromosome aneuploidy in only a subset of referrals. QF-PCR analysis provides information only about the probe locus in question. It does not substitute for a complete chromosome analysis.

22 For amniotic fluid, between 0.5 and 4 ml or 1/10 of the sample is recommended for QF-PCR analysis, …………… For chorionic villus samples, it is recommended that at least two chorionic villi taken from different regions of the biopsy should be processed to minimise the risk of misdiagnosis due to confined placental mosaicism………….. A chelex-based method is recommended for DNA preparation as this does not require any tube-tube transfers …………

23 7.3 ANALYSIS It is recommended that both the electrophoretogram and peak measurements,………………….. To interpret a result as abnormal, at least two informative marker results should be consistent with a triallelic genotype, with all the other markers uninformative. It is unacceptable to interpret a result as abnormal if shown by only one marker. Confirmation of sample identity when a result is abnormal by repeat PCR of the DNA, re-extraction of samples, or maternal blood analysis is recommended. ………………… To interpret a result as normal at least two informative marker results consistent with a normal diallelic pattern are required, with all other markers uninformative. 7.4 REPORTING ….. report normal QF-PCR results as ‘consistent with a normal diploid complement for chromosomes 13, 18 and 21’, ‘an apparently normal complement of chromosomes 13, 18 and 21 was detected’, ‘no evidence of trisomy’ or similar statement……… Abnormal reports should include an interpretative statement such as ‘consistent with Down syndrome’, ‘associated with Down syndrome’, ‘indicative of Down syndrome’ or ‘predicted to be affected with Down syndrome’.

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25 7.1 Blood-stained Amniotic Fluid Sample It is acceptable to process all blood-stained samples, though care must be taken when interpreting the results as the blood may be fetal or maternal in origin. Levels of blood- staining in the cell pellet may also correlate with the level of the maternal genotype, though this should be carefully validated before being applied to interpret results. ……………….. The presence of two genotypes in DNA from bloodstained samples is consistent with maternal cell contamination. Results from bloodstained samples can be divided into three categories; ……………………… 7.2 Chorionic Villus samples Maternal material may be present in CVS material prepared for QF-PCR analysis if the sample is of poor quality and/or the removal of maternal decidua is incomplete. Maternal cell contamination in CVS of reasonable quality is generally avoidable and may compromise the QF-PCR and/or karyotype results; every effort should be made to consistently remove all maternal decidua from CVS.

26 8 MOSAICISM Mosaicism for trisomy and normal cell lines can be detected by QF-PCR analysis, evident as extra peaks and skewed allele ratios on a chromosome-specific group of markers. These results may be subtle; skewed allele ratios representing the mosaic chromosome may remain in the normal or abnormal ranges (i.e. ratios may all be borderline inconclusive or where the greater area/height is noted to be associated with the larger allele)……………………. If the QF-PCR result can be confidently interpreted the mosaic result should be reported, although the clinical significance of a mosaic result should be carefully considered in the report. …………………….. Rare completely discrepant QF-PCR and karyotype results due to placental mosaicism in CVS have been reported ………………………..

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28 Linee guida per la diagnosi citogenetica Consensus 2007 Sociatà Italiana di Genentica Umana FISH Interfasica per l’aalisi delle aneuploidie dei cromosomi 13,18,21,X,Y.. può essere utilizzata per la ricerca rapida delle principali aneuploidie, il risultato è disponibile in ore…….. Può essere utilizzata su trofoblasto nel caso in cui siano assenti metafasi o per estendere l’analisi di un caso di mosaicismo. Questa indagine non costituisce un’alternativa all’analisi completa del cariotipo, ma è un test integrativo, preliminare e parzialeche può essere utile quando viene richiesta una diagnosi specifica urgente. 6.6 identificzione rapida di aneuploidie FISH Interfasica per l’aalisi delle aneuploidie dei cromosomi 13,18,21,X,Y.. può essere utilizzata per la ricerca rapida delle principali aneuploidie, il risultato è disponibile in ore…….. Può essere utilizzata su trofoblasto nel caso in cui siano assenti metafasi o per estendere l’analisi di un caso di mosaicismo. Questa indagine non costituisce un’alternativa all’analisi completa del cariotipo, ma è un test integrativo, preliminare e parzialeche può essere utile quando viene richiesta una diagnosi specifica urgente PCR Quantitativa florescente (QF-PCR) ……………..fornisce informazioni limitate ai “sequence tagget site” (STS) utilizzati e che per la definizione dell’assetto cromosomico deve essere associata alla citogenetica convenzionale ….. È necessaria una quantità di liquido amnioticotra 0,5 e 4ml, mentre nel trofoblasto si raccomanda di eseguire l’estrazione di DNA da almeno due frammenti di villo coriale per limitare il rischio di errori diagnostici correlati ai mosaicismi confinati alla palcenta

29 Linee guida per la diagnosi citogenetica Consensus 2007 Sociatà Italiana di Genentica Umana 6.6 identificzione rapida di aneuploidie Multiple Ligation Probe-dependent Assay (MLPA) …… è una tecnica rapida e relativamente economica che permette di quantificare il numero di copie di oltre 45 sequenze di DNA in un’unica reazione di PCR……………………….. …………… sono sufficienti 20ng di DNA……….. …….è in gradi di discriminare anche una singola copia di DNA…………. Può firnire una diagnosi rapida delle aneuploidie, ma deve sempre essere associata alla diagnosi citogentica tradizionale

30 External quality assessment of rapid prenatal detection of numerical chromosomal aberrations using molecular genetic techniques: 3 years experience. Prenat Diagn May;27(5): Ramsden SC, Mann K, McConnell C, Hastings R. National Genetics Reference Laboratory (Manchester),UK,

31 External quality assessment of rapid prenatal detection of numerical chromosomal aberrations using molecular genetic techniques: 3 years experience. Prenat Diagn May;27(5): campioni inviati ai partecipanti per anno, costituiti da DNA estratto da amniociti non coltivati e da villo coriale I partecipanti devono genotipizzare i campioni con i metodi utilizzati di routine e inviare i risultati con i form di risposta utilizzaticon l’iterpretazione completa del risultato Tutti i report di risposta sono anonimi Nel 2004 è stata valutata l’accuratezza della genotipizzazione, nel 2005 e 2006 la valutazionedei risultati è stata fatta in base alla linee guida :

32 External quality assessment of rapid prenatal detection of numerical chromosomal aberrations using molecular genetic techniques: 3 years experience. Prenat Diagn May;27(5):404-8 Fallimenti tecnici 4/265 (1.5%) Errori di genotipizzazione 1/265 (0.4%) relativo al 2006 non è stato identificato il mosaicismo della trisomia 18 Risultati Commenti Aumento di partecipazione negli anni Basso il numero di fallimenti tecnici e il numero di errori di genotipizzazione Completa interpretazione del risultato da parte del laboratorista, in quanto il clinico di riferimento, vista la specificità del dato può non essere in grado di interpretare correttamente l’aspetto tecnico EQA valuta sia gli errori di genotipizzazione che la qualità d’interpretazione del dato clinico

33 External quality assessment of rapid prenatal detection of numerical chromosomal aberrations using molecular genetic techniques: 3 years experience. Prenat Diagn May;27(5):404-8

34 External quality assessment of rapid prenatal detection of numerical chromosomal aberrations using molecular genetic techniques: 3 years experience. Prenat Diagn May;27(5): National Genetics Reference Laboratory (Manchester),UK, EQA (external quality assessment) Monitorare la qualità del test eseguito Migliorare la qualità del test eseguito La partecipazione dei laboratori a EQA è essenziale per l’accreditamento dei laboratori in base ai criteri ISO15189 Schema pilota di EQA per la diagnosi rapida di aneuploidie, inizialmente per i laboratori del Regno Unito e successivamente esteso a tutta Europa


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